論文初稿615日22：25

1、目錄摘要：2ABSTRACT:3前言41.孤雌激活的研究概況42卵母細胞孤雌激活的分子機理53卵母細胞孤雌激活的方法531 卵母細胞的電激活632 卵母細胞的乙醇和氯化鍶激活633 卵母細胞的蛋白質(zhì)合成抑制劑的激活634 卵母細胞的鈣離子載體A23187和離子酶素(Ionomycin)735 卵母細胞的精子因子(SF或SOAF)736其它74卵母細胞孤雌激活的研究意義發(fā)展前景及存在的問題7正文81.材料與方法：81.1材料8實驗動物8實驗試劑8實驗儀器8手術(shù)器械91.2 方法9實驗試劑的制備9小鼠卵母細胞的獲取9電激活處理小鼠卵母細胞101.3活化鑒定及記錄101.4統(tǒng)計學(xué)分析102.結(jié)果:1

2、02.1不同場強對小鼠卵母細胞電激活效果的影響102.2不同脈沖寬度對小鼠卵母細胞電激活效果的影響112.3不同脈沖次數(shù)對小鼠卵母細胞電激活效果的影響113.討論124.結(jié)論：13參考文獻13致謝14摘要孤雌激活也叫孤雌生殖，孤雌激活最早始于20世紀30年代對兔卵的研究，對小鼠卵母細胞孤雌激活的研究大概在20世紀40-50年代。半個多世紀來，關(guān)于小鼠卵母細胞電激活的報道已經(jīng)很多，但，目前在國內(nèi)還未見有關(guān)于使用ET-3,GOKU，（日本富士平公司）激活卵母細胞的報道。本實驗以昆明系小白鼠（大連醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供）為研究動物,采用日本富士平公司的ET-3電激活儀對小鼠卵母細胞進行人工孤雌激活

3、,并從場強、電脈沖寬度、脈沖次數(shù)三個方面來探討其電激活率、發(fā)育階段的影響情況。結(jié)果表明：在場強為183V/mm、脈沖寬度10s、2次脈沖（脈沖間隔為50ms）刺激下其激活率和2-4細胞發(fā)育率較高。關(guān)鍵字：卵母細胞；電激活；小鼠；Abstract:Keywords:Ovocyte;Electrical activation;Mouse;前言1.孤雌激活的研究概況孤雌激活(parthenogenetic Activition)也叫孤雌生殖(parthenogenesis), 最早由owen提出，是指有性生殖動物的卵母細胞在精子以外的刺激下,由第二次減數(shù)分裂中期（second meiometapha

4、se MII期）繼續(xù)發(fā)育,排出第二極體(PB)從而產(chǎn)生二倍體染色體胚胎的過程。即在沒有雄性參與，由單個卵細胞產(chǎn)生個體的繁殖1，后又重新定義為無雄性配子的任何作用，由雌性配子產(chǎn)生的胚胎，不論其是否發(fā)生成個體，稱為孤雌生殖2.這一現(xiàn)象在無脊椎動物和低等脊椎動物中較為常見。自然條件下，卵母細胞激活是由精子穿入刺激引起的。在人工因素的刺激下也可使處于MII期的卵母細胞完成減數(shù)分裂,排出第二極體并發(fā)生卵裂?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)有許多人工方法，如電脈沖、乙醇、磷酸肌醇脂和鈣離子載體A23187等均可使小鼠、牛、倉鼠、大鼠、豬等的卵母細胞發(fā)生孤雌激活3。研究哺乳動物卵母細胞激活將加深人們對胚胎發(fā)生過程中的許多機理性的

5、認識。 誘導(dǎo)哺乳動物孤雌發(fā)育的試驗研究始于20世紀30年代，Pincus等采用改變溫度和滲透壓的方法激活兔卵，成功地獲得卵裂，并報道移植后產(chǎn)生了家兔后代，但這一結(jié)果至今未能被重復(fù)。20世紀40年代和50年代，以Thibault，Chang和Auotin為代表，采用溫度、滲透壓和麻醉劑激活小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、雪貂和綿羊卵母細胞，進行孤雌發(fā)育研究。20世紀60年代該領(lǐng)域的研究經(jīng)歷了一個低潮時期。20世紀70年代重新崛起，大多研究者著眼于提高孤雌激活率和發(fā)育率的方法學(xué)研究。采用電刺激或酶激活方法刺激小鼠卵，獲得較高的激活率和卵裂率4。20世紀80年代以來研究不斷深入，尤其是進入90年代，隨著哺乳

