藥物分析 第十六章藥品質(zhì)量控制中的現(xiàn)代分析方法與技術(shù)

1、第十六章第十六章 藥品質(zhì)量控制中的藥品質(zhì)量控制中的現(xiàn)代分析方法與技術(shù)現(xiàn)代分析方法與技術(shù)Modern analytical methods & techniques in quality control of drugs 現(xiàn)代分析方法與技術(shù)為藥學(xué)的發(fā)展提供了適時而有效的現(xiàn)代分析方法與技術(shù)為藥學(xué)的發(fā)展提供了適時而有效的輔佐與動力。輔佐與動力。如：如：色譜及其聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了藥學(xué)的現(xiàn)代分子水平的研究。色譜及其聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了藥學(xué)的現(xiàn)代分子水平的研究。手性毛細(xì)管電泳及色譜分離與測定技術(shù)為手性藥物研究手性毛細(xì)管電泳及色譜分離與測定技術(shù)為手性藥物研究與質(zhì)量控制提供了保障。與質(zhì)量控制提供了保障?，F(xiàn)代光譜

2、技術(shù)使藥物結(jié)構(gòu)分析鑒定也變得尋常容易，藥現(xiàn)代光譜技術(shù)使藥物結(jié)構(gòu)分析鑒定也變得尋常容易，藥物的微量雜質(zhì)檢定與控制系統(tǒng)全面。物的微量雜質(zhì)檢定與控制系統(tǒng)全面。Capillary electrophoresis,CE第一節(jié)、藥物現(xiàn)代色譜法及其應(yīng)用第一節(jié)、藥物現(xiàn)代色譜法及其應(yīng)用Modern chromatography & its application in pharmaceutical analysis Near infrared spectrometry,NIRS Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMRS X-ray diffraction

3、method第二節(jié)、現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用第二節(jié)、現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用Modern spectrometry & its application in pharmaceutical analysis (Hyphenated Techniques in Chromatography) MS(Mass Spectrometry)GC-FTIRHPLC-FTIRGC-MSHPLC-MSHPLC-NMRFTIR(Fourier Transform Infrared)毛細(xì)管電泳分析法 毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）是80年代初發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技

4、術(shù)。在藥物分析中有著重要的應(yīng)用與發(fā)展前景 自20世紀(jì)90年代初Menz等提出“微型全化學(xué)分析系統(tǒng)”（miniaturized total chemical analysis system，-TAS）概念以來，分析技術(shù)的微型化、集成化和自動化一直是分析科學(xué)發(fā)展的主導(dǎo)趨勢，其中芯片毛細(xì)管電泳技術(shù)的研究已取得突出進(jìn)展，在生物、臨床、醫(yī)藥、工業(yè)和環(huán)境等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳技術(shù)相比，芯片毛細(xì)管電泳具有樣品用量更少，分離速度更快的特點(diǎn)，但對檢測的靈敏度和響應(yīng)速度提出了更高要求1.高效 2.高速 3.微量 4.低消耗 HPCE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。與HPLC相比，均為液相

5、分離技術(shù)，都有多種分離模式，且儀器操作可自動化；但遵循不同的分離機(jī)理。在很大程度上，HPCE和HPLC互為補(bǔ)充。HPCE更具有如下優(yōu)點(diǎn)： 但HPCE的檢出靈敏度和精密度不及 HPLC 毛細(xì)管電泳裝置示意圖 1.高壓電源 2.光電倍增管 3.液冷溫控毛細(xì)管 4.光源 5.數(shù)據(jù)采集 6.緩沖液/樣品 7.緩沖液陽陰+- -30kV7123456a. 毛細(xì)管中電滲流呈“塞式流”流型b. HPLC柱中壓力驅(qū)動呈拋物線流型柱中壓力驅(qū)動呈拋物線流型-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+EOP-

6、+ +- -Electroosmotic Flow, EOF Electrophoresic Flow,EPF毛細(xì)管電泳裝置示意圖 1.高壓電源 2.光電倍增管 3.液冷溫控毛細(xì)管 4.光源 5.數(shù)據(jù)采集 6.緩沖液/樣品 7.緩沖液陽陰+- -30kV7123456應(yīng)用示例n電泳條件石英毛細(xì)管（未涂層）57cm50m，優(yōu)化選擇25mmol/L磷酸二氫鈉-12.5mmol/L硼砂-25mmol/L SDS（pH7.8）為電泳介質(zhì)，操作電壓20kV，柱溫23，測定波長205nm n本文建立的優(yōu)選方法可在11min內(nèi)測定利巴韋林及中間體含量，與HPLC測定需1h相比，更快速。本方法也可用于利巴韋林

