苦蕎黃酮的提取工藝以及抗氧化特性研究

1、論文題目:苦蕎黃酮的提取工藝以及抗氧化特性研究引言31 材料與方法71.1 實驗材料71.2 主要實驗儀器71.3實驗方法71.4苦蕎中總黃酮提取分離純化71.4.1黃酮標準溶液的制備和標準曲線的繪制.71.4.2苦養(yǎng)麥麩皮總黃酮含量測定.81.4.3正交實驗設(shè)計.81.4.4苦蕎黃酮提取工藝.91.4.5苦蕎黃酮、苦蕎粉，苦蕎籽，苦蕎殼成分分析.92苦蕎黃酮抗氧化活性能力的測定112.1 DPPH貯備液的配制112.2苦蕎黃酮抗氧化活性能力的測定112.3不同濃度下不同物質(zhì)的抗氧化活性能力的測定112.4不同pH條件下各物質(zhì)的抗氧化活性能力的測定123 結(jié)果與分析133.1 苦蕎黃酮的提取工

2、藝研究133.1.1苦蕎黃酮得最佳提取條件133.2 苦蕎黃酮的提取143.2.1 苦蕎粉黃酮提取.143.2.2 苦蕎黃酮、苦蕎粉，苦蕎籽，苦蕎殼成分測定143.3 苦蕎黃酮抗氧化性能163.3.1 苦蕎黃酮、蕎籽醇提液、蕎殼醇提液的對DPPH·自由基的清除能力比較173.3.2 不同濃度提取物對DPPH·自由基清除能力比較.183.3.3 不同pH條件下各抗氧化劑對自由基的清除率.194 討論205 結(jié)論21參考文獻22摘要：對苦蕎麥黃酮類物質(zhì)的乙醇提取工藝進行研究。以蘆丁為對照品用吸光光度法，利用正交實驗研究苦蕎黃酮提取過程中的提取所用時間、乙醇的濃度、料液比、提取溫

3、度，結(jié)果表明： 對提取效果影響岡素依次為乙醇體積分數(shù)>提取時間>提取溫度>料液比。得到最佳提取工藝條件為：體積分數(shù)70乙醇、料液比1：10、提取溫度70、提取時間5h，二級提取，提取率為3.2 ，純度73.48 。采用最佳提取條件對苦蕎粉進行苦蕎黃酮的提取分離，再進行純化，對苦蕎黃酮進行成分分析，得到含量高達65 的高純度苦蕎黃酮。以維生素C、蘆丁為對照，研究苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物在不同濃度、不同pH下對DPPH·自由基的清除能力。結(jié)果表明，苦蕎黃酮清除DPPH·自由基的能力僅次于維生素C，大于蘆丁和蕎籽醇提物，遠大于蕎殼醇提物，清除DPPH&#

4、183;自由基的能力與其濃度成正比關(guān)系，在pH=28范圍內(nèi)，pH增大，清除DPPH·自由基的能力先降低后增大，在pH=7時最低。關(guān)鍵詞：苦蕎黃酮 正交實驗 提取工藝 抗氧化性Abstract: the bitter buckwheat ethanol extraction technology of flavonoids were studied. With rutin as reference substance with absorbance spectrophotometry, using the orthogonal experimental study used buckw

5、heat flavone extraction in the process of extraction time, ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction temperature, the results show that the influence on the extraction effect, element followed by ethanol concentration > extraction time > extraction temperature > solid-liquid rat

6、io. Get the best extraction technology conditions for: volume fraction of 70% ethanol, and solid-liquid ratio, extraction temperature 70 , extracting time 5h, secondary extraction, extraction rate was 3.2%, the purity of 73.48%. The best extraction conditions of buckwheat powder, buckwheat flavone e

7、xtraction and separation, to purify, to analyze the chemical composition in buckwheat flavone, get high purity buckwheat flavone content as high as 65%. With vitamin C and rutin as comparison, the buckwheat flavone, seed alcohol extract, shell alcohol extract in different concentrations, the DPPH &#

8、183; free radical scavenging ability under different pH. The results showed that buckwheat flavone's ability to remove DPPH·free radicals after vitamin C, greater than rutin and Qiao seed alcohol extract, far more than Qiao shell alcohol extract, remove the ability of DPPH · free radic

