氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察

1、生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析實訓(xùn)報告題目：氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察Study on the methodology investigation of detecting nicotine content by GC internal standard method 專業(yè)：食品科學(xué)與工程 姓名： 戚效群學(xué)號：完成日期：2010-5-24氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察【摘 要】煙堿(又稱尼古丁)是煙葉中的主要成分。本次試驗以喹啉為內(nèi)標(biāo)物，煙堿為測定對象，考查及檢測氣相色譜法內(nèi)標(biāo)法測定煙堿含量的方法學(xué)。試驗中以有機溶劑萃取、填充氣相色譜法測定對試驗的重現(xiàn)性及精密度和線性關(guān)系進行進行了

2、認真分析。一定范圍內(nèi)，煙堿含量的峰高比及面積比呈現(xiàn)線性關(guān)系，重現(xiàn)性及精密度良好。【關(guān)鍵詞】： 內(nèi)標(biāo)法 煙堿 氣相色譜 方法學(xué)Study on the methodology investigation of detectingnicotine content by GC internal standard methodAbstract：Nicotine (also called nicotine) is the main ingredient. Tobacco This trial as internal standard with things, -1h-qunolin-2-ones nic

3、otine to determine object, examines and detecting gas chromatography internal standard method for determining the content of nornicotine methodology. Experiments with organic solvent extraction, filling gas chromatography was developed for the determination of the test the reproducibility and precis

4、ion and linear relationship between analyzed carefully. A certain range, high ratio of nicotine content than present peak area of linear relation, reproducibility and precision is good. Keywords： Internal standard method nicotine gas chromatography methodology 目 錄1 緒論5 1.1 煙堿的結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)5 1.2 煙堿的檢測方法6 1

5、.2.1 非水滴定法檢測煙堿含量6 1.2.2 紫外線分光光度法檢測煙堿含量6 1.2.3 水蒸氣蒸餾法檢測煙堿含量6 1.2.4 高效液相色譜法檢測煙堿含量7 1.2.5 氣相色譜法檢測煙堿含量7 1.2.5.1 外標(biāo)法檢測煙堿含量8 1.2.5.2 歸一化法檢測煙堿含量8 1.2.5.3 內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量81.3 檢測方法學(xué)考察9 1.3.1 線性關(guān)系的考察9 1.3.2 精密度的考察9 1.3.3 重現(xiàn)性實驗的考察10 1.3.4 回收率10 1.3.5 驗證性102 實驗部分112.1 目的112.2 材料和儀器112.2.1 材料112.2.2 儀器112.3 色譜條件11 2.4

6、 實驗設(shè)計及結(jié)果分析112.4.1 線性關(guān)系實驗的考察112.4.2 精密度實驗的考察13 2.4.3 重現(xiàn)性實驗的考察14 2.4.4 結(jié)果分析15參考文獻15氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察1 緒論1.1 煙堿的結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì) 煙堿又名尼古丁，是一種無色至淡黃色透明油狀液體，是煙草中含氮生物堿的主要 成分，在煙葉中的含量為13%。它能迅速溶于水及酒精中，通過口、鼻、支氣管黏膜，很容易被人體吸收。粘在皮膚表面的尼古丁，可“滲”入人體內(nèi)。香煙中的尼古丁對人的致死量是5070毫克，相當(dāng)于2025支香煙尼古丁的含量。如果將一支雪茄或三支香煙的尼古丁一次注入人的靜脈內(nèi),35分鐘人即可死亡。對昆蟲

7、具有殺滅作用煙堿的結(jié)構(gòu) 尼古丁煙堿化學(xué)性質(zhì) 一種吡啶型生物堿，分子式C10H14N2。俗稱尼古?。╪icotine）。存在于煙草屬經(jīng)濟植物中。無色揮發(fā)性液體，有刺激性臭味，熔點79，沸點246.7(745毫米汞柱)，相對密度1.0097（204），比旋光度 169°?？梢运魵庹麴s。在空氣中易發(fā)生變質(zhì)。易溶于水、乙醇、乙醚、氯仿和石油醚。煙堿能與各種無機酸（如鹽酸、硫酸）和有機酸（如酒石酸、苦味酸 ）生成結(jié)晶的單鹽和雙鹽 ，其中雙苦味酸鹽的熔點278，常用來鑒別煙堿。煙堿與二氧化汞生成結(jié)晶形復(fù)合物，此反應(yīng)可用來純化煙堿。1.2 煙堿的檢測方法1.2.1 非水滴定法檢測煙堿含量 煙堿含