7、制劑中中間體的控制 利巴韋林及各中間體的定量分析復(fù)方甘草片中甘草酸、甘草次酸、嗎啡和復(fù)方甘草片中甘草酸、甘草次酸、嗎啡和 苯甲酸鈉的分析苯甲酸鈉的分析21 n復(fù)方甘草片為常用鎮(zhèn)咳祛痰藥，臨床上有廣泛的復(fù)方甘草片為常用鎮(zhèn)咳祛痰藥，臨床上有廣泛的應(yīng)用。每片含甘草浸膏（中粉）應(yīng)用。每片含甘草浸膏（中粉）112.5mg、阿片阿片粉粉4.0mg、樟腦樟腦2.0mg、八角茴香油八角茴香油2.0mg、苯甲苯甲酸鈉（中粉）酸鈉（中粉）2.0mg n電泳條件石英毛細(xì)管電泳條件石英毛細(xì)管65cm75m i.d.，有效有效長度長度50cm，運(yùn)行緩沖液為運(yùn)行緩沖液為50mmol/L硼砂溶液；硼砂溶液；運(yùn)行電壓運(yùn)行電壓

8、14.0kV，電流電流70A；測定波長測定波長228nm；重力進(jìn)樣重力進(jìn)樣10s（高度高度7cm）n定量分析經(jīng)分析方法驗(yàn)證，本法具有良好的線定量分析經(jīng)分析方法驗(yàn)證，本法具有良好的線性關(guān)系，回收率大于性關(guān)系，回收率大于97.0%。該法可作為快速、。該法可作為快速、準(zhǔn)確測定復(fù)方甘草片中多組分含量的有效方法準(zhǔn)確測定復(fù)方甘草片中多組分含量的有效方法 v藥物現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用藥物現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用 近紅外分光光度法近紅外分光光度法 優(yōu)點(diǎn)： 無邊緣干擾，線性范圍(AC)寬 水份吸收不覆蓋C-H、N-H、O-H吸收帶適用于水溶液樣品，含水固體和泥漿狀樣 不經(jīng)溶劑稀釋，不必制備KBr片，可直接測定，定量效果優(yōu)

9、于GC、HPLC和FTIR12500cm-1 4000cm-1 400cm-1NIRMIR(near infra-red spectrum) (mid infra-red)倍頻 overtones合頻 combinationsC-H,N-H,O-H伸縮振動譜帶峰強(qiáng)度 1/1001/10基頻峰強(qiáng)度方法特點(diǎn)方法特點(diǎn) 可獲得一系列物理性質(zhì)的信息由NIRS可得到如密度、粒子尺寸、纖維直徑、大分子聚合度等特殊信息 樣品無需預(yù)處理NIRS法僅需將樣品裝入樣品池內(nèi)而不必作預(yù)處理。一般，液體樣品可以直接裝入光路長130mm的石英池中。固體樣品可直接放入具有石英窗的反射樣品杯中；蓋上彈簧壓縮蓋，即可。在1 mi

10、n內(nèi)即可完成裝樣；取出樣品、清洗杯子的時間也不需1min NIR反射譜又與MIR不同，它有以下特點(diǎn)： 分析速度快分析速度快通常，將樣品杯置入通常，將樣品杯置入NIR 光譜儀內(nèi)，每秒進(jìn)行光譜儀內(nèi)，每秒進(jìn)行5次掃描；一般掃次掃描；一般掃 描描50次求得平均值制得最后的光譜，繼次求得平均值制得最后的光譜，繼 之將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行加工以作數(shù)據(jù)的定量之將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行加工以作數(shù)據(jù)的定量 或定性的解釋。通常，作一次或定性的解釋。通常，作一次NIRS分分 析僅需析僅需2 3 min 靈敏度高靈敏度高NIRS光源強(qiáng)度較大，檢測光源強(qiáng)度較大，檢測器的反應(yīng)靈敏度較高，因而檢測信噪比器的反應(yīng)靈敏度較高，因而檢測信噪比高，

