-植物內(nèi)生真菌的分離

1、植物內(nèi)生真菌的分離一、實驗?zāi)康?.理解內(nèi)生真菌存在的普遍性和多樣性2.掌握常規(guī)的微生物分離純化方法3.掌握分菌過程中的一些基本操作技能二、實驗原理植物內(nèi)生真菌 ( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定階段或 全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌， 而宿 主植物一般不表現(xiàn)出外在的癥狀。 所有植物中幾乎都存在內(nèi)生菌 . 由 于植物內(nèi)生真菌與宿主在長期的進化過程中形成了特殊的生態(tài)關(guān)系，因而內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生理活性的次生代謝 產(chǎn)物，從內(nèi)生菌中尋找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物越來越成為微生物次生 代謝產(chǎn)物的研究熱點之一。采用微生物學(xué)常規(guī)的組織分離法從植物中分離內(nèi)生

2、真菌三、實驗材料板藍根新鮮健康的葉片 試劑：次氯酸鈉、無水乙醇、葡萄糖、瓊脂、青霉素、 鏈霉 素培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基四、實驗步驟(一)、配制 PDA 培養(yǎng)基10 月 27 號晚上 :（1） 配置PDA培養(yǎng)基，用電子稱稱取去皮的土豆100g,煮沸30min,4 層紗布過濾，濾液加熱，加入瓊脂 7.5 克，瓊脂完全融化后加入葡 萄糖log,待稍冷卻后加水至 500 毫升。（2） 準(zhǔn)備 10 瓶無菌水，每瓶 150ml 左右。（3） 包好燒杯,培養(yǎng)皿,涂布棒等實驗儀器,等待消毒。（二） 、配制分離培養(yǎng)基28 號中午：（1） 配置分離培養(yǎng)基，將 PDA 培養(yǎng)液均分成兩份，一份備用，另一

3、份待高溫滅菌后，加入青霉素 100mg/ L、鏈霉素 200mg/ L 的混合液 20ml，即得到分離培養(yǎng)基。（2） 用消毒后的培養(yǎng)皿在通風(fēng)櫥中倒平板,注意在整個過程中保證 無菌操作。（三） 、采集新鮮板藍根葉片28 號晚上到實驗室外采集新鮮健康葉片完整的板藍根葉片。（四）、植物組織表面消毒28 號晚上將新鮮、健康的板藍根葉片于自來水下沖洗干凈,用吸水 紙吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒處理：75%酒精漂洗 3min,無菌水沖洗 45 次，5%次氯酸鈉溶液漂洗葉 3min,無菌水 沖洗45 次,無菌濾紙吸干水分。（五）、接種并培養(yǎng)28 號晚上：（ 1）將上述表面消毒后的材料剪切成 0

4、.5cm 2 小塊, 放入含有 分離培養(yǎng)基的平板中（ 3 塊每板） 28C恒溫培養(yǎng) 315 天。最后一次洗滌水涂布平板作為對照。（2）取備用 PDA 培養(yǎng)液高溫滅菌后，加入青霉素 100mg/ L、鏈霉素200mg/L 的混合液 20ml，在通分櫥中倒平板。（六）、分離真菌29 號晚上：接種培養(yǎng) 24 小時后，觀察對照組無細(xì)菌產(chǎn)生，說明實驗 成功。31 號中午：繼續(xù)培養(yǎng) 2 天后，實驗組組織塊邊緣沒有菌絲產(chǎn)生，放 入恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。11 月 1 號中午：觀察到實驗組組織塊邊緣沒有菌絲產(chǎn)生，放入恒溫 箱繼續(xù)培養(yǎng)。11 月 2 號晚上：觀察到實驗組組織塊邊緣有少量菌絲產(chǎn)生，及時采用菌絲尖端挑取法將其轉(zhuǎn)入另一一 PDA 平板培養(yǎng)。（七）、純化 待分離培養(yǎng)基中長出真菌后，挑入斜面培養(yǎng)