第十四章DNA的生物合成

1、目目 錄錄DNA的生物合成的生物合成( 復制復制 )DNA Biosynthesis Replication 第第 十四十四 章章作 者 : 王王 英英 聯(lián)系電話目目 錄錄復制復制親代親代DNA子代子代DNA第一節(jié)第一節(jié) DNADNA復制的基本特征復制的基本特征目目 錄錄密度梯度實驗密度梯度實驗 實驗結果支持實驗結果支持半保留復制半保留復制的設想。的設想。含重氮含重氮-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結果梯度離心結果目目 錄錄子代子代DNA與親代與親代DNA A的的堿基序列一

2、致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的遺傳的保守性保守性。即復制的高保真性即復制的高保真性 半保留復制的意義：半保留復制的意義：遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但但不是絕對的不是絕對的。目目 錄錄 原核生物原核生物的的基因組基因組是是環(huán)狀環(huán)狀的的， DNA復制時復制時從起始點從起始點(origin)(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制雙向復制。 oriterA B C目目 錄錄兩個相鄰起始點之間的距離為一

3、個兩個相鄰起始點之間的距離為一個復制子復制子 。復制子是獨立完成復制的復制子是獨立完成復制的功能單位功能單位。 53oriorioriori535533復制子復制子 真核生物真核生物每個染色體有每個染色體有多個起始點多個起始點，是，是多多復制子復制子的復制。的復制。目目 錄錄3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 前導鏈前導鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)三、復制的半不連續(xù)性三、復制的半不連續(xù)性岡崎片段岡崎片段目目 錄錄復復制制的的基基本本規(guī)規(guī)律律二、二、 呈雙向復制呈雙向復制目目 錄錄 DNA復制的酶學復制的酶學 The Enzymo

4、logy of DNA Replication第二節(jié)第二節(jié)目目 錄錄參與參與DNA復制的物質：復制的物質： 底底 物物 (substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 簡寫簡寫 DNA-polDNA-pol （DNA指導的指導的DNA聚合酶）聚合酶） ( 縮寫縮寫DDDP) 模模 板板 (template) : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈母鏈引引 物物 (primer): RNA片段，提供片段，提供3 -OH末端，末端， 使使dNTP能聚合上能聚合上. 其他的酶類和蛋白質因子其他的酶類和

5、蛋白質因子目目 錄錄 三種三種酶均有酶均有53 的聚合活性和的聚合活性和 3 5核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。DNA-polDNA-pol還有還有5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性，能切除突變的能切除突變的 DNADNA片片段和段和RNARNA引物。引物。4 4250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I亞基亞基 組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol II-pol I（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶10105 3 聚合活性聚合活性 + + + + + + 3 5外切酶活性外

6、切酶活性+ + + +5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性+ +_ _ _功功 能能除除引物、修復引物、修復損傷修復損傷修復復制復制1目目 錄錄5 G G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 錄錄目目 錄錄（二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶填補引物填補引物

7、空隙，切空隙，切除修復，除修復，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復復制制低保低保真度真度的復的復制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填補引物填補引物空隙，切空隙，切除修復，除修復，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復復制制低保低保真度真度的復的復制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸

8、外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol目目 錄錄1.嚴格嚴格遵守堿基配對的規(guī)律；遵守堿基配對的規(guī)律；A=T , G C2. 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；3. 復制出錯時復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。的及時校讀功能。DNA復制保真性的機制復制保真性的機制 二、復制的保真性二、復制的保真性復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本保證。傳信息能準確傳代的基本保證。目目 錄錄三、三、 DNA的解鏈及分子拓撲學變化的

9、解鏈及分子拓撲學變化 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把部，只有把DNA解成單鏈，暴露堿解成單鏈，暴露堿基，它才能起模板作用。基，它才能起模板作用。目目 錄錄（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白結合蛋白理順理順DNA鏈鏈拓撲異構酶拓撲異構酶 (gyrA, B)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)運送和協(xié)同運送和協(xié)同DnaBDnaC (dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨認起始點辨認起始點DnaA (dna