11、尤其在散射效應(yīng)強(qiáng)時，散射高，尤其在散射效應(yīng)強(qiáng)時，散射-吸收吸收比高比高 運(yùn)用范圍廣運(yùn)用范圍廣在反射和散射在反射和散射NIR中，高中，高的信噪比可以得到良好的線性關(guān)系，的信噪比可以得到良好的線性關(guān)系，對分析樣品的外觀寬容度大，既可以對分析樣品的外觀寬容度大，既可以用于清澈的氣、液、固樣品的測定，用于清澈的氣、液、固樣品的測定，又可用于粉末狀、糊狀、絲狀和不規(guī)又可用于粉末狀、糊狀、絲狀和不規(guī)則狀樣品的分析則狀樣品的分析 便于在線分析和控制便于在線分析和控制NIR區(qū)內(nèi)還有價區(qū)內(nèi)還有價格便宜耐用的透明材料（一般的光學(xué)玻格便宜耐用的透明材料（一般的光學(xué)玻璃）作為分析窗口，便于實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)璃）作為分析窗口

12、，便于實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時，并有池長對分析結(jié)果影響小，定量時，并有池長對分析結(jié)果影響小，定量分析的范圍寬等優(yōu)點(diǎn)分析的范圍寬等優(yōu)點(diǎn) 應(yīng)用示例 諾氟沙星膠囊的NIRS分析 UV、HPLC測定含量，均需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，較繁瑣費(fèi)時。采用近紅外漫反射光譜（near-infared diffuse reflectance spectrometry，NIRDRS）技術(shù)及偏最小二乘法（PLS）對諾氟沙星膠囊進(jìn)行含量測定的回收率好，與其他方法相比，還具有分析簡便、快速的優(yōu)點(diǎn) 核磁共振光譜分析法 核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectrometry，NMRS)技術(shù)已在BP和US

13、P中應(yīng)用，在新藥的研制中，如藥物結(jié)構(gòu)確證，藥物代謝物的研究和藥物的篩選和設(shè)計(jì)等方面，更是重要的分析方法之一。重點(diǎn)討論定量分析方法及應(yīng)用示例 簡述簡述NMR (nuclear magnetic resonance)肌肉松弛劑定性、定量和雜質(zhì)檢查不同藥物具有不同NMR圖譜樣品中每個組分有一個或一組特征的特征的、且互不重疊互不重疊的吸收峰Maolate 異構(gòu)體 Maolate 異構(gòu)體OClCH2HHCCHOONH2COH312OClCH2HHOHOCONH2CHC312內(nèi)標(biāo)法（絕對測量法）NMR最常用的定量分析方法內(nèi)標(biāo)物的要求： 最好能產(chǎn)生單一的共振峰，與樣品間隔30Hz 能溶于分析溶劑中 有盡可能

14、小的質(zhì)子當(dāng)量 不應(yīng)與樣品中任何組分相互作用某基團(tuán)中的質(zhì)子數(shù)產(chǎn)生該共振峰的內(nèi)標(biāo)分子量 ESSUSUSUEEAAWWSUSUSUEEAAWW%100WWU百分含量亞硝酸戊酯(Amyl nitrite)及其吸入劑(Amyl nitrite inhalant)的NMR定量分析 USP 分子中與亞硝基相鄰的次甲基上的質(zhì)子呈現(xiàn)多重峰 4.8ppm 內(nèi)標(biāo) ：苯甲酸芐酯 C6H5COOCH2C6H5 呈現(xiàn)單一峰 =5.3ppm 以TMS為對照 =0. ppmCH3CH3CH CH2ONOCH2CH3CH2ONOCH3CHCH23-甲基-1-丁醇亞硝酸酯2-甲基-1-丁醇亞硝酸酯應(yīng)用示例應(yīng)用示例 鹽酸普魯卡因的

15、結(jié)構(gòu)鑒定植物中藥及其偽品的區(qū)別偽品中藥在外觀特征上幾可以假亂真，但其化學(xué)成分的組成，尤其是活性成分卻不可能與正品完全一致，并且相差甚遠(yuǎn)。以正品植物中藥的1H-NMR相對標(biāo)準(zhǔn)圖譜為參照，只需比較所鑒別樣品的1H-NMR譜就可以斷定中藥的真?zhèn)?。以人參為例說明之 試驗(yàn)測定了偽品人參，其1H-NMR指紋圖均與正品的特征峰毫無相似之處 亞硝酸戊酯（amyl nitrite）及其吸入劑（amyl nitrite inhalant）的含量測定（USP 24） X射線粉末衍射法 X射線是倫琴在1895年發(fā)現(xiàn)的，又曾稱為倫琴射線。本質(zhì)上是波長很短的電磁波，一般認(rèn)為波長為0.011nm，較紫外線還短。作為波，就可

