熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)及熒光染色PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品Olympus熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，擦鏡紙，吖啶橙染料等實(shí)驗(yàn)用材料。第1頁(yè)/共17頁(yè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、熒光顯微鏡的成像原理一、熒光顯微鏡的成像原理二、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)二、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)三、熒光顯微鏡的使用方法三、熒光顯微鏡的使用方法四、觀察動(dòng)植物細(xì)胞的自發(fā)熒光四、觀察動(dòng)植物細(xì)胞的自發(fā)熒光和繼發(fā)性熒光和繼發(fā)性熒光第2頁(yè)/共17頁(yè)一、顯微鏡的成像原理一、顯微鏡的成像原理 熒光顯微鏡是利用一定波長(zhǎng)的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生不同顏色的熒光，以用來(lái)觀察和分辨樣品中某些化學(xué)成分和細(xì)胞組分的一種顯微鏡。自發(fā)熒光自發(fā)熒光: 組織、細(xì)胞不經(jīng)熒光色素染色，在紫外光照射下，某

2、些成分所呈現(xiàn)的熒光，稱為自發(fā)熒光 。繼發(fā)性熒光繼發(fā)性熒光: 組織、細(xì)胞經(jīng)熒光色素染色，由于熒光色素和組織細(xì)胞內(nèi)的某種成分結(jié)合后而呈現(xiàn)的熒光為繼發(fā)性熒光 。第3頁(yè)/共17頁(yè)二、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和光路二、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和光路圖圖1. 基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu): 光源：光源：超高壓汞燈,用以產(chǎn)生強(qiáng)光照(含大量紫外光 ,藍(lán)紫光) 濾片系統(tǒng)濾片系統(tǒng): 激發(fā)濾色鏡，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光 . 阻斷濾色鏡 ,透過(guò)相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的熒光 ,阻斷 或吸收剩余激發(fā)光 . 二向分色鏡，透射長(zhǎng)波光線和反射短波光線的功能 . 熒光物鏡熒光物鏡普通顯微鏡普通顯微鏡第4頁(yè)/共17頁(yè)熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)圖熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)圖第5頁(yè)/共

3、17頁(yè)熒光顯微鏡的光路圖熒光顯微鏡的光路圖第6頁(yè)/共17頁(yè)三三 熒光顯微鏡的使用方法熒光顯微鏡的使用方法1.汞燈的安裝汞燈的安裝: 切斷電源切斷電源 ,從插座上拔下電源線從插座上拔下電源線 . 開(kāi)啟燈室開(kāi)啟燈室 ,將汞燈安裝到燈架上將汞燈安裝到燈架上 . 嚴(yán)防手指觸摸燈管嚴(yán)防手指觸摸燈管 ,特別是中心球狀部分特別是中心球狀部分,以免污染以免污染 汞燈裝入燈室汞燈裝入燈室 ,封上燈室蓋后封上燈室蓋后 ,方可按通方可按通電源電源 .（一）熒光顯微鏡的調(diào)整方法（一）熒光顯微鏡的調(diào)整方法第7頁(yè)/共17頁(yè)2. 汞燈的點(diǎn)亮汞燈的點(diǎn)亮: 確信各連接部分皆處于正常狀態(tài) 接通啟動(dòng)器電源開(kāi)關(guān) ,按下起動(dòng)鈕 ,汞燈

4、點(diǎn)亮 ,經(jīng)2-3min ,電弧趨于穩(wěn)定 . 點(diǎn)亮后 15min內(nèi) ,勿切斷電源 ,一旦汞燈熄滅 ,在5min或稍長(zhǎng)時(shí)間內(nèi) ,不許重新點(diǎn)亮 ,待汞燈冷卻后 ,始能再次點(diǎn)亮 .第8頁(yè)/共17頁(yè)3. 汞燈的調(diào)中汞燈的調(diào)中: 開(kāi)啟光閥開(kāi)啟光閥 . 開(kāi)放孔徑光闌和視場(chǎng)光闌至最大開(kāi)度開(kāi)放孔徑光闌和視場(chǎng)光闌至最大開(kāi)度 ,即即“Min” - “Max” . 旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器 ,無(wú)物鏡的空洞進(jìn)入光無(wú)物鏡的空洞進(jìn)入光路路, 旋下防塵蓋光線射向鏡臺(tái)旋下防塵蓋光線射向鏡臺(tái) . 載物臺(tái)上放一白紙載物臺(tái)上放一白紙 ,讓汞燈電弧像投在讓汞燈電弧像投在其上其上 . 用燈室外的聚焦桿用燈室外的聚焦桿 ,使電弧像在白