10、A)蛋白質（基因）蛋白質（基因）通用名通用名功能功能原核生物復制起始的相關蛋白質原核生物復制起始的相關蛋白質目目 錄錄拓撲異構酶拓撲異構酶：切斷：切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接供能，連接斷端，斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。分子進入負超螺旋狀態(tài)。、分分 類類：拓撲異構酶拓撲異構酶；拓撲異構酶；拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶 ：切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股鏈一股鏈，使，使DNA解鏈旋轉解鏈旋轉時時不致打結；適當時候封閉切口，不致打結；適當時候封閉切口，使使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應變?yōu)?/p>

11、松弛狀態(tài)。反應不需不需ATP。、作用機制及特點、作用機制及特點 ： （二）（二）DNADNA拓撲異構酶拓撲異構酶目目 錄錄HO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP5353目目 錄錄四、四、DNA連接酶連接酶 將將DNADNA片段片段3 3 -OH-OH末端和相鄰末端和相鄰DNADNA片斷片斷5 5 -P-P末端連末端連接，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的接，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNADNA片段連接成鏈。片段連接成鏈。目目 錄錄DNA生物合成過程生物合成過程The Process of DNA Replication第三節(jié)第三節(jié)目目 錄錄（一）復制的起始（

12、一）復制的起始需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA合成合成 目目 錄錄E.coli復制起始點復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 2

13、45 串聯(lián)重復序列串聯(lián)重復序列 反向重復序列反向重復序列5 3 5 3 1. DNA解鏈（特定位點）解鏈（特定位點）( (識別區(qū)識別區(qū)) )(A.T (A.T 區(qū)區(qū)) )目目 錄錄 Dna A Dna B、 Dna CSSB3 5 3 5 DnaADnaA 、 DnaBDnaB、 DnaCDnaC蛋白和蛋白和DNA復制起復制起始區(qū)域結合并解開始區(qū)域結合并解開DNA目目 錄錄 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構酶拓撲異構酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引發(fā)體和引物的形成引發(fā)體和引物的形成含有解螺旋酶（含有解螺旋酶（ Dna B ）、）、DnaC蛋白、引物蛋白、引物酶和酶

14、和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體引發(fā)體。 目目 錄錄3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子，分子，長度長度 為十幾至幾十個核苷酸不等。為十幾至幾十個核苷酸不等。引物引物3 HO5引物引物酶酶目目 錄錄（二）復制的延長（二）復制的延長復制的延長指在復制的延長指在DNA-pol III催化下，催化下，以以dNTP為原料為原料以以dNMP的方式逐個加入引的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。二酯鍵的不斷生成。 目目 錄錄5 5dATPdGTPdTTPdCT

15、PdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 錄錄3355復復制制過過程程簡簡圖圖目目 錄錄目目 錄錄 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制到終止點，雙向復制到終止點(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復制的終止（三）復制的終止目目 錄錄5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接目目 錄錄 mppi目目 錄錄復制聚合反應的特點：復制聚合反應的特點：1、 DNA復制復制需需模板

16、、引物模板、引物和和酶酶類類2、新鏈的延長沿、新鏈的延長沿 5 3 方向進行方向進行 33 5 4、3 ， 5 目目 錄錄哺乳動物的哺乳動物的細胞周期細胞周期DNA合成期合成期G1G2SM第四節(jié)第四節(jié) 真核生物的真核生物的DNA生物合成生物合成 目目 錄錄 1、 每個染色體每個染色體有多個起始點有多個起始點，是，是多復制多復制子子復制。復制。復制有時序性復制有時序性，即復制子起動不同步。，即復制子起動不同步。 2、復制的起始、復制的起始DNA-pol（引物酶）和（引物酶）和DNA-pol（解螺旋酶）參與，還需拓撲酶和（解螺旋酶）參與，還需拓撲酶和復制因子復制因子( RF)。 3、在復制叉和引物