16、以產(chǎn)生衍射。所謂衍射，就是繞過障礙物邊緣向前傳播的現(xiàn)象 當(dāng)X射線射到晶格排列整齊的晶體上，僅僅在某些方向有光線反射，這就是 X射線的衍射。有光線反射的方向可用布拉格方程加以描述 X射線衍射法的理論依據(jù)射線衍射法的理論依據(jù) 式中為掠射角為掠射角；dhkl為為 晶面間距晶面間距；hkl為晶面指數(shù)，即晶面與晶軸截距的倒數(shù)之比，也叫密勒指數(shù)密勒指數(shù) AOCBd 布拉格方程, 3 , 2 , 1sin2n ndhkl布拉布拉格方程方程 布拉格方程布拉格方程給出了什么條件下衍射的X射線可能從晶體射出已知晶面間距(d)和入射線波長() ，即可求出衍射線方向()，也可給出進(jìn)行X射線衍射的晶體的晶面間距已知入射

17、線波長()和衍射線方向() ，即可求出晶面間距可求出晶面間距(d)。當(dāng)然晶面有若干組，都可產(chǎn)生相應(yīng)衍射，這些衍射均可由這些衍射均可由X射線衍射儀進(jìn)行測定射線衍射儀進(jìn)行測定 X射線衍射儀的工作原理射線衍射儀的工作原理 X射線管中不同靶材料， 如銅、石墨等可發(fā)出各自 特征波長 晶體粉末盡可能緊密地裝入玻璃毛細(xì)管，壓成多晶圓柱體。當(dāng)穿過鉛塊狹縫的一細(xì)束X射線射到晶體粉末時，總會有取向合適的微小晶體，使射線在其表面反射最強(qiáng) 2C22X射線衍射儀的工作原理一般采用粉末法。粉末衍射儀的構(gòu)成與工作原理見下圖由反射方向，根據(jù)布拉格方程即可求出晶面間距，進(jìn)而求出鍵長。本法可同時將各種波長的X射線反射到不同方向，

18、記錄為衍射圖譜在新藥研制過程中，必需對藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，固體樣品一般要做X射線粉末衍射分析，以便從測定結(jié)果可比較研制品與對照品是否一致。X射線粉末衍射法是藥物晶型進(jìn)行定性鑒別的重要方法之一應(yīng)用 應(yīng)用示例西咪替丁的晶型研究 尹華等 藥物分析雜志 2001，21(1)：3942 測試條件：Cu k（靶），50kV-80mA（工作電壓-電流），8()/min，DS=SS=1，RS=0.15mm(狹縫)，2 A晶型和B晶型的X射線測定數(shù)據(jù)見表 X射線衍射法除了用于晶型鑒別外，也可用于晶型藥物的定量分析 A晶型和B晶型的X射線測定數(shù)據(jù)A晶型B晶型 衍射角晶面距豐度比衍射角晶面距 豐度比9.38 0.94

19、21 6 9.56 0.9240 35 12.92 0.6847 35 13.08 0.6763 61 14.66 0.6038 18 13.92 0.6357 25 16.44 0.5388 23 18.48 0.4797 62 16.74 0.5292 34 18.98 0.4672 41 26.00 0.3424 75 26.10 0.3411 75 26.34 0.3381 5 26.38 0.3376 100 27.24 0.3271 27 28.44 0.3136 2828.44 0.3136 372() dnm II0 2() dnm II0X射線晶體結(jié)構(gòu)分析射線晶體結(jié)構(gòu)分析 若

