初級(jí)檢驗(yàn)士考試微生物學(xué)檢驗(yàn)講義細(xì)菌生物化學(xué)試驗(yàn)

1、細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)考點(diǎn)碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)各種酶類試驗(yàn)抑菌試驗(yàn)復(fù)合生化試驗(yàn)【內(nèi)容講解】不同細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性，為此，可利用生物化學(xué)的方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。一、碳水化合物的代謝試驗(yàn)原理：由于細(xì)菌各自具有不同的酶系統(tǒng)，對(duì)糖的分解能力不同，有的能分解某些糖產(chǎn)生酸和氣體，有的雖能分解糖產(chǎn)生酸，但不產(chǎn)生氣體，有的則不分解糖。據(jù)此可對(duì)分解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)從而鑒別細(xì)菌。1.糖（醇、昔）類發(fā)酵試驗(yàn)原理：由于各種細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、甘）類的酶，故分解糖類的能力不同，分

2、解糖類后的終末產(chǎn)物亦不一致，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故可利用此特點(diǎn)以鑒別細(xì)菌。培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5%1%勺糖類（單糖、雙糖或多糖）、醇類（甘露醇、肌醇等）、昔類（水楊昔等）。方法：接種，培養(yǎng)。結(jié)果：產(chǎn)酸：培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。產(chǎn)氣：可使液體培養(yǎng)基中倒管內(nèi)或半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象。不分解：培養(yǎng)基中除有細(xì)菌生長(zhǎng)外，無(wú)任何其他變化。應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn)，特別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要。2.氧化-發(fā)酵試驗(yàn)（0/F試驗(yàn)）原理：氧化型：僅在有氧環(huán)境中分解葡萄糖發(fā)酵型：在有氧或無(wú)氧環(huán)境中都能分解葡萄糖產(chǎn)堿型：在有氧或無(wú)氧環(huán)境中都不能分解葡萄糖培養(yǎng)

3、基：HL.（Hugh-Leifson）培養(yǎng)基方法：將待檢菌同時(shí)穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無(wú)菌的液體石蠟（或其他礦物油），高度不少于1cm。將培養(yǎng)基于35c培養(yǎng)48h或更長(zhǎng)。結(jié)果：開(kāi)管封閉管產(chǎn)堿型-“化型+-發(fā)酵型+精品資料分享應(yīng)用I If f版桿菌科細(xì)菌（發(fā)酵型）;非發(fā)酵菌（產(chǎn)膩型/氧化型）-葡萄球菌（發(fā)薛型）1 1微球菌（氧化型）3 .3-半乳糖甘酶試驗(yàn)（ONPGt驗(yàn)）原理：令上硝基酚-B B-0-0-半乳糖昔位MPGMPGL L-半乳糖苜能.令卜硝基酚（黃色）鄰-硝基酚-3-D-半乳糖昔（ONPG3-半乳糖甘酶鄰-硝基酚（黃色）試齊IJ:0.75MONPG溶液方法：從克氏雙

4、糖鐵培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖,使酶釋放。將試管置37c水浴5min,加入0.25mlONPG試劑，水浴20min3h觀察結(jié)果。結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性反應(yīng)，一般在2030min內(nèi)顯色。應(yīng)用：迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONP電驗(yàn)為陽(yáng)性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本實(shí)驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。4 .七葉昔水解試驗(yàn)原理：七葉音細(xì)菌.七葉素枸椽酸叫黑色化合物培養(yǎng)基：七葉昔培養(yǎng)基、膽汁七葉昔培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于七葉昔培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛?yáng)性，不變色者為陰性。應(yīng)用：主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。JD

5、JD群鏈球菌（+）二其它熊球菌（7精品資料分享5 .甲基紅試驗(yàn)原理：細(xì)菌、葡萄糖丙酮酸混合酸（pHpHI I）I I醇酮醛（pHtpHt）V V,紅色反應(yīng)（+）橘黃色（- -）培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白月東水培養(yǎng)基方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24d,于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性；橘紅色為弱陽(yáng)性；黃色為陰性。應(yīng)用：J J大腸埃希菌（+）t t產(chǎn)氣腸桿菌（-）腸桿菌科：沙門菌屬、志賀菌屬、枸檬酸桿菌屬、變形桿菌屬（+）腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬（-）。6 .V-P試驗(yàn)原理：細(xì)菌脫投0H-0H-葭萄穗丙酮酸乙醍甲基甲酹二乙酰0 0基紅色化合物（+）培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白月東