17、形成后、在復制叉和引物形成后DNA-pol替換替換DNA-pol。一、真核生物復制起始的特點一、真核生物復制起始的特點目目 錄錄3 5 5 3 領頭鏈領頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物核小體核小體二、復制的延長二、復制的延長（真核生物延長特點）（真核生物延長特點） 目目 錄錄1、染色體、染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。呈線狀，復制在末端停止。2、岡崎片段連接成鏈。、岡崎片段連接成鏈。3、染色體兩端、染色體兩端DNA子鏈上最后去除子鏈上最后去除RNA引物后留引物后留下空隙，由端粒酶和下空隙，由端粒酶和DNA-pol共同完成。共同完成。三、復制的終止三、復制的終止目目 錄

18、錄逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第五節(jié)第五節(jié)目目 錄錄逆轉錄酶逆轉錄酶(reverse transcriptase) 逆轉錄逆轉錄(reverse transcription) 逆轉錄逆轉錄酶酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶 目目 錄錄逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象RNA 模板模板逆轉錄酶逆轉錄酶DNA-RNA 雜雜化雙鏈化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉錄酶逆轉錄酶雙鏈雙鏈DNA目目 錄錄逆轉錄酶逆轉錄酶 A AA A T T T TA

19、AAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T分子生物學研究可應用逆分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法稱為稱為cDNA法。法。 以以mRNA為模板，經(jīng)逆轉為模板，經(jīng)逆轉錄合成的與錄合成的與mRNA堿基序列互堿基序列互補的補的DNA鏈。鏈。 試管內合成試管內合成cDNAcDNA complementary DNA mRNAmRNA目目 錄錄二、逆轉錄研究的意義二、逆轉錄研究的意義 逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。的重大

20、發(fā)現(xiàn)。 逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究，拓寬了對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意世紀初已注意到的到的病毒致癌理論病毒致癌理論。 目目 錄錄DNA損傷（突變）與修復損傷（突變）與修復DNA Damage (Mutation) and Repair第五節(jié)第五節(jié)目目 錄錄遺傳物質的遺傳物質的結構改變結構改變而引起的遺傳而引起的遺傳信息改變，稱為信息改變，稱為突變突變。在復制過程中發(fā)生的在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為突變稱為DNA損傷損傷(DNA damage)。從分子水

21、平來看，突變就是從分子水平來看，突變就是DNA分分子上堿基的改變。子上堿基的改變。 目目 錄錄一、突變的意義一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎 目目 錄錄二、引發(fā)突變的因素二、引發(fā)突變的因素因素因素自發(fā)因素自發(fā)因素 (突變發(fā)生的頻率為突變發(fā)生的頻率為10-9) 物理因素物理因素 （ 紫外線、各種輻射紫外線、各種輻射）化學因素化學因素（自由基、亞硝酸鹽、添加劑自由基、亞硝酸鹽、添加劑） 生物因素生物因素（逆轉錄

22、病毒或其他病毒逆轉錄病毒或其他病毒）目目 錄錄三、突變的分子改變類型三、突變的分子改變類型錯配錯配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) 突變突變類型類型 DNA分子上一個堿基的分子上一個堿基的突變突變稱稱點突變點突變 DNA分子上多個堿基的分子上多個堿基的突變突變稱稱復點突變復點突變目目 錄錄發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 轉換轉換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶發(fā)生在異型堿基之

23、間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤?；蜞奏ぷ冟堰?。 2. 顛換顛換（一）錯配（一）錯配 目目 錄錄鐮形紅細胞貧血病人鐮形紅細胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈CAC GUG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亞基亞基N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈肽鏈CTC GAG基因基因DNADNAmRNAmRNADNADNAmRNAmRNA目目 錄錄（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到到DNA大分子中間。大分子中間?？蛞仆蛔兛蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。 缺失或插入都可導致缺失或插入都可導致框移突變框移突變 。目目 錄錄谷谷 酪酪 蛋蛋 絲絲5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 纈纈 組組 纈纈正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突變缺失引起框移突變目目 錄錄（三）重（三）重( (組組)