8、量是煙草質(zhì)量的重要指標(biāo)，本法分別以鹽酸和水為浸取劑、三氯甲烷為萃取劑、溴甲酚綠和甲基紅的混合試劑為指示劑，在最佳浸取、萃取、值等條件下，用標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液直接滴定煙堿的方法。本法準(zhǔn)確、快速、簡便。煙草樣品中,煙堿的測定方法有:有機溶劑萃取蒸餾酸堿滴定法,在強堿性介質(zhì)中蒸汽蒸餾.硅鎢酸沉淀重量法,另外文獻亦有報導(dǎo);煙草中鉀的測定方法,有鉀與亞硝酸鈷鈉生成復(fù)鹽,高錳酸鉀分解,草酸返滴定法;漆酚冠醚鉀離子選擇性電極格蘭計算法等,提出用氟硼酸根離子選擇性電極作為指示電極、四苯硼鈉電位滴定法測煙葉中的鉀與總煙堿量。樣品加入過量四苯硼鈉的溶液,分別在 pH=10中沉淀鉀在pH=4、pH=10時沉淀煙堿與鉀,過

9、量的四苯硼鈉分別用溴化十六烷基三甲基銨返滴，計算出煙堿含量。1.2.2 紫外分光光度法檢測煙堿含量 它是根據(jù)物質(zhì)分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。操作簡單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。波長長(頻率小)的光線能量小，波長短(頻率大)的光線能量大。分光光度測量是關(guān)于物質(zhì)分子對不同波長和特定波長處的輻射吸收程度的測量。煙堿(又名尼古丁)是煙草特有的植物堿,它給予吸煙者感官上感覺到“勁頭”而滿意,所以煙堿是煙草質(zhì)量的重要化學(xué)成份之一.過去我們采用經(jīng)典的硅鎢酸沉淀法測定,這個方法準(zhǔn)確性雖高,但化費時間卻很長,每作一個樣品的測定需要30個小時,因此不

10、能適應(yīng)我國煙草工業(yè)形勢發(fā)展的需要,現(xiàn)我們改用紫外分光光度法來測定,其原理是煙堿溶液在特定波長的紫外光源通過時,紫外光量的吸收與煙堿濃度成比例.一個樣品僅需兩小時就可完成測定1.2.3 水蒸氣蒸餾法檢測煙堿含量 煙堿是由兩個雜環(huán)（吡啶和四氫吡咯）構(gòu)成含氮堿，很容易與鹽酸反應(yīng)生成煙堿鹽酸鹽而溶于水。此提取液加入NaOH后可使煙堿游離。游離煙堿在左右具有一定的蒸氣壓，可用水蒸氣蒸餾法分離提取。水蒸氣蒸餾法是將含有揮發(fā)性成分的藥材與水共蒸餾，使揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出，經(jīng)冷凝分取揮發(fā)性成分的浸提方法。該法適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞、在水中穩(wěn)定且難溶或不溶于水的藥材成分的浸提。水蒸氣蒸

11、餾法可分為共水蒸餾法、通水蒸氣蒸餾法、水上蒸餾法。為提高餾出液的濃度，一般需將餾出液進行重蒸餾或加鹽重蒸餾。常用設(shè)備為多能提取罐、揮發(fā)油提取罐，它在生產(chǎn)活動中被廣泛使用。本法的基本原理是根據(jù)道爾頓定律，相互不溶也不起化學(xué)作用的液體混合物的蒸汽總壓，等于該溫度下各組分飽和蒸氣壓（即分壓）之和。因此盡管各組分本身的沸點高于混合液的沸點，但當(dāng)分壓總和等于大氣壓時，液體混合物即開始沸騰并被蒸餾出來。該方法具有安裝操作簡單、減少污染和縮短實驗時間等優(yōu)點。在堿性條件下將煙草浸泡以上用水蒸氣蒸餾法收集蒸出液，即可收集到以上的煙堿分別用酸堿滴定法和紫外光譜法測定其煙堿含量。1.2.4 高效液相色譜法檢測煙堿含