9、als and its concentration is proportional to the relationship, within the scope of the pH = 2 8, pH, after eliminating DPPH · free radical ability to reduce, the lowest in the pH = 7.Keywords: buckwheat flavone extraction process of orthogonal experiment the oxidation resistance引言苦蕎屬雙子葉蓼科蕎麥屬植物，

10、又名春蕎、野蕎麥，學名韃靼蕎麥,為一年生或多年生宿根植物，原產(chǎn)于我國東北和西南部四川涼山地區(qū)?？嗍w耐旱耐寒，耐酸耐堿，適應(yīng)性較強，生長周期短，主要分布在海拔2000米左右的高原地帶，是一種藥食兩用植物，味苦，具有較高的營養(yǎng)價值和良好的醫(yī)療保健作用，富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、礦物質(zhì)及維生素等。更為重要的是含有極為豐富的生物活性成分黃酮類化合物，又稱生物類黃酮，是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類化合物?？嗍w黃酮是存在于苦蕎的花、莖、葉和籽粒中的一種多酚類天然產(chǎn)物，主要包括蘆丁、槲皮素、山奈酚和桑色素等四種主要成分，其中蘆丁含量最高，大約占四種黃酮化合物的85%左右。張琪等1從不同苦蕎樣品的總黃酮含量和蘆丁

11、含量的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，總黃酮的含量與蘆丁的含量有一定正相關(guān)性；廣西、甘肅、四川、貴州、山西的苦蕎總黃酮含量較高；苦蕎種子中有效成分高于甜蕎；種子貯存時間越久有效成分含量越低。另外，在苦蕎中還發(fā)現(xiàn)兒茶酸、表兒茶沒食子酸、表兒茶酸等生物類黃酮。一般能溶于水、乙酸乙酯、乙醇等極性溶劑中，難溶于乙醚、氯仿和苯。藥效學動物實驗及臨床應(yīng)用表明：苦蕎功能成分的分布研究以苦蕎黃酮最多，蛋白質(zhì)次之，糖醇最少?？嗍w黃酮的含量因不同階段、不同器官而有所不同，以花、葉的含量最高。朱友春等14用比色法測定三個品種不同時期的總黃酮含量，表明黃酮含量高低順序為幼苗>植株>籽粒。趙玉平等15通過對苦蕎各器官中黃酮含量

12、的研究顯示苦蕎根、莖、葉、花、籽分別為：0. 51%、1. 25%、5. 39%、6. 28%、2. 13%；并對不同器官及其組織中的蘆丁進行定量測定，表明蘆丁是苦蕎中最主要的黃酮類物質(zhì)。徐寶才等16對四川苦蕎籽粒中各部分的黃酮組分進行測定，結(jié)果差異不大,而總黃酮含量為麩皮>外層粉>殼>心粉，麩皮、外層粉、殼中的蘆丁占總黃酮的90%以上。Bonafaccia，等17對苦蕎及其磨制品的蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果為：籽粒(11. 1±0. 01)%、麩皮(25.3±0.06)%、面粉(10. 3±0. 02)%。目前D-CI主要從苦蕎麩皮中提取?？嗍w被稱為三

13、降食品，具有降低血糖、血脂和膽固醇的作用。張月紅等18的研究顯示，苦蕎提取物對(-葡萄糖苷酶)的抑制作用與阿卡波糖相當；小鼠體內(nèi)實驗顯示苦蕎提取物可降低實驗小鼠口服淀粉、蔗糖后的血糖值，說明苦蕎的降血糖作用可能與苦蕎內(nèi)含有-葡萄糖苷酶抑制劑類物質(zhì)有關(guān)，可能是其降血糖作用的機制之一。祁學忠19通過對苦蕎黃酮藥效學的動物實驗研究表明：苦蕎提取物120 mg/kg或125 mg/kg,給小鼠或大鼠灌胃1周或2周，有降低血清膽固醇和甘油三酯作用，還可降低肝甘油三酯，說明苦蕎提取物有改善脂質(zhì)代謝異常的作用；苦蕎提取物與維生素C聯(lián)合使用，對降低血脂有一定的增強作用。降血糖機制是通過增加胰島素受體數(shù)量或(和