5、紙上使電弧像在白紙上聚焦，并用調(diào)中螺釘聚焦，并用調(diào)中螺釘 ,調(diào)中汞燈。調(diào)中汞燈。第9頁(yè)/共17頁(yè)4.4.濾色鏡系統(tǒng)的配合使用濾色鏡系統(tǒng)的配合使用: : 該熒光顯微鏡具激發(fā)濾色鏡 ,阻斷濾色鏡和二向色鏡等。第10頁(yè)/共17頁(yè)5. 5. 樣品聚焦樣品聚焦: : 經(jīng)熒光染料染色的樣品放在載物臺(tái)上經(jīng)熒光染料染色的樣品放在載物臺(tái)上 , ,先用溴鎢燈透先用溴鎢燈透射照明射照明 , ,用低倍物鏡聚焦用低倍物鏡聚焦 , ,待尋找到最佳影像后待尋找到最佳影像后 , ,熄滅溴熄滅溴鎢燈改用汞燈鎢燈改用汞燈 . . 點(diǎn)亮汞燈點(diǎn)亮汞燈 , ,嵌入系統(tǒng)濾色鏡嵌入系統(tǒng)濾色鏡 使用使用 UVFL 40X(Oil)UVFL

6、40X(Oil)和和 UVFL 100X(Oil) UVFL 100X(Oil) 油浸物鏡油浸物鏡 , ,應(yīng)用無(wú)熒光浸油應(yīng)用無(wú)熒光浸油 , ,物鏡的內(nèi)裝可變光闌應(yīng)適當(dāng)縮小物鏡的內(nèi)裝可變光闌應(yīng)適當(dāng)縮小 , ,以增以增大影像反差和清晰度大影像反差和清晰度 . . 在在UVFL 40X(dry)UVFL 40X(dry)物鏡內(nèi)裝有校正環(huán)物鏡內(nèi)裝有校正環(huán) , ,對(duì)較薄或較厚的對(duì)較薄或較厚的蓋片進(jìn)行球面校正蓋片進(jìn)行球面校正 .第11頁(yè)/共17頁(yè)6.縮小光闌開(kāi)度縮小光闌開(kāi)度 視場(chǎng)光闌視場(chǎng)光闌(F)和孔徑光闌和孔徑光闌(A)的開(kāi)度的開(kāi)度 ,在觀察樣品在觀察樣品時(shí)應(yīng)朝時(shí)應(yīng)朝“Min”向轉(zhuǎn)動(dòng)向轉(zhuǎn)動(dòng) ,使其適當(dāng)縮

7、小使其適當(dāng)縮小 .7.光閥的使用光閥的使用 在熒光觀察暫短中止時(shí)在熒光觀察暫短中止時(shí) ,可用光閥阻斷光路可用光閥阻斷光路 ,勿勿 熄滅汞燈熄滅汞燈 ,以免減短其使用壽命以免減短其使用壽命 .第12頁(yè)/共17頁(yè)（二）熒光鏡檢樣品的制作（二）熒光鏡檢樣品的制作1. 不能使用本身能產(chǎn)生熒光的藥劑不能使用本身能產(chǎn)生熒光的藥劑2. 切片標(biāo)本不能太厚切片標(biāo)本不能太厚3. 因石蠟可產(chǎn)生青色熒光，采用石蠟制片時(shí)，脫蠟因石蠟可產(chǎn)生青色熒光，采用石蠟制片時(shí)，脫蠟必須徹底。切片進(jìn)入水后，應(yīng)充分水洗，再經(jīng)熒光必須徹底。切片進(jìn)入水后，應(yīng)充分水洗，再經(jīng)熒光染料處理。染料處理。4. 最好采用螢石玻璃制成的載玻片、蓋玻片。最好采用螢石玻璃制成的載玻片、蓋玻片。5. 封片時(shí)可采用甘油等無(wú)熒光的封固劑。封片時(shí)可采用甘油等無(wú)熒光的封固劑。第13頁(yè)/共17頁(yè)材料材料: 藻類藻類, 鴨趾草下表皮鴨趾草下表皮, 動(dòng)物結(jié)締組動(dòng)物結(jié)締組 織織, 血血細(xì)胞細(xì)胞, 花粉花粉. 染液染液: 0.01%丫啶橙染液丫啶橙染液.觀察藻類，鴨趾草下表面葉綠體的自發(fā)熒光觀察藻類，鴨趾草下表面葉綠體的自發(fā)熒光丫啶橙染花粉丫啶橙染花粉, 血細(xì)胞血細(xì)胞, 疏松結(jié)締組織。疏松結(jié)締組織。四、觀察動(dòng)植物細(xì)胞的自發(fā)熒光和四、觀察動(dòng)植物細(xì)胞的自發(fā)熒光和繼發(fā)性熒光繼發(fā)性熒光第