12、量高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達4.9´107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。 高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應(yīng)”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜

13、峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。1.2.5 氣相色譜法檢測煙堿含量 氣相色譜法中有外標(biāo)法、歸一化法、內(nèi)標(biāo)法三種。外標(biāo)法 用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標(biāo)法（external standard method）。外標(biāo)法是色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標(biāo)物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。 外標(biāo)法操

14、作、計算簡單，無需各組分都被檢出、洗脫，但進樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測量結(jié)果。歸一化法 歸一化是一種簡化計算的方式，即將有量綱的表達式，經(jīng)過變換，化為無量綱的表達式，成為純量。內(nèi)標(biāo)法 internal standard method 是色譜分析中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，尤其在沒有標(biāo)準(zhǔn)物對照時，此方法更顯其優(yōu)越性。內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法（internal standard method ）是色譜分析中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，尤其在沒有標(biāo)準(zhǔn)物對照時，此方法更顯其優(yōu)越性。內(nèi)標(biāo)法是將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加到一定量的被分析樣品混合物中，然后

15、對含有內(nèi)標(biāo)物的樣品進行色譜分析，分別測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子， 本法是通過測量內(nèi)標(biāo)物及欲測組分的峰面積的相對值來進行比較的，因而由于操作條件變化而引起的誤差，將同時反映在內(nèi)標(biāo)物及欲測組分上而得到抵消，所以可得到較準(zhǔn)確的結(jié)果。這是內(nèi)標(biāo)法的主要優(yōu)點。 內(nèi)標(biāo)物的選擇是重要的。它應(yīng)該是試樣中不存在的純物質(zhì)；加入的量應(yīng)該是接近與被測組分；同時要求內(nèi)標(biāo)物的色譜峰位于被測組分色譜峰附近，或幾個被測組分色譜峰中間，并且與這些組分完全分離，還應(yīng)注意內(nèi)標(biāo)物與被測組分的物理及物理化學(xué)性質(zhì)（如揮發(fā)度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性以及溶解度等）相近，這樣，當(dāng)操作條件變化時，更有利于內(nèi)標(biāo)物與被測組分做勻稱的

16、變化。 此法優(yōu)點是定量較為準(zhǔn)確，而且不像歸一化法有使用上的限制，但每次分析都要準(zhǔn)確稱取試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，因而它不利于做快速控制分析。 在此實驗中將使用內(nèi)標(biāo)法來測定煙堿的含量方法如下:內(nèi)標(biāo)法是將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內(nèi)標(biāo)物的樣品進行色譜分析，分別測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，可求出被測組分在樣品中的百分含量： 校正因子（f）： f= (As/ms)/(Ar/mr) 其中As和Ar分別為內(nèi)標(biāo)物和對照品的峰面積或峰高，ms和mr分別為加入內(nèi)標(biāo)物和對照品的量。 根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物的待測組分溶液色譜峰響應(yīng)值，計算煙堿含量（mi）： mi=

17、f×Ai/(As/ms) 其中 Ai和As分別為供試品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高，ms為加入內(nèi)標(biāo)物的量（必要時，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標(biāo)示量折算成為標(biāo)示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量折算成百分含量）。1.3 檢測方法學(xué)考察1.3.1 線性關(guān)系的考察 線性在兩個變量之間存在一次性關(guān)系，就稱它們之間存在線性關(guān)系。正比例關(guān)系是線性關(guān)系中的特例，反比例關(guān)系不是線性關(guān)系。更通俗一點講，如果把兩個變量分別作為點的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)，其圖像是平面上的一條直線，則這兩個變量之間的關(guān)系就是線性關(guān)系。即如果可以用一個二元一次方程來表達兩個變量之間關(guān)系的話，這兩個變量之間的關(guān)系稱之為線性關(guān)系。 線性范圍是