14、)提高胰島素與受體結(jié)合的敏感性，促進組織攝取葡萄糖等受體后效應(yīng)而產(chǎn)生降糖作用20。薛長勇等21研究認為苦蕎黃酮的作用途徑可能是通過抑制糖苷酶、三酰甘油，激活過氧化物體增殖劑激活型受體和而實現(xiàn)的。由于苦蕎黃酮類化合物的成分復(fù)雜，到底是哪種黃酮化合物表現(xiàn)上述作用，還需要更深入的探索。另外，D-CI為胰島素信號傳遞過程中的信使，糖尿病患者的胰島素抵抗主要是由于體內(nèi)缺乏足夠的D-手性肌醇所致?？嗍w糖醇可在人體腸道微生物的作用下被降解為D-CI，進而提高胰島素的敏感性，對降低膽固醇和低密度脂蛋白也有一定的作用。黃酮作為一種功能成分，具有較顯著的降血糖、降血脂、抗氧化、增強心血管功能等。蘆丁又名蕓香苷、維

15、生素P，是苦蕎中主要的黃酮類物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學證明，蘆丁具有多方面的生理活性，可用來預(yù)防和治療毛細血管脆性引起的腦出血、肺出血、出血性腎炎、胃炎、胃潰瘍及牙齦出血等。國外還用蘆丁制備多種蘆丁衍生物，如檞皮素、羥乙基蘆丁等。因此，開發(fā)苦蕎麥具有廣闊的市場和發(fā)展前景。本研究選用云南高寒山區(qū)苦蕎麥為原料，采用乙醇熱浸法提取分離純化苦蕎黃酮，利用DPPH·自由基對其抗氧化活性進行了研究，可為云南苦蕎的集成開發(fā)利用提供深厚的理論基礎(chǔ)。黃酮類化合物以前主要是指基本母核為苯基的色原酮的化合物，現(xiàn)在泛指兩個苯環(huán)通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。天然植物黃酮類物質(zhì)具有消炎、消腫、降壓、降血脂、清除

16、自由基等多種功能，其提取物質(zhì)已用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品中。黃酮廣泛存在于一些植物中， 在槐花米、蕎麥、蒲公英、桑樹葉、銀杏中含量較多，對于其提取研究已有許多報道，但從苦蕎麥麩皮中提取黃酮的研究還未見報道，本文以定苦蕎粉為原料， 正交試驗設(shè)計考察了乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度和料液比等提取條件對提取率的影響。確定了最佳提取工藝條件， 為苦蕎黃酮的綜合利用提供了依據(jù)?？嗍w黃酮的提取方法多種多樣，且都各有特點，目前已經(jīng)研究的方法主要有以下幾種：一、水提法：水經(jīng)濟易得、極性大、溶解范圍廣，是常用的提取溶劑之一。蘆丁等黃酮類成分可溶于沸水，故常采用煎煮法進行提取。優(yōu)點是成本低、安全，適合于工業(yè)化

17、生產(chǎn)；但缺點是熱水提取出的雜質(zhì)較多，且苦蕎中淀粉含量較高，用于煎煮后藥液黏度較大，濾過困難。煎煮法屬于間歇式操作，即將苦蕎原料置煎煮器中，加水使浸沒，浸泡適宜時間；然后加熱至沸，并保持微沸狀態(tài)一定時間，濾過，收集濾液；藥渣再加水煎煮，合并各次煎煮液，即得。提取工藝主要考慮加水量、浸泡時間、煎煮時間及煎煮次數(shù)等因素。周瑞雪等對苦蕎進行水提取工藝的研究，以總黃酮量及其含量為指標來評價提取工藝。通過單因素實驗和正交實驗考察浸泡時間、料液比等對提取物總黃酮量及其含量的影響，優(yōu)選出水提取法最佳工藝為浸泡時間9h、料液比1:15，提取時間2h/次、提取次數(shù)兩次。水提法得到的苦蕎總黃酮純度可達到10%以上。

