30免疫熒光實驗3

1、第六講免疫熒光組化技術主要內(nèi)容一、熒光的特征二、熒光素三、熒光素標記抗體的方法四、熒光抗體的質量鑒定 五、免疫熒光組化染色方法六、熒光顯微鏡七、非特異性熒光的消除方法八、激光掃描共聚焦顯微鏡思考題：1.什么叫熒光？2.常用熒光素有哪些特征？3.標記熒光抗體有哪二種主要的方法？4.免疫熒光組化直接法、間接法的原理和主要操作流程？5.觀察熒光組化片時應注意哪些問題？6.非特異性熒光的消除方法有哪幾種？一、熒光的特征都含有電子，電子在不停地運動著。根據(jù)量子理論，運動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應的特定能量的吸收或。激

2、發(fā)當電子吸收能量躍遷到較高能級，這個過程叫激發(fā)。發(fā)射以輻身方式躍遷時，能量轉化成相應波長的光，這個過程叫發(fā)射。熒光躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻身方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。二、熒光素能夠產(chǎn)生熒光并能作為的化合物稱為熒光色素，必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。1、具備用于標記抗體的熒光素條件(1)應具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團，結合后不易離解，而未結合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。(2)熒光效率高，與蛋白質結合后熒光素質量下降不多。(3)標記后對抗體的免疫學性質和生化性質無影響。(4)結

3、合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。(5)熒光素容易溶解，溶解后和其他物質發(fā)生化學反應。(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結果。2.熒光素的種類(1)異硫酸熒光黃（FITC）：量390D，最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為520530nm。呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，量389.4。(2)四甲基異硫酸羅達明（TRITC）是羅達明的衍生物，易溶于水，最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈橙紅色熒光。(3)四乙基羅達明(RB200)呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和，性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596600nm，呈明亮橙紅色熒光，量580

4、，RB200不能直接和蛋白質結合，要先經(jīng)五氯化磷反應，轉化成硫酰氯，再與蛋白質的氨基結合。(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-異硫酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克薩斯紅（Texasred）(7)藻紅蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）三、熒光素標記抗體的方法(一)FITC標記抗體的方法1.Marsshall法(1)原理：當FITC在堿性溶液中與抗體反應時，主要是抗體上的賴氨酸-氨基與FITC上硫碳胺鍵結合，一個IgG中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結合1520個。熒光素FITC-NCS N-蛋白質HHFITC- N C N - 蛋白質SHH(2

5、)操作流程抗體與熒光素比例為50-100:1抗體的準備：20mg/ml，碳酸鹽緩沖液為總量的1/10。熒光素的準備：用分析天平準確稱取0.01mgFITC/1mg抗體。結合：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中。透析過柱保存Sephade×G50或G254-40等量甘油分裝保存。2. Chadwick法3. 改良法4. 透析標記法（二）四乙基羅達明標記抗體方法（三）藻紅蛋白標記抗體方法四、熒光抗體的質量控制主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。1.特異性染色效價測定2.非特異性染色測定3.吸收試驗4.F/P比值的測定方法五、免疫熒光組織化學染色方法1.直接法簡便、快速，用已知特異性標

6、記熒光的一抗與組織細胞內(nèi)抗原結合。操作流程：(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，消化30min，PBS洗。(2)適當稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37溫育1h，PBS洗3×3min。(3)0.01%伊文氏藍襯染13min，PBS洗3×3min，蒸餾水洗2次，除去Nacl結晶。(4)pH9.0緩沖甘油封片。(5)鏡檢2.間接法是直接的重要改進，先用標記的已知特異性一抗與組織細胞內(nèi)抗原結合，隨后用間接熒光標記二抗與一抗特異性結合。操作流程(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干后PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。(2)適當稀

7、釋特異性一抗，37孵育1h，或室溫4h，或4過夜，PBS洗3×3min。(3)熒光標記二抗適當稀釋3730min，PBS洗3×3min。(4)0.01%伊文氏藍襯染13min，PBS洗3×3min。(5)封片，鏡檢。六、熒光顯微鏡檢查方法1.熒光顯微鏡熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學的基本工具。它是由超高壓光源，濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)，光學系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光。(1)光源光源的亮度應根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率燈可滿足激勵一般熒光染料的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓燈。其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸

8、發(fā)，經(jīng)過515min，球內(nèi)氣壓升至5070標準大氣壓，此時達到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。(2)濾片系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光效應的前提和必要條件。濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中性濾片。熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片用途UDM400BP330-385 BP360-370 BP400-410BP400-440BP420-440BA420自動熒光觀察法，DAPI(聯(lián)脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342兒茶酚胺觀察芥子喹吖

9、因；硫磺素S：淋巴細吖淀黃素異硫吖啶橙：DNA，RNA 金胺結核桿菌VBVDM455DM455BA455BA475BDM500BP450-480 BP470-490 BP420-480 PB460-490 BP470-490 BP510-550 BP530-550 BP480-550 BP520-550BP545-580BA515IBDM505BA515IFGDM570BA590羅丹明四甲基羅丹明異硫碘化丙啶：DNA酸鹽：熒光抗體觀察IGDM565DM600BA580IFBA610IF德克薩斯紅：熒光抗體觀察2.標本制作要求(1)載玻片厚度應在0.61.2mm之間(2)蓋玻片應光潔，厚度在0.