6、水培養(yǎng)基方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35c培養(yǎng)48h后加入甲液（6%z-蔡酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振搖。結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性；如無(wú)紅色出現(xiàn)且于35c4h后仍如故者即為陰性。應(yīng)用：本試驗(yàn)常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧?yáng)性的細(xì)菌，后者通常為陰性。二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)原理：不同種類的細(xì)菌分解蛋白質(zhì)的能力不同。細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)的分解，一般先由胞外酶將復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解為短肽（或氨基酸），滲入菌體內(nèi)，然后再由胞內(nèi)酶將肽類分解為氨基酸。1 .明膠液化試驗(yàn)原理：方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22c培養(yǎng)7d,逐日觀察結(jié)果。若用35c孵育，因明膠在此溫度下自行液化，

7、故在觀察結(jié)果前，先置4c冰箱內(nèi)30min,再看結(jié)果。精品資料分享明膠酶明膠（半固體）結(jié)果：培31?呈液化狀態(tài)為陽(yáng)性應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別：沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細(xì)菌很少液化明膠。厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。2 .口引喋（靛基質(zhì)）試驗(yàn)培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于35c培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮?。精品資料分享氨基酸（流動(dòng)液色氨酸酯色氨酸喙對(duì)二甲基氨基苯甲醛玫瑰陰I I喙（紅色）培養(yǎng)基：蛋白月東水培養(yǎng)基方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35c培養(yǎng)

8、2448h,沿試管壁慢慢加入口引喋試劑。結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。J大腸埃霜菌（+）i沙門菌屬 33.硫化氫試驗(yàn)原理：含疏氨基酸硫化氫細(xì)菌鉛或亞鐵離子硫化鉛或疏化蛻鐵黑褐色）應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。如沙門菌屬、愛(ài)德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸檬酸桿菌屬、變形桿菌屬細(xì)菌，絕大多數(shù)硫化氫陽(yáng)性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。4 .尿素分解試驗(yàn)原理：無(wú)色源獎(jiǎng).尿素CpHt)CpHt)I紅色培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35c培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變?yōu)殛?/p>

9、性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌月尿酶陽(yáng)性。另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽(yáng)性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。5 .苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)原理：莘丙氨酸脫氨酹氯化鐵玳劑笨丙氨酸苯丙酮酸綠色反應(yīng)培養(yǎng)基:苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基方法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于35c培養(yǎng)1824h,滴加10吐氯化鐵試劑34滴，自斜面上方流下。結(jié)果：應(yīng)立即觀察結(jié)果，出現(xiàn)綠色為陽(yáng)性。11應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。丁變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌(+)二腸桿菌種中其他細(xì)菌(-)6 .氨基酸脫竣酶試驗(yàn)原理：氨基醵脫竣能氨基酸胺CpHtCpHt) )精品資料

10、分享培養(yǎng)基：氨基酸脫竣酶培養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥(niǎo)氨酸或精氨酸）培液體石蠟或礦物油，于35c培養(yǎng)14d,每日觀察結(jié)果。結(jié)果：對(duì)照管應(yīng)呈黃色，測(cè)定管呈紫色（指示劑為澳甲酚紫）為陽(yáng)性，若測(cè)定管呈黃色為陰性。若對(duì)照管呈現(xiàn)紫色則試驗(yàn)無(wú)意義，不能作出判斷。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫竣酶均為陽(yáng)性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。三、碳源和氮源利用試驗(yàn)細(xì)菌對(duì)單一來(lái)源的碳源利用的鑒定試驗(yàn)。1 .枸檬酸鹽利用試驗(yàn)原理：枸椽酸鹽碳酸鹽+氨（pHpH1 1）漠麝香草酣藍(lán)綠色深藍(lán)色培養(yǎng)基：枸檬酸鹽培

