ELISA試驗基本步驟及材料和試劑

1、精選ELISA基本步驟和主要試劑、材料留意：本步驟為間接ELISA步驟一 主要步驟1 包被取所要包被的物質(zhì)，提前設(shè)計好所需濃度，依據(jù)包被孔數(shù)計算所需包被物的量，用包被液稀釋至所需體積，分加至各孔中。包被條件：兩種選擇：一是將ELISA板直接置4過夜；也可以先置37孵育2小時再轉(zhuǎn)入4過夜。2 洗滌 包被結(jié)束后棄掉包被液，用PBST進(jìn)行洗滌，方法為PBST加滿每孔，靜置5-10min，棄掉洗液，重新加滿，重復(fù)洗滌3-5次，最終拍干ELISA板等待下一步封閉。3 封閉常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封閉液至每孔，體積至少為所加包被液的兩倍。封閉條件也有兩種選擇：直接置于4過夜，或者置于3

2、7溫育2-4h，具體何種條件不同物質(zhì)的ELISA可能不同。4 洗滌封閉結(jié)束的ELISA板進(jìn)行洗滌，方法同步驟2。最終拍干等待加入一抗。5 加入一抗一抗即為你要檢測的物質(zhì)，一般加之前需要稀釋，具體稀釋倍數(shù)不同試驗 不同需要自己摸索。一抗樣品一般用包被液稀釋，稀釋到所需濃度后加入到相應(yīng)孔中。反應(yīng)條件為37孵育2h。6 洗滌具體同步驟4。7 加相應(yīng)HRP-標(biāo)記的商品化二抗加相應(yīng)的商品化HRP-標(biāo)記的二抗（如一抗為鼠源物質(zhì)則對應(yīng)加抗鼠二抗），一般也用封閉液稀釋，稀釋倍數(shù)參考二抗說明書。將稀釋好的二抗加入各孔，37反應(yīng)1-1.5h。8 洗滌具體同步驟4。9 顯色常用OPD作為顯色底物，但OPD致癌，也有

3、用TMB作為底物，這里只介紹前者。顯色需要配置顯色液，具體方法為：在步驟8進(jìn)行到一半使配置顯色液，為10ml底物緩沖液加0.015g OPD粉末（實際操作由于OPD有毒不便利稱量故只需略微加入一點即可），等待OPD完全溶解。待步驟8完成后取150ul 3%過氧化氫溶液加入之前配置的10ml溶液中混勻，馬上將此顯色液分加至ELISA各孔中。然后將ELISA板置于37反應(yīng)約10min。10 終止 將ELISA板取出，每孔加終止液（2mol/L硫酸溶液）終止反應(yīng)，馬上到酶標(biāo)儀上讀數(shù)（OPD為底物是讀數(shù)波長為490nm，TMB為底物時波長為450nm）。二 材料、試劑1 ELISA板專用于EILSA的

4、產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式，需要購買。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。留意：聚苯乙烯材料目前只有進(jìn)口，特點是孔大，加滿約300ul，此時試驗中所加各試劑（包被液、一抗、二抗、顯色液、終止液等）均為100ul體積。而聚氯乙烯多為國產(chǎn)，孔較小，加滿約200ul，此時各試劑只需加50ul體積即可。2 各試劑配制1）包被液（PH6.3的碳酸鹽緩沖液）無水Na2CO3 0.1696gNaHCO3 0.2856gSW 100ml完全溶解至4,一周內(nèi)使用2）PBST配方 NaCl 8.0gNa2HPO4.12H2O 2.9gKCl 0.2gKH2PO4 0.24g

5、TW-20 0.5mlSW 1000ml 3)底物緩沖液Na2HPO4 3.682g檸檬酸 1.02gDW 200ml不需滅菌，4保存4）3% H2O2 30%H2O2 100mlSW 900ml5）顯色劑底物緩沖劑 10ml3%H2O2 150ulOPD 15mg其中H2O2 最終加6）終止液濃硫酸：SW = 1:8濃硫酸緩慢加入到SW 中，并攪拌散熱三 留意事項1 包被所謂37反應(yīng)，一般取一個37的水浴鍋，在水面放一較大泡沫板，將ELISA板置于泡沫板上即可，其余步驟的37反應(yīng)操作同此；整個ELISA過程中全部需要較長時間等待的步驟（包被、封閉、加一抗孵育、加二抗孵育）均需要將ELISA包起來再放入冰箱或水浴鍋中，一般可直接用一次性EP手套套起來即可。2 洗滌最常規(guī)的洗滌步驟是洗滌3次，每次間隔5min，具體試驗可能會微調(diào)，洗滌次數(shù)可以3-6次不等，間隔5-10min不等；每次洗滌后要將ELISA板盡可能拍干后在進(jìn)行下一步操作，尤其是每個洗滌步驟的最終一次洗滌要盡可能拍干，拍干可在紗布、吸水紙上進(jìn)行，也可以購買洗板機(jī)。3 顯色配制顯色液時3%過氧化氫肯定要最終加入，加入