6、動物細胞核移植研究的開展，卵母細胞的孤雌激活得以較為系統(tǒng)的研究，在實驗動物、家畜及人卵母細胞激活方面均有較大進展的，特別是1997年克隆羊“多莉”的產(chǎn)生，體細胞核移植獲得成功，作為核移植關(guān)鍵步驟的受體卵母細胞激活引起了更多研究者的重視，使該領(lǐng)域的研究進入了新的階段5。目前，在人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的魚中，獲得了能夠正常受精的雌性個體，并成功地得到了人工雌核發(fā)育的第二代和第三代6。相比之下，哺乳動物孤雌生殖的研究還處于摸索階段，尚未取得突破性進展。我國對脊椎動物人工單性繁殖的研究報告始見于1935年，朱洗等由蛙子宮取出蛙卵，使其卵粘膜有蛙血后用細針刺激，結(jié)果其中有十分之一左右的卵像受精卵一樣進行正常卵

7、裂，并獲得兩只單性繁殖蛙。目前，我國在人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的魚中也取得了較大進展，人工誘導(dǎo)鯉魚核發(fā)育和建立純系方面己獲得成功。對于哺乳動物卵母細胞孤雌激活的系統(tǒng)研究，直至近年來由于研究細胞核移植才開始有所觸及，現(xiàn)在也已進入系統(tǒng)化研究階段，并取得一定成果。2卵母細胞孤雌激活的分子機理 在受精時，卵子的激活與成熟促進因子(MPF) 的失活是由一系列的細胞內(nèi)Ca2+多次持續(xù)波動引起的7。這些Ca2+多次持續(xù)波動是細胞周期恢復(fù)所必須的。人工孤雌激活可以模擬受精過程，使得孤雌激活的卵母細胞與受精卵有相似的生理變化。卵母細胞激活過程中，細胞內(nèi)Ca2+節(jié)律性脈沖升高起關(guān)鍵介導(dǎo)作用，Ca2+波動是啟動卵母細胞周期

8、和繼續(xù)發(fā)育的前提，直接注射Ca2+或用Ca2+載體A23187、乙醇、電刺激、Sr2+刺激均能引起卵母細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+多次波動性升高。卵母細胞內(nèi)Ca2+升高產(chǎn)生膜的超極化反應(yīng)，皮質(zhì)顆粒釋放至卵周隙導(dǎo)致染色體解聚，啟動減數(shù)分裂排出第二極體，促進原核形成、卵裂和早期胚胎發(fā)育8。. 卵母細胞M期的維持與高水平的成熟促進因子(MPF)活性有關(guān)。MPF的活性是由對Ca2+非常敏感的細胞靜止因子(CSF) 來維持的。M期卵母細胞受精激發(fā)卵內(nèi)Ca2+升高，破壞己存在的CSF，導(dǎo)致MPF活性降低。亞胺環(huán)己銅(CHX) 是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，可以使小鼠和牛的卵母細胞孤雌活化。CHX與其他因素協(xié)同促進卵母細胞活

9、化的作用機制為乙醇、電脈沖和氯化鍶的刺激已經(jīng)導(dǎo)致卵母細胞的活化，隨后的CHX作用又進一步抑制了卵內(nèi)新生的相關(guān)蛋白質(zhì)合成，使之不能產(chǎn)生新的CSF 和MPF，使MPF一直處于低水平，進一步促進了卵母細胞的活化。CHX引起的卵母細胞活化不是通過Ca2+波動起作用，而是通過抑制有關(guān)蛋白質(zhì)新的合成起作用9。Cyclin B 和P34cdc2分別是MPF的調(diào)節(jié)亞基和催化亞基。由于P34cdc2的含量在整個細胞周期中幾乎保持恒定的水平，而cyclinB則是隨著細胞周期的變化在不斷的變化，所以CyclinB就成了決定MPF活性的主要因素2。CyclinB在細胞間期開始合成，在G2/M達到高峰，M期結(jié)束即被水解