18、二、 乙醇提取法：苦蕎黃酮類成分易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑中。由于甲醇等有一定毒性，在工業(yè)提取中應(yīng)選用無毒的乙醇作為提取溶劑。另外，乙醇作提取溶劑也方便回收再利用，以降低企業(yè)的生產(chǎn)成本。該方法為本文的研究所選取的方法。三、 酶提取法：酶法提取技術(shù)，是通過加入某些特定的酶，使包裹于植物細胞內(nèi)的有效成分轉(zhuǎn)移到溶媒中。酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，可以較大幅度提高收率，最大限度地從植物體內(nèi)提取有效成分。四、 超聲提取法：超聲提取技術(shù)，是利用超聲波增大物質(zhì)分子運動頻率和速率、增加溶劑穿透力、提高藥物溶出度、縮短提取所用時間的浸泡提取方法。超聲波振動能產(chǎn)生并傳遞強大的能量，大能量的超聲波作用在液體里，在

19、振動處于稀疏狀態(tài)時，液體會被撕裂成很多的小空穴，這些小空穴一瞬間即閉合，閉合時產(chǎn)生高達幾千大氣壓，即稱為空化現(xiàn)象。五、 微波提取法：微波提取技術(shù)，是利用物質(zhì)在外加電場的作用下分子發(fā)生極化，如果外加電場為交變電場，則無論是有極分子電介質(zhì)，還是無極分子電介質(zhì)均被反復(fù)極化，隨著外加交變電場頻率的提高，極化的分子電場方向也交互變化，不斷地迅速轉(zhuǎn)動而發(fā)生劇烈地碰撞和摩擦，這樣就將其在電磁場中所吸收的能量轉(zhuǎn)化為熱能，使物體本身被加熱，從而促進有效成分的溶出。六、 超臨界流體萃取法：超臨界流體萃取技術(shù)（SFE），是利用超臨界狀態(tài)下的流體為萃取劑，從液體或固體中萃取中藥材有效成分并進行分離的方法。超臨界流體（

20、SF）的理化性質(zhì)介于液體和氣體之間，其相對密度比氣體大1001000倍，與液體密度相近，由于分子間距離縮短，分子間相互作用大大增強，因而溶解作用近似于液體?？寡趸瘎┰谧柚故称凤L味和營養(yǎng)品質(zhì)劣化方面起著十分重要的作用?？寡趸瘎┮部梢詼p弱一些疾病引起的組織損傷。合成抗氧化劑被廣泛用于食品添加劑，但是其可能有毒性以及在降解過程中形成致癌物質(zhì)促使人們近些年來一直努力尋找天然抗氧化劑。苦蕎中含有較多的黃酮類化合物。MWatanabe等和RPmybylski等均發(fā)現(xiàn)甜蕎種子的醇提物表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。苦蕎是中國特有的蕎麥品種，其黃酮類化合物的含量是甜蕎的3O倍左右。苦蕎黃酮所表現(xiàn)出的生理功能大多是抗氧

21、化作用。黃酮或酚性化合物一直是人們所關(guān)注的天然抗氧化劑之一。黃酮類化合物具有各種不同取代的酚羥基，分子中心的、不飽和吡喃酮使其表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。對于黃酮類化合物在食用油脂中的抗氧化效果已有大量的研究。但是往往僅以一種單一的實驗體系來測定其抗氧化特性。這樣就難以全面體現(xiàn)黃酮類化合物的生物學意義，所以，本文研究了苦蕎黃酮在兩種脂類系統(tǒng)中的抗氧化效果，從而搞清在不同體系的真實效應(yīng)。由于黃酮類抗氧劑主要是通過酚羥基與氧自由基反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈式反應(yīng)。因此共振半醌式自由基的穩(wěn)定性與抗氧化劑活性成正相關(guān)。所以，抗氧化劑形成半醌式自由基前后的生成熱之差(AHOF)是最好的衡量其活