11、養(yǎng)基方法：將被檢菌接種于枸檬酸鹽培養(yǎng)基，于35c培養(yǎng)14d,每日觀察結(jié)果。結(jié)果：由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性；不能利用枸檬酸鹽作為碳源的細(xì)菌，在此培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，培養(yǎng)基則不變色，為陰性。精品資料分享養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基中，并加入無(wú)菌應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛(ài)德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常為陽(yáng)性。2.丙二酸鹽利用試驗(yàn)原理：丙二酸鹽碳酸鹽+氧（pHpH，）I I漠麝香草配藍(lán)縹色深貨色份關(guān)其.坨喬基.丙二酸鹽培養(yǎng)基方法：將被檢菌接種于培養(yǎng)基，35c培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性，顏色無(wú)變化為陰性。應(yīng)用：

12、腸桿菌科中屬間及種的鑒別?？死撞鷮贋殛?yáng)性，枸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽(yáng)性，其他菌屬均為陰性。四、各種酶類試驗(yàn)（一）呼吸酶類試驗(yàn)2 .氧化酶試驗(yàn)原理：鹽酸二日基對(duì)苯二胺有色的器類化合物試齊J:1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或1流酸二甲基對(duì)苯二胺。方法：方法：3 ）菌落法：直接滴加試劑于被檢菌菌落上。4 ）濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。5 ）試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色，為陽(yáng)性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。應(yīng)用；（假單胞菌、奈瑟菌屬，莫拉菌屬細(xì)菌

13、（+）工腸桿菌科細(xì)菌（-）6 .過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)）原理：試齊J:3%氧化氫溶液方法：取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3%氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。應(yīng)用：故此試驗(yàn)常用于革蘭陽(yáng)性球菌的初步分群。r r葡萄球菌、散球菌（+）*SS*SS球菌屬（- -）7 .硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：細(xì)胞色素。氧化度室化至細(xì)里色素室化至細(xì)里色素 c過(guò)至化氫過(guò)弱化氫能水精品資料分享亞硝酸鹽亞硝酸鹽對(duì)氯基云璜酸NHj.NHj.輸、NONO、（閣Q Q-釜胺VN-N-菱胺偶氮笨磺酸（紅色1 1培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基試劑：甲液

14、（對(duì)氨基苯磺酸）；乙液（”-蔡胺）方法：被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35c培養(yǎng)14d。將甲、乙液等量混合后（約0.1m1）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。若加入試劑后無(wú)顏色反應(yīng)，可能是：硝酸鹽沒(méi)有被還原，試驗(yàn)陰性；硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，這時(shí)應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表示試驗(yàn)為假陰性。應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮?dú)?；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗(yàn)也為陽(yáng)性。4 .脂酶試驗(yàn)原理：維多利亞藍(lán)釋放:深藍(lán)色）培養(yǎng)基：脂酶培養(yǎng)基（含維多利亞藍(lán)）方法：將被檢菌

15、接種于上述培養(yǎng)基中，于37c培養(yǎng)24ho結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性，陰性為粉紅色或無(wú)色。應(yīng)用：主要用于厭氧菌的鑒別。類桿菌屬中的中間類桿菌產(chǎn)生脂酶，其他類桿菌則陰性；芽胞梭菌屬中產(chǎn)氣芽胞梭菌、肉毒梭菌和諾維梭菌為陽(yáng)性，而其他梭菌陰性。5 .卵磷脂酶試驗(yàn)喧防喧防酯酸脂肪酸維多利維多利ZEW. .無(wú)色無(wú)色. .精品資料分享卵磷脂薨/甘油酷（渾濁沉淀狀）C/磷酸膽植匚水溶性）培養(yǎng)基：1唾口黃瓊脂平板方法：將被檢菌劃線接種于卵黃瓊脂平板上，35c培養(yǎng)結(jié)果：若3h后在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，即為陽(yáng)性,應(yīng)用：主要用于厭氧菌的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維梭菌產(chǎn)生此酶，其他梭菌為陰性。6 .DNA酶試驗(yàn)原理：某