10、。CyclinB的合成與分解處于一種動態(tài)平衡中，諸如CHX等蛋白合成的抑制劑主要就是通過抑制CyclinB的合成來控制這種平衡的狀態(tài)，也就影響到卵母細胞處于M所必須的CSF和MPF的合成，最終致使MPF活性下降，引起卵母細胞的活化10?，F(xiàn)在的研究表明，在卵母細胞激活過程中，細胞膜內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一的蛋白激酶C(PKC) 通路也起著重要的作用，細胞膜上的4，5-二磷酸酯酰肌醇(PIP2)在磷酸二醋酶(PDE) 作用下水解為1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和1，2-二?；视?DAG)。IP3刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+庫釋放Ca2+，Ca2+和DAG共同刺激PKC，PKC磷酸化底物蛋白使其活化，與激活

11、和減數(shù)分裂有關(guān)的蛋白的活化導(dǎo)致卵母細胞激活和減數(shù)分裂的恢復(fù)11。3卵母細胞孤雌激活的方法 卵母細胞在IVM后可通過多種方法使其激活卵裂，由細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛?。按激活性質(zhì)可大致將小鼠卵母細胞孤雌激活的方法劃分為物理激活、化學(xué)激活和生物刺激法三類。物理激活包括：機械刺激，即卵母細胞的體外操作和穿刺處理；溫度刺激，即低溫和高溫處理;電刺激處理（后續(xù)將詳細闡述電刺激法）等?；瘜W(xué)激活包括:酶刺激如采用透明質(zhì)酸酶或鏈霉蛋白酶處理；滲透壓即低滲和高滲處理；離子如二價陽離子(Sr2+) 或離子載體(如A23187) 處理；麻醉劑，如全身麻醉和局部麻醉的藥物；乙醇處理;蛋白質(zhì)合成抑制劑(如放線菌酮即CHX)；蛋白磷

12、酸化抑制劑處理(如6一二甲氨基嘌呤即6一DMAP) 等。生物刺激，如精子提取物即精子因子等。最常用的是乙醇、電刺激、二價陽離子、蛋白合成抑制劑等12。31 卵母細胞的電激活 電刺激是目前應(yīng)用最廣泛的卵母細胞激活方式之一。電激活（亦稱電刺激）卵母細胞的原理是通過電脈沖激活卵母細胞。即在瞬間高壓直流電脈沖作用下，細胞膜被擊穿，使卵母細胞上生成可逆性的微小孔洞13，細胞內(nèi)外的離子和大分子物質(zhì)發(fā)生短暫性的流動，細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高產(chǎn)生膜的超極化反應(yīng)，皮質(zhì)顆粒（CG）釋放至卵周隙導(dǎo)致染色體解聚,啟動減數(shù)分裂器排出第二極體,原核形成 、卵裂發(fā)生及胚胎早期發(fā)育 。卵細胞電激活的深一層機理可以解釋為：細胞

13、Ca2+濃度的升高對成熟促進因子（maturation promating fator，MPF）和細胞靜止因子（cell static fator，CSF）活性的影響。正常情況下，MPF可實現(xiàn)細胞從間期到分裂期的轉(zhuǎn)變，成熟卵子受到對Ca2+敏感的CSF抑制作用而停留在第二次減數(shù)分裂中期（second meiometa phase MII），且CSF的這種作用是通過穩(wěn)定MPF的活性而實現(xiàn)的14。胞質(zhì)Ca2+濃度的升高使MPF和CSF水平下降或消失，從而引起卵子活化，促使卵母細胞離開MII期，完成減數(shù)分裂，從而激活卵母細胞15。通過控制電刺激參數(shù)，模擬正常受精過程Ca2+的節(jié)律性脈沖升高，可復(fù)制出

14、正常受精過程的一系列生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，啟動M期卵繼續(xù)成熟分裂，步入正常發(fā)育軌道。電刺激下卵母細胞電激活率與卵母細胞的卵齡、電場強度、脈沖持續(xù)時間及脈沖次數(shù)有關(guān)，但各種動物在這些參數(shù)上存在差異16。32 卵母細胞的乙醇和氯化鍶激活乙醇是發(fā)現(xiàn)較早的一種化學(xué)激活劑，其激活的原理是通過水解細胞膜上4，5二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）產(chǎn)生1，4，5三磷酸肌醇（IP3），誘發(fā)細胞內(nèi)源鈣釋放到細胞質(zhì)，提高了細胞胞內(nèi)的鈣濃度來實現(xiàn)(Machaty 等,1998)。此類激活劑可改變卵膜的穩(wěn)定性，使鈣庫的Ca2+釋放出來以及增加細胞外Ca2+的滲入。經(jīng)7%8%乙醇的培養(yǎng)液中培養(yǎng)57min后處理過的小鼠卵母細胞，與

