免疫沉淀類試驗(yàn)——免疫比濁

1、沉淀反應(yīng)（precipitation） 可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的的沉淀現(xiàn)象沉淀現(xiàn)象。分類分類液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測定免疫濁度測定凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)免疫擴(kuò)散免疫擴(kuò)散免疫電泳免疫電泳單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)火箭免疫電泳火箭免疫電泳對流免疫電泳對流免疫電泳沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫濁度測定免疫濁度測定概念：將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動化分析概念：將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動化分析 檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，可以檢測系

2、統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，可以對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測定。測定。（一）免疫濁度分析的基本原理： 抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物小分子免疫復(fù)合物(19S)，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在在抗體稍微過量且固定的情況下抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量增加而增加，復(fù)合物量隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶

3、液的濁度呈正相關(guān)。用一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品同呈正相關(guān)。用一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行試驗(yàn)，制備劑量反應(yīng)曲線，即可計算出時進(jìn)行試驗(yàn)，制備劑量反應(yīng)曲線，即可計算出標(biāo)本中抗原的含量標(biāo)本中抗原的含量（二）類型1. 透射免疫比濁法 通過檢測光被吸收、衍射、反射和折射后光通過檢測光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化來衡量抗原抗體的復(fù)合物線減弱的變化來衡量抗原抗體的復(fù)合物。2、散射免疫比濁法 通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強(qiáng)度通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強(qiáng)度來定量抗原抗體的復(fù)合物。來定量抗原抗體的復(fù)合物。3、免疫膠乳比濁法 以膠乳作為載體對小分子免疫復(fù)合物進(jìn)行微以膠乳作為載體對小分

4、子免疫復(fù)合物進(jìn)行微量測定，進(jìn)一步提高了免疫濁度測定的靈敏量測定，進(jìn)一步提高了免疫濁度測定的靈敏度度。 1 透射免疫比濁法原理：原理： 可溶性抗原抗體在一定緩沖液中發(fā)生反可溶性抗原抗體在一定緩沖液中發(fā)生反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變，應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變，光線通過抗原抗體反應(yīng)的溶液時，被其中的免光線通過抗原抗體反應(yīng)的溶液時，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收，在疫復(fù)合物微粒吸收，在保持抗體過量保持抗體過量的情況下，的情況下，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，光線被吸收免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，光線被吸收越多，用吸光度來表示。即吸光度與免疫復(fù)合越多，用吸光度來表示。即吸光度

5、與免疫復(fù)合物量物量呈正相關(guān)呈正相關(guān)。可用抗原標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，?？捎每乖瓨?biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出待檢抗原含量。測出待檢抗原含量。 由于免疫復(fù)合物顆粒大小再由于免疫復(fù)合物顆粒大小再35-100nm，對近紫外的光線可見最大，對近紫外的光線可見最大吸收峰，故選擇吸收峰，故選擇290-410nm波長測波長測定最佳，目前多用定最佳，目前多用340nm方法評價：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度比單擴(kuò)法高靈敏度比單擴(kuò)法高510倍；倍； 操作簡便快速，操作簡便快速，1h可報可報告結(jié)果；告結(jié)果；結(jié)果準(zhǔn)確，且能用全自動結(jié)果準(zhǔn)確，且能用全自動化或半全自動化儀器進(jìn)化或半全自動化儀器進(jìn)行分析，尤其隨著膠乳行分析，尤其隨著膠乳粒子

6、增強(qiáng)濁度測定法的粒子增強(qiáng)濁度測定法的出現(xiàn)，使敏感度提高，出現(xiàn)，使敏感度提高，其應(yīng)用更加廣泛。其應(yīng)用更加廣泛。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：抗體用量較大；抗體用量較大；檢測需抗原抗體反應(yīng)檢測需抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，耗時較長；達(dá)到平衡，耗時較長；溶液中存在的抗原抗溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大。大。靈敏度較散射比濁法靈敏度較散射比濁法低。低。2 散射免疫比濁法原理：原理： 散射光散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到溶液中的免疫復(fù)合物，對光線產(chǎn)生反射和碰到溶液中的免疫復(fù)合物，對光線產(chǎn)生反射和折射而形成的。散射濁度法是在入射光的一定折射而形成的。散射濁度法是在

7、入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量呈正比，復(fù)合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成即待測抗原越多，形成復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)。又可分為復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)。又可分為速率速率散射比濁法散射比濁法(rate nephelometry)(rate nephelometry)和和終點(diǎn)散射比終點(diǎn)散射比濁法濁法(endpoint nephelometry(endpoint nephelometry) )。3 免疫膠乳比濁法原理原理 是一種帶載體的免疫比濁法，用抗體致敏的大是一種帶載體的免疫比濁法，用抗體致敏的大小適中，均勻一致

8、的膠乳顆粒（一般是小適中，均勻一致的膠乳顆粒（一般是0.2m0.2m），），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上抗體與抗原特異在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上抗體與抗原特異性結(jié)合，引起膠乳顆粒凝集。分散的單個膠乳顆性結(jié)合，引起膠乳顆粒凝集。分散的單個膠乳顆粒直徑位于入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當(dāng)粒直徑位于入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當(dāng)2 2個個或或2 2個以上膠乳凝集時，則使透過光減弱或散射光個以上膠乳凝集時，則使透過光減弱或散射光增強(qiáng)。這種減少或增強(qiáng)的程度與膠乳凝集成正比，增強(qiáng)。這種減少或增強(qiáng)的程度與膠乳凝集成正比，與抗原濃度呈正相關(guān)。與抗原濃度呈正相關(guān)。（a a）帶抗體的膠乳在波長之內(nèi)可透過光線；）帶

9、抗體的膠乳在波長之內(nèi)可透過光線；（b b）結(jié)合后，則形成光線衰減）結(jié)合后，則形成光線衰減方法評價1 1、敏感度高，可達(dá)到、敏感度高，可達(dá)到ngng/L/L水平水平2 2、操作簡單，容易自動化、操作簡單，容易自動化3 3、結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需、結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計、自特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。用。 (三)、主要影響因素1.抗原抗體比例抗原抗體比例2.抗體的質(zhì)量抗體的質(zhì)量3.抗原抗體反應(yīng)的溶液抗原抗體反應(yīng)的溶液4.增濁劑的使用增濁劑的使用1 抗原抗體比例1.1. 高劑量鉤狀效應(yīng)

10、（高劑量鉤狀效應(yīng)（high dose hook high dose hook effect )effect )2.2. 海德堡（海德堡（heidelbergerheidelberger）曲線理論）曲線理論 2 抗體的質(zhì)量（1 1）特異性高）特異性高（2 2）效價高）效價高（3 3）親和力高）親和力高（4 4）抗血清來源）抗血清來源3 抗原抗體反應(yīng)的溶液 pH 6.58.5 電解質(zhì)電解質(zhì) 離子強(qiáng)度、種類（磷酸鹽緩沖液）離子強(qiáng)度、種類（磷酸鹽緩沖液）4 增濁劑的使用 PEGPEG、tween-20tween-20等非離子型親水劑等非離子型親水劑 作用：消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子作用：消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子云和水化