22、性的理論參數(shù)。HOF越低說明自由基越穩(wěn)定。相應(yīng)的抗氧化劑活性越強 。從黃酮類抗氧化劑結(jié)構(gòu)上分析，B環(huán)酚羥基與A環(huán)酚羥基有兩點差別。首先，前者的兩個OH多處于鄰位，而后者多處于間位。顯然鄰位OH被抽氫產(chǎn)生自由基后可借助形成分子內(nèi)氫鍵得以穩(wěn)定，因而抗氧化活性更高；而且，鄰位OH 的自由基可通過共振形成鄰苯醌，這也可降低其內(nèi)能、提高自由基的穩(wěn)定性，而間位酚羥基不具備這兩種穩(wěn)定機制。其次，A環(huán)與c環(huán)的共軛較好，從理論上分析色原酮類 C環(huán)的吸電子性質(zhì)使A環(huán)OH的0一H鍵能增大，不利于H的解離，因而降低A環(huán)OH的活性，而與c環(huán)共軛較差的B環(huán)受這種影響較小。兒茶素的C環(huán)由于具有一定的推電子性質(zhì)，故A環(huán)酚羥基

23、反而得到一定的活化，總體來看，A環(huán)與B環(huán)的這兩點判別可能是導致B環(huán)OH活性高的原因。黃酮類化合物所表現(xiàn)出的抗氧化活性在一些體系可能是以上因素綜合作用的結(jié)果，而在另外一些體系則有可能是主要某一因素起作用的結(jié)果。1 材料與方法1.1 實驗材料原料:苦蕎粉，苦蕎殼，苦蕎籽均為昭通鶴鄉(xiāng)綠色食品有限責任公司提供。試劑:亞硝酸鈉;硝酸鋁;氫氧化鈉;無水乙醇；蘆?。℉PLC98%，成都思科華生物技術(shù)有限公司）；維生素C（湖南南化化學試劑廠）；DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼基，2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）（美國Sigma-Aldrich公司）；1.2 主要實驗儀器儀器 72

24、2紫外可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；SHZ-型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；電熱鼓風干燥箱 （上海實驗儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（常州市華普達教學儀器有限公司）；電子天平感量為0.0001g (沈陽龍騰電子有限公司)；1.3實驗方法 苦蕎粉粉碎過60目篩加70乙醇70浸提過濾濃縮含量測定1.4苦蕎中總黃酮提取分離純化1.4.1黃酮標準溶液的制備和標準曲線的繪制準確吸取一定量樣品液置于25ml容量瓶，用70乙醇補充至lOml。先精確加5亞硝酸鈉溶液1.0ml，搖勻，放置6min；再加10硝酸鋁溶液1.0ml，搖勻，放置6min；再加lmolL氫氧化鈉溶液lOml，用蒸餾

25、水稀釋至刻度，振搖，放置15min。以不加樣品為參比，用721型分光光度計在510nm波長處測定吸光度。標準曲線的制作：準確稱取蘆丁標準品(12O干燥至恒重)1091mg置于100ml容量瓶中，加70乙醇適量，微熱使溶解，待涼后加70乙醇稀釋至刻度，搖勻。準確吸取此溶液10ml置于50ml容量瓶中，加70乙醇稀釋至刻度，搖勻，備用(每毫升含無水蘆丁0218mg)。準確吸取上述母液10、20、30、40、50和6Oml分別置于25ml容量瓶中，依前述方法進行比色測定，作標準曲線。最小二乘法作線性回歸，得蘆丁標準液濃度(mg/mL)C與吸光度A的關(guān)系曲線的回歸方程：Y = 0.8867X0.004

26、9，相關(guān)系數(shù)R2 =0.9952。1.4.2苦養(yǎng)麥麩皮總黃酮含量測定 取烘至恒重的苦蕎麥粉末100g于三角燒瓶中，加入1000ml體積分數(shù)70的乙醇，70浸提5h，并同時攪拌，將提取液趁熱減壓抽濾過濾，二級提取，合并濾液減壓濃縮，真空干燥，得棕黃色固體物46g。取干燥的提取物40mg，用70 的乙醇溶解并定容至l0ml，取lml稀釋至25ml，測定入max處的吸光度， 由回歸方程計算黃酮含量，同時計算黃酮得率。取烘至恒重的蕎麥麩皮lg，按上述要求浸提，提取液過濾，定容至10ml。取lml稀釋至25ml，按“標準曲線制作” 項下操作，測定吸光度， 根據(jù)回歸方程，計算被測樣品中黃酮類物質(zhì)的含量，同