15、精子受精一樣細胞內(nèi)Ca2+出現(xiàn)有規(guī)律地多次升高。在出現(xiàn)胞質(zhì)Ca2+變化的卵中，Ca2+脈沖升高次數(shù)不盡一致但波形相似；將其培養(yǎng)可形成原核，而未出現(xiàn)Ca2+升高反應(yīng)的卵母細胞不形成原核17。0neill等用氯化鰓(SrCI2)處理卵母細胞，Sr2+可進入鈣庫置換Ca2，使胞質(zhì)Ca2升高，引發(fā)一系列依賴Ca2的生理反應(yīng)，對卵起激活作用。關(guān)于Sr2+引發(fā)卵母細胞內(nèi)Ca2波動的報道多見于小鼠。后來發(fā)現(xiàn)Sr2+所引起的Ca2的波動持續(xù)時間較長。當聯(lián)合CHX處理小鼠卵母細胞時，孤雌激活胚的發(fā)育能力更好18。已經(jīng)有人證明,Sr2+的刺激能引起卵母細胞質(zhì)內(nèi) Ca2+發(fā)生多次波動性升高。這可能是在細胞內(nèi) Sr2

16、+不被消耗但同時又可模擬 Ca2+而誘發(fā)內(nèi)源性Ca2+的釋放，其誘發(fā)的 Ca2+波動與正常受精過程中Ca2+的波動極為相似， 盡管Sr2+ 可誘導(dǎo)卵母細胞的激活， 但對Sr2+作用的研究目前僅限于此19。33 卵母細胞的蛋白質(zhì)合成抑制劑的激活在蛋白質(zhì)類細胞因子如成熟促進因子(MPF) 和細胞靜止因子(CSF) 的作用下，卵母細胞分裂停滯在第二次成熟分裂中期(M)。這些因子對Ca2+十分敏感，當卵激活胞質(zhì)Ca2+升高到一定水平時，MPF和CSF 便失活或消失，使用蛋白質(zhì)合成抑制劑如離子霉素或亞胺環(huán)己銅等激活卵母細胞時，可直接抑制這些蛋白質(zhì)類細胞因子的合成，使卵母細胞從M期休止狀態(tài)解脫出來，恢復(fù)第

17、二次成熟分裂18。34 卵母細胞的鈣離子載體A23187和離子酶素(Ionomycin) 鈣離子載體(CaA)A23187主要通過胞質(zhì)內(nèi)Ca2+釋放來實現(xiàn)其激活功能20，同時還抑制蛋白的合成。因為卵母細胞在CaA處理后大多阻滯于帶有兩個極體的中期相，即Ml期，所以CaA常和CHX，6-DMAP聯(lián)合使用。 離子酶素 Ionomycin作為另一種鈣離子載體，也是通過動員鈣庫釋放Ca2+而發(fā)揮功能的。與乙醇相比，由于它僅動用鈣庫內(nèi)的Ca2+，所以引起的Ca2+波動較為平緩，因而效率更高。Ionomycin也常和6-DMAP聯(lián)合使用，在激活率、原核形成以及孤雌激活胚囊胚發(fā)育率上都有提高21。35 卵母

18、細胞的精子因子(SF或SOAF)有研究者利用精子的提取物(精子因子Sperm Factor)來激活卵母細胞， SF 在注入卵母細胞質(zhì)后可以觸發(fā)類似于自然受精時的連續(xù)性的Ca2+波動。在小鼠、豬、人上都可以取得激活效果22。精子引發(fā)Ca2+波動是由于多種物質(zhì)作用產(chǎn)生的結(jié)果，而SF的激活效果只與精子發(fā)育時間、品種和SF的提取過程有關(guān)。SF注射到卵母細胞后所引發(fā)的Ca2+波動與受精極為相似，且激活率高。但也有囊胚發(fā)育率不高的缺點，可能是由于注入時細胞的損傷，SF的污染、失活造成23。36其它Thioerosal(THI)是一種氧化劑，并不刺激產(chǎn)生IP3而是對IP3進行修飾，從而引發(fā)激活24。聯(lián)合Di