10、17mm左右(3)標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激分。(4)封片劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/LpH9.09.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑。熒光信號增強封片劑mowiol40-884.8g甘油12ml蒸餾水12ml0.2mol/LTris(pH8.5)24ml上述混合（加熱溶解），5000g離心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)，終濃度2.5%(約1.25g)，溶解后，分裝存于-20中。(5)鏡油3.使用熒

11、光顯微鏡注意事項(1)嚴格按說明書操作，不要隨意改變程序。(2)應在暗室中進行檢查。(3)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應戴上防護眼鏡。(4)檢查時間每次以12h為宜，超過90min，超高壓燈強度逐漸下降，熒光減弱。(5)熒光顯微鏡光源有限，標本應集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。光源關閉后必須在30min后才能再啟動光源，一天中應避免數(shù)次點燃光源。(6)標本染色后應立即觀察。(7)熒光高度的判斷標準，分四級“”為，“”為僅能見明確可見的熒光；“”為可見有明亮的熒光；“”為可見耀眼的熒光。七、非特異性染色的消除方法根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當?shù)姆椒ǎＳ梅椒ǎ?1.動物臟器粉末吸收法2.透析法3

12、.SephadexG-50柱層析法4. DEAE纖維素柱層析法5. 熒光抗體稀釋法6. 純化抗原方法7. 純化抗體方法8. 伊文氏藍襯染方法：0.01%伊文氏藍八、激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是80年代發(fā)展起來的一項具有劃意義的高科技新。實現(xiàn)了對細胞內(nèi)部非侵入式光學斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進行到立體，斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，在生命科學研究中得到迅速應用。1.儀器構成(1)計算機系統(tǒng)：控制著機械，光學、聲學系統(tǒng)及各種設備。(2)激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)器。

13、(3)顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。(4)檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件組成。(5)XY平臺(6)Z-軸步進馬達2.共聚焦成像原理激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光的擴束和整形，變成一束直徑較大的平行 光束，長通分色光鏡使光束偏轉90度， 經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品 中的熒光物質在激光的激發(fā)下發(fā)出沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡，長通分色反射鏡，聚焦透鏡，會聚在聚焦透鏡的焦點外，經(jīng)過焦點處的針孔，由檢測器接收并轉變成電信號。3.光信號接收和成像方式(1)光信號接收生物樣品發(fā)出的熒光通常有二種接收方式：由光電倍增管（PMT）把光信號轉變成電信號；利用電荷耦合器（CCD）把

14、光信號轉變成電信號。(2)成像方式載物臺運動成像：以直徑很小的激光束照射樣品，照射點發(fā)出的熒光信號經(jīng)PMT變成電信號，然后載物臺移動到下一點，該點的熒光強度。該方法無軸向像差，成像時間長；反射掃描成像方式，通過轉動反射鏡使激光連續(xù)照射樣品，由CCD攝像機下照射點所發(fā)射的熒光，成像速度快。4.參數(shù)的選擇基本參數(shù)：Confocal,pinhole,detector,PMT,Stepsize,Xpoints,YPoints,scanstr,speed,LaserPwr,Autozoom,Display,BRsubval,Samples/pt等5.性能特點：分辨率高，靈敏度高，掃描速度快，掃描范圍大，

15、圖像存取方便，可進行光切片的觀察，可進行定量熒光分析。6.應用(1)組織光學切片可對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的系列“光學切片”，得到其各層面的信息-“顯微CT”。(2)三維圖像重建(3)細胞物理和生物化學測定(4)熒光的定量、分析(5)Ca2+、pH及其他細胞內(nèi)離子的實時定量測定(6)粘附細胞的分選(7)激光細胞顯微外科及光陷阱技術(8)熒光光漂白恢復（FRAP）技術(9)胞間通訊的研究(10)細胞膜性測定(11)光活化技術實免疫熒光組化間接法µ1.4m石蠟切，58烤，18h。2.常規(guī)脫蠟至水（二甲苯、各10min，無水乙醇，95乙醇，85乙醇，75乙醇各2min）。3.PBS洗（磷酸鹽緩沖液0.01mol/LpH7.4）3×3min。4.0.1%胰蛋白