27、時計算黃酮得率。1.4.3正交實驗設(shè)計 為系統(tǒng)考察乙醇提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)已有的資料及實際情況，選用浸提溫度(A)、乙醇濃度(B)、浸提時間(C)和料液比(D)作為考察因素，每個因素選擇3個水平，以黃酮得率為考察指標，進行正交設(shè)計來選擇最佳提取條件。編制因素水平表，結(jié)果見表1。表1 苦蕎黃酮提取方法因素水平表水平因素C浸提時間(h)B乙醇濃度(%)D料液比(g/mL)A浸提溫度()14601:105025701:156036801:2070 相同實驗條件同一批次，同一批 次平行 3份樣品。按“1.4.2 ”項下測定各提取液中總黃酮的含量。實驗結(jié)果及統(tǒng)計學分析結(jié)果見表2、表3。從以上結(jié)果可知，

28、各試驗因素及因素水平對苦蕎黃酮類物質(zhì)提取量大小的影響不完全相同，在所選因素水平下4種因素的最佳組合應(yīng)為A3B2C2D1，即用70的乙醇溶液，料液比為 l：10，70條件下浸提5h，總黃酮浸出率最高。由方差分析可知，在正交設(shè)計表中的實驗條件下，各因素影響的次序為乙醇體積分數(shù)>提取時間>提取溫度>料液比。乙醇濃度對提取率有顯著影響，浸提時間有一定的影響，而提取溫度和料液比在所選水平范圍內(nèi)影響較小 。1.4.4苦蕎黃酮提取工藝 濾渣 溶劑回收 上清液 離心 真空干燥 苦蕎粉70%乙醇70熱浸提5h減壓抽濾濃縮 水混濁液 底部沉淀 加85%乙醇溶液，充分攪拌，靜置1h,離心。 真空干

29、燥成品（苦蕎粗黃酮） 沉淀物 苦蕎黃酮上述提取工藝黃酮的提取率按下式計算： 物料提取所得物重(g)提取率（%）= 物料中所含提取物的重(g)1.4.5苦蕎黃酮、苦蕎粉，苦蕎籽，苦蕎殼成分分析（1）黃酮的測定：同1.4.2 。（2） 蛋白質(zhì)的測定：考馬斯亮藍比色法。標準溶液為牛血清蛋白。重復(fù)測定三次。（3） 氨基酸的測定：茚三酮比色法。重復(fù)測定三次。（4） 總糖的測定：蒽酮-硫酸比色法，標準溶液為葡萄糖。重復(fù)測定三次。（5） 脂肪的測定：索氏抽提法。重復(fù)測定三次。（6） 灰分的測定：重復(fù)測定三次。（7） 水分的測定：重復(fù)測定三次。2苦蕎黃酮抗氧化活性能力的測定2.1 DPPH貯備液的配制準確稱取

30、DPPH（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）標準品5mg,用無水乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入100ml的容量瓶中，再用無水乙醇定容至刻度，搖勻得濃度為0.05mg/ml的DPPH貯備液，置于4冰箱中備用。2.2苦蕎黃酮抗氧化活性能力的測定取試管，在試管中依次加入3.9ml 0.05mg/ml的DPPH溶液和0.1ml濃度均為1mg/mL的蘆丁標準溶液、維生素C標準溶液、苦蕎黃酮溶液、苦蕎殼醇提取液以及苦蕎籽醇提取液，混勻后靜置40min后用1cm比色皿在517nm波長處測定吸光度A，并記為Ar;加入0.05mg/ml的DPPH溶液用1cm比色皿在517nm波長處測定吸光度A

31、，測定值標記為A0 。按下式計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率（%）= （A0 Ar）/ A0 × 100% 2.3不同濃度下不同物質(zhì)的抗氧化活性能力的測定在預(yù)先加入了3.9ml DPPH溶液的試管中分別加入0.5mL濃度梯度為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL的Vc標準溶液、蘆丁標準溶液、苦蕎黃酮溶液、苦蕎殼浸提液、苦蕎籽提取液，其余步驟同2.1.2，計算DPPH自由基清除率。2.4不同pH條件下各物質(zhì)的抗氧化活性能力的測定 將苦蕎黃酮溶液、苦蕎殼浸提液、苦蕎籽提取液、抗壞血酸、蘆丁標準樣液的pH值分別調(diào)至2、4、6、8