16、些細(xì)菌產(chǎn)生DNAB,可使長(zhǎng)鏈DNAK解成寡核甘酸鏈。因?yàn)殚L(zhǎng)鏈DNA可被酸沉淀，寡核甘酸鏈則溶于酸，所以當(dāng)在菌落平板上加入酸后，會(huì)在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。培養(yǎng)基：0.2%DNA朝旨平板。方法：將被檢菌點(diǎn)種于上述平板上，于35c培養(yǎng)1824h,然后用1mol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果。結(jié)果：在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽(yáng)性，無(wú)透明環(huán)為陰性。應(yīng)用：在革蘭陽(yáng)性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNAB;在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。7 .凝固酶試驗(yàn)原理：纖維蛋白原金黃色董萄球菌結(jié)合（凝聚因子）纖維蛋白方法：1）玻片法：取兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的玻片上，挑取被檢菌分別與血漿和鹽水混合。2）試管法：取

17、試管2支，各加0.5ml人或兔血漿，挑取被檢菌和陽(yáng)性對(duì)照菌分別加入血漿中并混勻,于37c水浴34h。結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象判為陽(yáng)性；試管法以血漿凝固判為陽(yáng)性。原理:36h。6h后混濁環(huán)可擴(kuò)展至56mm游離協(xié)同因子精品資料分享應(yīng)用：作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時(shí)常用的一個(gè)試驗(yàn)。8 .CAMPM驗(yàn)原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAM的子，可促進(jìn)葡萄球菌的3-溶血素溶解紅細(xì)胞的活性，因此在兩菌（B群鏈球菌和葡萄球菌）的交界處溶血力增加，出現(xiàn)矢形（半月形）的溶血區(qū)。培養(yǎng)基：血瓊脂平板方法：先以產(chǎn)3-溶血素的金黃色葡萄球菌劃一橫線接種于血瓊脂平板上，再將被檢

18、菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩線不能相交，相距0.51cm,于37c培養(yǎng)1824h,觀察結(jié)果。結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)為陽(yáng)性。應(yīng)用：在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAM膜驗(yàn)陽(yáng)性，故可作為特異性鑒定。9 .膽汁溶菌試驗(yàn)原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，可能是由于膽汁降低細(xì)胞膜表面的張力，使細(xì)胞膜破損或使菌體裂解；或者是由于膽汁加速了肺炎鏈球菌本身自溶過(guò)程，促使細(xì)菌發(fā)生自溶。試齊J:10%氧膽酸鈉方法：1）平板法：取10溢氧膽酸鈉溶液一接種環(huán)，滴加于被測(cè)菌的菌落上，置35c30min后觀察結(jié)果。2）試管法：被檢菌培養(yǎng)物2支，各0.9ml,分別加入10%t氧膽酸鈉溶液和生理鹽水（對(duì)照管）0

19、.1ml,搖勻后置35c水浴1030min,觀察結(jié)果。結(jié)果：平板法以“菌落消失”判為陽(yáng)性；試管法以“加膽鹽的培養(yǎng)物變透明，而對(duì)照管仍混濁”判為陽(yáng)性。應(yīng)用：f f肺炎建球菌C+C+）甲型酢球菌（-）五、抑菌試驗(yàn)1.O/129抑菌試驗(yàn)原理：0/129（二氨基喋咤）對(duì)弧菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對(duì)氣單胞菌屬細(xì)菌無(wú)抑制作用。培養(yǎng)基:堿性瓊脂平板。方法：將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上，鐐?cè)?/129紙片（含藥40g）貼于平板上，35c培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果。結(jié)果：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，無(wú)抑菌環(huán)為耐藥。應(yīng)用：用于弧菌科的屬間鑒別。J J瓠菌屬、鄰單胞菌屬（S S）t t氣單胞菌屬（R R）10桿菌肽試驗(yàn)原理：A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全部敏感，而其他群鏈球菌絕大多數(shù)對(duì)其耐藥。精品資料分享培養(yǎng)基：血瓊脂平板。方法：將待檢菌純培養(yǎng)物(肉湯)均勻涂布于血液瓊脂平板上，稍于后貼上35c培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果。結(jié)果：抑菌環(huán)直徑10mmi敏感，抑菌環(huán)直徑 v10mmi耐藥。應(yīng)用：用于A群鏈球菌與非A群鏈球菌的鑒別。A A群薛球菌1 1茄A A群會(huì)球菌C-)C-)11奧普托欣(Optochin)試驗(yàn)原理