19、thiothreitol(DTT)后則可修正紡錘體的損傷。在豬卵母細胞上，THI處理后大部分可以排出第二極體；聯(lián)合DTT后，可刺激豬卵母細胞體細胞核移植胚發(fā)育至囊胚25。4卵母細胞孤雌激活的研究意義發(fā)展前景及存在的問題 進行卵母細胞激活是家畜顯微受精和細胞核移植的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，也是研究哺乳動物孤雌生殖及受精機制的重要手段之一。卵母細胞激活和孤雌發(fā)育與胚胎細胞核移植成功密切相關(guān)，因為移核后的卵母細胞的核物質(zhì)被胚胎細胞核所代替，移入的核物質(zhì)的復(fù)制等過程完全依賴于卵母細胞的激活。因此卵母細胞激活和孤雌胚發(fā)育的研究對于完善細胞核移植技術(shù)有著重要的意義和價值。 研究哺乳動物卵母細胞的激活及爾后的孤雌發(fā)育

20、，對了解哺乳動物早期胚胎發(fā)育有重要意義，有利于探索卵母細胞的生理反應(yīng)，分析理化激活與精子激活的特征，檢測孤雌胚與正常胚胎的蛋白質(zhì)合成，觀察孤雌胚與受精胚的嵌合和發(fā)育能力，分析雄性和雌性基因組在個體發(fā)育中的作用，有助于了解哺乳動物早期胚胎發(fā)育的機理，對闡明哺乳動物卵的激活、受精和發(fā)育機理，解答這些重要的生命現(xiàn)象及技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。利用卵母細胞的徽活及孤雌胚發(fā)育技術(shù)，達到建立生產(chǎn)孤雌哺乳動物品系的方法，從而為加速家畜育種進程提供有力的手段。 目前，有關(guān)哺乳動物孤雌激活的理論基礎(chǔ)還比較薄弱，一般生物化學(xué)的、細胞生物學(xué)的和分子生物學(xué)的研究正在進行之中。人們期待著立足于堅實的基礎(chǔ)理論研究，不斷地提

21、高誘導(dǎo)孤雌發(fā)育的效率。隨著這些研究的不斷深入和拓展，可以預(yù)料，人們能更廣泛地利用孤雌卵母細胞的激活及孤雌胚的發(fā)育技術(shù)，研究動物個體發(fā)育、細胞分化，并為核移植技術(shù)和動物克隆技術(shù)深入細致的研究奠定基礎(chǔ)，達到建立生產(chǎn)孤雌哺乳動物品系的方法，從而為加速家畜育種進程和其他生物工程的應(yīng)用提供有力地依據(jù)。正文1.材料與方法：1.1材料實驗動物購自大連醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心（合格證號:SCXK（遼）2004-0017）的68周齡, 體重2025g左右雌性昆明小白鼠，飼養(yǎng)在人工控溫（2224）和人工光照（6:0020:00光照, 20:006:00黑暗）條件下，自由飲水、采食，飼料為實驗試劑（1）孕馬血清促性腺激

22、素粉劑（PMSG）：寧波激素制品廠；（2）人絨毛膜促性腺激素粉劑（hCG）：寧波激素制品廠；（3）無Ca2+、Mg2+的PBS沖卵液：Sigma；（4）M2、KSOM；（5）礦物油、Hepes、BSA、甘露醇、透明質(zhì)酸酶等皆為Sigma產(chǎn)品。實驗儀器（1）細胞融合儀：ET-3,GOKU，日本富士平公司；（2）CO2培養(yǎng)箱；Galaxy B，RS Biotech；5500E，天美；4950E，天美；（3）體視顯微鏡：SMZ-168，Motic；（4）立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：LDZX-40B 型，上海申安醫(yī)療器械（5）自動三重純水蒸餾器：SZ-97，上海亞榮生化儀器廠；（6）恒溫板；（7）自制

23、的吸胚管；（8）培養(yǎng)皿：35mm；（9）1ml注射器；（10）電極針；（11）酒精燈；手術(shù)器械眼科鑷（2個）；眼科剪（2把）；大鑷子（2個）；殺鼠墊板(1個)1.2 方法實驗試劑的制備正式實驗開始前兩三天將M2、KSOM的配好備用，配制過程見附表，用去離子水配置，然后用分離式磁力加溫攪拌器振蕩至完全溶解，定容至100mL，經(jīng)0.22m的濾膜過濾除菌后，用封口膜封好瓶口，4下保存。培養(yǎng)液微滴的制備：用1mL注射器吸取培養(yǎng)液，在培養(yǎng)皿中制成小滴，用事先在37、5%CO2條件下平衡好的礦物油覆蓋，使用前放至37、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中平衡1h。小鼠卵母細胞的獲取M期卵母細胞通過超數(shù)排卵獲得。小鼠