32、、10、12六個梯度，再按2.1.2 的方法進行測定,計算其清除率。3 結(jié)果與分析3.1 苦蕎黃酮的提取工藝研究3.1.1苦蕎黃酮得最佳提取條件 以測得的浸提樣品中總黃酮(蘆丁)含量為考察指標進行正交表設(shè)計，其L9（34）正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。表2 苦蕎黃酮提取的L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Design and Results of L9（34）orthogonal experiment of flavonoids extraction from tartary buckwheat實驗號ABCD黃酮得率（%）11(4)1(60)1(1:10)1(50)2.628212(70)

33、2(1:15)2(60)2.580313(80)3(1:20)3(70)2.53942(5)3312.528522122.483623332.72173(6)1212.502832222.590931132.676T17.7477.8068.0257.628T27.7067.8507.6327.850T37.7947.5917.7597.739X12.5822.6022.6752.553X22.5692.6172.5442.617X32.5982.5302.5302.579R0.0160.0870.1450.064較好水平A2B2C1D3表2可以看出，四種考察因素對苦蕎中黃酮類化合物提取效果影

34、響程度不同，其影響的主次順序依次為：乙醇體積分數(shù)>提取時間>提取溫度>料液比，最佳的提取條件為A2B2C1D3，即在料液比1:10，乙醇濃度70%，浸提溫度70，提取時間5h。3.2 苦蕎黃酮的提取3.2.1 苦蕎粉黃酮提取通過1.4.4 提取工藝，按照最佳提取條件提取得到的苦蕎黃酮及經(jīng)過純化后的純度如表3，提取率為63.28%。表3 苦蕎黃酮的純度表Tab.3 Purification of flavonoids from tartary buckwheat 黃酮樣品吸光值純度苦蕎粗黃酮0.47554.05%苦蕎黃酮0.70373.48% 本提取工藝設(shè)備要求簡單，投資少，提

35、取率較高，提取溶劑可以循環(huán)利用，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。能快速大量的生產(chǎn)出純度相對較高的黃酮，是一條較好的提取生產(chǎn)路線。3.2.2 苦蕎黃酮、苦蕎粉，苦蕎籽，苦蕎殼成分測定通過1.4.5測定得到苦蕎黃酮及苦蕎粉，苦蕎籽，苦蕎殼的成分組成，結(jié)果如表4，由表可以看出，所提取的黃酮不僅純度相對較高，而且營養(yǎng)也十分豐富，可以加工很多保健食品，也可以作為保健食品的配料。在苦蕎粉，苦蕎籽，苦蕎殼中，苦蕎粉黃酮含量較高，苦蕎籽次之，苦蕎殼含量最低，在工業(yè)化提取分離黃酮時，可以直接選用苦蕎籽來作為原料，可以節(jié)省脫殼的工序，節(jié)省時間和成本?？嗍w粉屬藥食兼用的食物，含各類營養(yǎng)元素，營養(yǎng)豐富。表4 苦蕎黃酮、苦蕎粉，苦蕎

36、籽，苦蕎殼成分Tab.4 Ingredient of flavonoids of tartary buckwheat, tartary buckwheat powder and tartary buckwheat hull樣品總黃酮（%）總蛋白質(zhì)（%）總氨基酸（%）總糖（%）脂肪（%）酸不溶性灰分（%）水分（%）苦蕎黃酮73.484.781.349.847.001.364.86苦蕎粉2.6612.050.23525.12.4127.5515.4苦蕎殼0.6231.80.0664.70.0411.66.52苦蕎籽2.7311.50.13627.32.41.7910.93.2.3 提取級數(shù)的選擇