20、以已知波長的X射線入射，也會對不同的平面族獲得最強(qiáng)的反射，據(jù)此可以測定晶可以測定晶格常量，進(jìn)而確定晶格構(gòu)造格常量，進(jìn)而確定晶格構(gòu)造。這就是 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析 重要意義重要意義確定藥物結(jié)構(gòu)及生物大分子結(jié)構(gòu) 原理如此，具體做起來還是一件十分復(fù)雜十分復(fù)雜的工作，特別是對新化合物結(jié)構(gòu)的確定，常要借助于電子計(jì)算機(jī)，例如四圓衍射儀四圓衍射儀，可以直接測量化合物的鍵長鍵角等數(shù)據(jù)v色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用 GC-FTIR系統(tǒng)組成系統(tǒng)組成著重圍繞幾種應(yīng)用較廣泛的色譜聯(lián)用技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用予以簡述 氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術(shù)GC/FI-IR聯(lián)用光路示意圖拋物面鏡干涉儀光源接口橢面鏡光管F

21、ID或放空GC柱出口GCFT-IRIR拋物面鏡 麝香風(fēng)濕油GC分析圖譜 1.-蒎烯 2.-蒎烯 3.桉樹腦 4.樟腦 5.水楊酸甲酯 6.桂皮醛 7.茴香酸甲酯 8.丁香酚 9.2-甲基十一烯 10.鄰苯二甲酸二丁酯 11.正十六烷11t(min)12345678910 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) GC-MS儀的接口組件是解決氣相色譜和質(zhì) 譜聯(lián)用的關(guān)鍵組件，它起傳輸試樣，匹配兩者工作流量（也就是工作氣壓）的作用。理想的接口應(yīng)能去除全部載氣而使試樣毫無損失地從氣相色譜儀傳輸給質(zhì)譜儀。要求試樣傳輸產(chǎn)率高，濃縮系數(shù)大，延時短，色譜的峰展寬少 GC-MS工作原理示意圖載氣樣品進(jìn)樣器色譜柱分子分離器抽真空記

22、錄儀放大器離子源分析器 電子倍增管放大器示波器質(zhì)譜 應(yīng)用示例應(yīng)用示例 在藥物中毒急救、預(yù)防和刑事偵破工作中常需要在生物體液中進(jìn)行未知毒物的鑒定。由于未知毒物的范圍非常廣泛，理化性質(zhì)各異，因此，有必要建立一系統(tǒng)化的盡可能多的毒物藥物的分析方法 固相萃取結(jié)合固相萃取結(jié)合GC-MS系統(tǒng)分離生物體液系統(tǒng)分離生物體液中常見毒物藥物中常見毒物藥物GC-MS測定冰片和川芎嗪血藥濃度 GC-MSD的選擇性離子檢測色譜圖的選擇性離子檢測色譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)樣品 B.血漿樣品1.川芎嗪 2.樟腦 3.4.龍腦A1432243tR(min)B243243tR(min)質(zhì)譜圖120406080100136(M+)42541

23、00608014012010841698195152(M+)1006080140120955567154(M+)121110 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 粒子束（partical beam）接口 不適用于極性的、熱不穩(wěn)定的和分子量大于1000的樣品分子 熱噴霧（TSP）接口TSP接口的應(yīng)用正逐步減少 以下重點(diǎn)闡述LC-MS的關(guān)鍵部件、接口裝置和應(yīng)用接口裝置接口裝置USP（24）中列出了如下幾種接口裝置大氣壓離子化（API）接口 是目前商品 化LC-MS儀采用最廣的接口 動態(tài)快原子轟擊法（FAB）FAB法適合于高活性、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性低及分子量大的樣品分析，而且樣品用量少。該接口的缺點(diǎn)是限制HPL

24、C的流速，通常為10l/min，只能使用微型柱 應(yīng)用示例應(yīng)用示例 曲安奈德中特殊雜質(zhì)的檢查 曲安縮松(TACA) Triamcinolone Acetonide 雜質(zhì)峰OCH3HOFHHCH3COCH2OHOOCCH3CH33.85350600550500450曲安縮松及其雜質(zhì)的質(zhì)譜TACA:曲安縮松；desmethylene TACA:去甲曲安縮松40050100150200250300100.0100.050.050.029359758593 115135147159173187199213225237269253281590569549535519507493475463455443435421+339347359415387377367293888293888TACAMH+-HFTACA(M+C2H5)+(M+C2H5)+DesmethyleneTACA MH+421+去甲曲安縮松 Desmethylene TACAOCH3HOFHHCH3COCH2OHOOCCH3HOCHCH3OCH3HOFHHCH3COCH2OHOOCCH3CH3 曲安縮松(TACA) Triamcinolone Acetonide OCH3HOFH