24、于18:00腹腔注射孕馬血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG）5.0IU/只，48小時后注射同劑量的人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin hCG）；于次日早9:00（即hCG注射15h后）采用頸椎脫臼法處死小鼠，用酒精噴灑消毒后放置于已經(jīng)消毒過的實驗臺上解剖小鼠,無菌取出兩側(cè)的輸卵管，將取出輸卵管置于M2液中，在實體顯微鏡（Motic）下用一次性1mL注射器小心劃破小鼠輸卵管壺腹部，將卵丘-卵母細胞復(fù)合體（Cumulusenclosed Oocyte Complexes，COCs）輕輕擠出，用巴氏

25、吸管將收集的COCs移置于0.1%的透明質(zhì)酸酶并消化3-5分鐘，脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞，再經(jīng)M2液洗滌3次將裸卵（DO）移入置盛有電激液（electrical activation solution,EAS,由0.3mol/L甘露醇+0.01Mgcl2+0.1mmol/LCacl2+0.0119+0.05BSA組成）的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿放在上述培養(yǎng)箱中備用。1.2.3電激活處理小鼠卵母細胞將已在含有電激活液中培養(yǎng)了35分鐘的小鼠卵母細胞移置于體積約為50L的電激活液液滴中使用電激活儀（ET-3 GOKU,富士平公司Japan）作電激活處理。激活處理后的卵子用M2液清洗3次后移入KSOM培養(yǎng)皿

26、中，放在37 5%CO2和飽和濕度的培CO2養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)。1.3活化鑒定及記錄凡卵母細胞中出現(xiàn)1個原核1極體(1PN ,1PB) 2原核2極體(2PN ,2PB )、2原核1極體(2PN ,1PB )或2-細胞各具1個原核者, 均判定為被激活；卵質(zhì)膜破裂者判定為死亡；卵母細胞無明顯變化則全部歸為退化。活化后24h、48h、72h各觀察1 次, 記錄2-4細胞、8-16細胞、桑椹胚與囊胚的發(fā)育情況。1.4統(tǒng)計學(xué)分析以上每組實驗均重復(fù)3次。實驗所得資料采用SPSS統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗，對成熟率進行單因素方差分析，多重比較用鄧肯式法，以P>0.05時確定為差異不顯著,P<0.05

27、時確定為差異顯著，P<0.01時確定為差異極顯著；2.結(jié)果:2.1不同場強對小鼠卵母細胞電激活效果的影響小鼠卵母細胞經(jīng)不同場強,10s脈寬,1 次脈沖激活處理后放在KSOM中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h各觀察1 次, 記錄2-4細胞、8-16細胞、桑椹胚的發(fā)育情況見表1。表1：不同場強對小鼠卵母細胞電激活效果的影響Table 1 Effects of different pulse strength on the activation of mouse oocytes 場強（v/mm）Pulsestrength處理卵子數(shù)(n)NooocytesTreated激活數(shù)（%）Noacti

28、vation發(fā)育階段（%）development stage2-4細胞2-4cell8-16細胞8-16cell桑葚胚Morular16798(3)11.0±1.0（21.2）4.67±0.573.33±1.520.21±0.57183114(3)11.7±1.0（34.2）6.53±0.572.77±0.580.33±0.57200105(3)10.6±1.52（22.9）5.00±1.002.13±0.580從表1可以看出：場強為183V/mm、200V/mm時的激活率要高于167

29、V/mm,說明在一定范圍內(nèi)提高電激活的場強有利于卵母細胞的激活。但經(jīng)200V/mm的場強刺激過的小鼠卵母細胞2-4細胞、8-16細胞發(fā)育率都低于183V/mm時的發(fā)育率。這可能是由于過高的場強，使卵母細胞在激活中產(chǎn)生的微孔不能完全甚至不能恢復(fù)，引起卵母細胞胞體結(jié)構(gòu)的改變，從而影響了孤雌胚的后期發(fā)育。 2.2不同脈沖寬度對小鼠卵母細胞電激活效果的影響小鼠卵母細胞經(jīng)183V/mm場強,不同的脈寬,1 次脈沖激活處理后放在KSOM中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h各觀察1 次, 記錄2-4細胞、8-16細胞、桑椹胚與囊胚的發(fā)育情況見表2。表2：不同脈沖寬度對小鼠卵母細胞電激活效果的影響Table