37、稱取lOg苦蕎粉末，加入lOOml70的乙醇，70下浸提5h，過濾，在同樣條件下進行多次提取，按上述方法進行測定，由回歸方程計算各級提取得率，結(jié)果見表4。 表 4 各級提取過程中苦蕎麥麩皮中總黃酮的得率 Table 4 Rate of total flavones in bitter buckwheat peers at diferent extraction stage提取級數(shù)Extraction stage一級1二級2三級3四級4脂肪（%）酸不溶性灰分（%）水分（%）提取率（）71.519.77.51.57.001.364.86以上實驗結(jié)果表明，經(jīng)過二次提取，苦蕎粉總黃酮的提取率達到92，

38、提取產(chǎn)品得率 3.2。3.3 苦蕎黃酮抗氧化性能3.3.1 苦蕎黃酮、蕎籽醇提液、蕎殼醇提液的對DPPH·自由基的清除能力比較 根據(jù)2.1 的測定方法進行DPPH·自由基的清除能力的測定。依據(jù)DPPH·自由基在可見光區(qū)最大吸收峰最大吸收峰為517nm，其乙醇溶液呈深紫色，當具有生物活性的物質(zhì)存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因此可用分光光度法進行定量分析來檢測自由基的清除情況，從而評價某種物質(zhì)的抗氧化能力。其能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強?？嗍w黃酮及蕎籽醇提物、蕎殼醇提物對DPPH·自由基能力

39、如圖6。 圖1 苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的對DPPH·自由基的清除能力比較 Fig.1 Compare of the removal capacity of flavonoids of tartary buckwheat, tartary buckwheat powder and tartary buckwheat hull for DPPH·free radical從圖6可看出，所提取的苦蕎黃酮對DPPH·自由基的清除能力較強，僅次于Vc，強于蘆丁和苦蕎籽醇提物，遠大于苦蕎殼醇提取物。從對DPPH·自由基的清除能力可以看出，苦蕎黃酮的主要成分為

40、蘆丁，這與文獻中的報道一致，所提取的苦蕎黃酮中，除含有蘆丁外，可能還含有少量的其他的抗氧化活性較高的黃酮類物質(zhì)，使得苦蕎黃酮的清除DPPH·自由基的能力稍大于蘆丁。3.3.2 不同濃度提取物對DPPH·自由基清除能力比較不同濃度苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提取物對DPPH·自由基的清除能力比較根據(jù)2.1 的測定方法進行了苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的對DPPH·自由基的清除能力的測定，清除率隨濃度變化而變化的情況如圖2所示。圖2 不同濃度苦蕎黃酮、蕎籽醇提液、蕎殼醇提液的對DPPH·自由基的清除能力比較Fig.2 Compare of th

41、e removal capacity of tartary buckwheat flavonoids, tartary buckwheat powder and tartary buckwheat hull for DPPH· in the different concentration 由圖2可以看出，隨著樣液濃度的增加，Vc、蘆丁、苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的對DPPH·自由基的清除能力增加。蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的提取液由于黃酮含量低，對自由基的清除能力較弱，使得對DPPH·自由基的清除能力隨著濃度的增加而增加的較為明顯。而提取的苦蕎黃酮和Vc，蘆丁標

42、樣相同，純度較高，清除DPPH·自由基的能力較強，使得在濃度增加到0.5mg/mL時，即達到最大清除率90%以上，再繼續(xù)增加濃度，DPPH·自由基清除效果增加不明顯。 3.3.3 不同pH條件下各抗氧化劑對自由基的清除率根據(jù)2.1的方法進行測定在不同的PH條件下它們清除DPPH·自由基的能力，清除率的變化如圖3所示。圖3 不同pH條件苦蕎黃酮、蕎籽醇提液、蕎殼醇提液的對DPPH·自由基的清除能力比較Fig.3 Compare of the removal capacity of tartary buckwheat flavonoids, tartary buckwheat powder and tartary buckwheat hull for DPPH· in the different pH value 由圖可以看出，Vc標準品的清除DPPH·自由基的能力隨著pH的增加而降低，而苦蕎黃酮隨著pH降低清除DPPH·自由基的能力緩慢降低而后增大，在pH中性時最低，但在酸性或者堿性時的抗氧化能力均大于或接近于Vc。而蕎籽醇提物、蕎殼醇提物隨著pH的變化清除DPPH·自由基的能力變化規(guī)律相同，但由于黃酮含量低，成分較為復(fù)雜，變化