30、2 Effects of different pulse width on the activation of mouse oocytes 脈沖寬度（s）Pulseduration處理卵子數(shù)(n)NooocytesTreated激活數(shù)（%）Noactivation發(fā)育階段（%）development stage2-4細胞2-4cell8-16細胞8-16cell桑葚胚Morular10104(3)(33±0.58)A（17.2）8.67±0.57（11.2）0.67±0.58（3.0）015117(3)(3±0.57)B（21.5）4.68±0

31、.57（5.4）0.33±0.57（1.3）020103(3)(67±4.92)B（11.6）3.00±1.00（2.1）0.33±0.57（0.8）0注：上表同一列中的不同大寫字母上標表示彼此間差異極顯著（p<0.01）相同字母上標表示彼此間差異不顯著（p>0.05）。 從表2可以看出：脈沖寬度為10s與脈沖寬度15s、20s下的卵母細胞激活數(shù)之間差異極顯著（p<0.01），脈沖寬度為15s時的激活率雖然略高于10s時激活率，但脈沖寬度為15s、20s時的2-4細胞及8-16細胞的發(fā)育率都要低于10s的脈寬；這說明一定范圍內(nèi)加大脈沖寬

32、度雖然可以增加被激活卵母細胞的數(shù)目，但對其的后期發(fā)育卻產(chǎn)生不利。2.3不同脈沖次數(shù)對小鼠卵母細胞電激活效果的影響小鼠卵母細胞經(jīng)183V/mm場強,10s 脈寬，分別經(jīng)1、2、3次脈沖激活處理后放在KSOM中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h各觀察1 次, 記錄2-4細胞、8-16細胞、桑椹胚與囊胚的發(fā)育情況見表3。 表3：不同脈沖次數(shù)對小鼠卵母細胞電激活效果的影響Table 3 Effects of different pulse warth on the activation of mouse oocytes 脈沖次數(shù)（n）NoPulse處理卵子數(shù)(n)NooocytesTreated激活數(shù)

33、（%）Noactivation發(fā)育階段（%）development stage2-4細胞2-4cell8-16細胞8-16cell桑葚胚Morular194(3)11.0±1.0（24.2）5.12±0.57（11.5）3.43±1.52（2.2）0299(3)6.33±1.15（47.6）5.67±0.57（12.2）2.31±0.58（1.6）03103(3)6.67±1.52（51.5）6.33±1.15（4.06）1.33±2.08（0.4）0從表3可以看出：2次及3次電脈沖的激活率明顯高于1次電

34、脈沖(P<0.01),說明多次脈沖有利于卵母細胞的激活。但經(jīng)3次電脈沖刺激過的小鼠卵母細胞的8-16細胞發(fā)育率要低于經(jīng)2次電脈沖過的卵母細胞。這可能是由于多次電脈沖對卵母細胞產(chǎn)生了損傷作用,導(dǎo)致后期發(fā)育率的下降。 說明多次脈沖雖然可以提高卵母細胞的激活率,但對起后期的發(fā)育不利。因此以在小老鼠卵母細胞的電激活中，使用2次電脈沖刺激較為合適。3.討論自然條件下,卵子的激活是由精子穿入刺激引起的。哺乳動物卵母細胞在受精過程中因精子的激活作用,使細胞內(nèi)的游離鈣呈現(xiàn)多次有規(guī)律的脈沖升高,刺激處于M期的卵母細胞完成減數(shù)分裂,排出第二極體,并繼續(xù)發(fā)育1。在單一方法的人工孤雌激活方法中，電激活還是目前被

35、使用較多的一種激活卵母細胞的方法,其原理是細胞在短暫高壓直流電脈沖的作用下,膜上的磷酸二酯雙分子的穩(wěn)定性發(fā)生改變,產(chǎn)生暫時的微孔,細胞內(nèi)外的離子和大分子可通過微孔進行交換,從而使細胞外Ca2+內(nèi)流。而電脈沖引起的微孔大小又受脈沖強度、寬度、脈沖寬度等因素的影響,因此電脈沖激活卵母細胞效率也受這些條件的影響25。Zimmermann U26研究發(fā)現(xiàn),脈沖寬度和電場強度之間存在互補關(guān)系,即降低電場強度,則需要延長脈沖時間來彌補;而且穿孔的效率往往與電場強度和脈沖寬度的乘積成正比,但對其解釋仍很不完全。Onodera M 和Tsunoda Y27研究證實,場強1.5kV/cm、持續(xù)時間25s 二次脈

36、沖刺激注射hCG后17h的小鼠卵母細胞,其激活率僅為19% ,但把持續(xù)時間增加到150s 時,激活率達到79%;而當場強增加到2.5kV/cm 時,持續(xù)時間僅為50s 就可獲得85%的活化率。為了簡化實驗程序, 本研究先在10s 的脈寬一次脈沖條件下,采用167V/mm200V/mm范圍的場強對小鼠的卵母細胞進行刺激,結(jié)果表明,卵母細胞激活率隨電場強度在一定范圍內(nèi)的增加而明顯上升, 這可能是由于強的電刺激引起強的Ca2+內(nèi)流,進而引發(fā)了更強的激活信號所致28。但張德福等29研究表明當場強增加到2.5kV/cm時,激活率和卵裂率有下降的趨勢,這可能是因為電場強度過大,會使細胞膜上電激造成的孔洞不

37、可逆,大量的Ca2+內(nèi)流,細胞內(nèi)Ca2+濃度過高。高濃度的Ca2+會導(dǎo)致細胞內(nèi)染色體的解離,核和染色體的不正常構(gòu)建,從而致使卵母細胞死亡率增加,細胞受到損傷,活化率下降。譚景和等30在2.0kV/cm的最佳場強一次脈沖條件下,采用40s150s大范圍的脈寬對小鼠卵母細胞進行刺激。結(jié)果表明:確定場強的情況下,激活率隨脈沖時程的延長而升高,但脈沖時程過長或場強過高,則導(dǎo)致卵母細胞退化、死亡增多。卵母細胞內(nèi)Ca2+濃度升高是卵母細胞被激活的初始信號。而Ca2+ 濃度變化對電刺激反應(yīng)敏感。鄒賢剛等14研究表明,單次電刺激可引起卵母細胞內(nèi)出現(xiàn)一次Ca2+波動,經(jīng)5 min6 min 后又降至基礎(chǔ)濃度,而

38、不像精子或某些化學(xué)試劑那樣誘導(dǎo)卵內(nèi)Ca2+多次升高。多次電刺激可以誘導(dǎo)卵內(nèi)Ca2+多次升高,而且多次瞬時高壓電擊可使卵母細胞膜上間斷性地形成很多可恢復(fù)的微小孔洞,介質(zhì)或鈣庫內(nèi)的Ca2+通過小孔進入胞質(zhì),使細胞內(nèi)Ca2+呈脈沖式升高。VitulloA D 等31模擬小鼠正常受精中Ca2+出現(xiàn)的33次升高,使用33次不同參數(shù)的電刺激,獲得幾乎100%的激活率,他們認為,多次電脈沖能引發(fā)鈣離子多次內(nèi)流,較真實地模仿了精、卵融合激發(fā)的卵內(nèi)Ca2+的波動。本試驗的結(jié)果也表明,2次脈沖連續(xù)刺激（脈沖間隔50ms）與一次脈沖刺激相比,可顯著（P<0.01）提高了小鼠卵母細胞的激活。4.結(jié)論：在前人實驗

39、的基礎(chǔ)上，本實驗中對影響小鼠卵母細胞電激活效果的幾個主要因素進行了比較，從實驗中所得數(shù)據(jù)可以看出當場強為183v/mm、脈沖寬度10s、2次脈沖（脈沖間隔為50ms）刺激對小鼠卵母細胞電激活效果相對較好，然而影響卵母細胞激活率的因素很多，而且任何一種因素都不可能獨立存在,都是與其他因素相關(guān)聯(lián)而起作用的。在對小鼠卵母細胞的電激活的研究中，目前在國內(nèi)還沒有關(guān)于使用ET-3GOKU電激活儀對小鼠卵母細胞電激活的報道，所以，本實驗中的結(jié)果僅供參考。參考文獻1范必勤,鄧滿齊.哺乳動物卵的激活與孤雌發(fā)育.生物工程進展,1994,14:50-54.2Kaufman MH.Early mammalian de

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