18、指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小量之間的間隔，可用mgL mgL、 ugml ugml等表示。1.3.2 精密度的考察 精密度是用來表示測量結(jié)果中隨機誤差大小的程度，也可以簡稱為精度，描述測量數(shù)據(jù)的分散程度。即指多次重復(fù)測定同一量時各測定值之間彼此相符合的程度，表征隨機誤差的大小。 精密度表示測量的重現(xiàn)性，是保證準(zhǔn)確度的先決條件，但是高的精密度不一定能保證高的準(zhǔn)確度。好的精密度是包拯獲得良好準(zhǔn)確度的先決條件，一般來說，測量精密度不好，就不可能有好的準(zhǔn)確度，反之，測量精密度好，準(zhǔn)確度也不一定好，這種情況表明隨機誤差小，但系統(tǒng)誤

19、差大。 精密度通常以計算平均差、極差、標(biāo)準(zhǔn)差或方差來量度。精密度同被測定的量值的大小和濃度有關(guān)，因此，在報告精密度時，應(yīng)該指明獲得該精密度的被測定的量值的大小和濃度。1.3.3 重現(xiàn)性實驗的考察 在不同的實驗室由不同分析人員測定同一樣品各個獨立測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。 當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進行重現(xiàn)性實驗。例如，建立獸藥典分析方法時應(yīng)通過不同實驗室的復(fù)核檢查得出重現(xiàn)性結(jié)果，復(fù)查檢驗的目的、過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性實驗用的樣品本身的質(zhì)量的均勻性和儲存運輸中環(huán)境等影響因素，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。1.3.4 回收率 是指投射到物體上而被吸收的熱輻射能與投射

20、到物體上的總熱輻射能之比稱為該物體的吸收率。這是針對所有波長而言，應(yīng)稱為全吸收率，通常就簡稱為吸收率。1.3.5 驗證性 驗證性實驗是指對研究對象有了一定了解,并形成了一定認識或提出了某種假說,為驗證這種認識或假說是否正確而進行的一種實驗.驗證性實驗強調(diào)演示和證明科學(xué)內(nèi)容的活動,科學(xué)知識和科學(xué)過程分離,與背景無關(guān),注重探究的結(jié)果(事實,概念,理論),而不是探究的過程.驗證性實驗傳遞了這樣一種信息:了解一個發(fā)現(xiàn)和如何把這個發(fā)現(xiàn)的結(jié)果應(yīng)用到一個確定的問題上比直接學(xué)習(xí)如何發(fā)現(xiàn)要重要得多.驗證性實驗強調(diào)實驗操作和觀察等個別智力技能,強調(diào)任何快速經(jīng)濟的獲得生物化學(xué)知識。2 實驗部分2.1 目的 本次試驗

21、以喹啉為內(nèi)標(biāo)物，煙堿為測定對象，考查及檢測氣相色譜法內(nèi)標(biāo)法測定煙堿含量的方法學(xué)。學(xué)會氣相色譜法的原理及應(yīng)用，內(nèi)標(biāo)法的理解及實際操作，并檢測出煙堿的含量。學(xué)會線性關(guān)系，重現(xiàn)性，精密度，吸收率的驗證實驗的設(shè)計和結(jié)果分析。2.2 材料和儀器2.2.1 材料98煙堿(自制備) 、喹啉(分析級別)、水（蒸餾水）、進樣量為1ul、甲醇（分析級別）2.2.2 儀器氣相色譜儀（7890型上海天美公司）、毛細管柱 （30m length TMWAX From 20 to 260）2.3 色譜條件氣體流速:N2 30ml/ min Air 400ml/min H2 10ml/min 柱箱溫度（OVEN）180 進

22、樣口溫度（INJ）260 檢測器溫度（DET）2602.4 實驗設(shè)計及結(jié)果分析通過實驗及對實驗結(jié)果的分析得出以下結(jié)論。2.4.1 線性關(guān)系實驗的考察所用試劑：100ug/mL煙堿甲醇溶液， 100ug/mL喹啉甲醇溶液，甲醇（99%以上）配制濃度分別為1、10、20、30、40、50ug/ml的煙堿甲醇溶液，內(nèi)含50ug/ml的喹啉，吸取1ul進樣檢測，并記錄煙堿和喹啉的峰面積及峰高，計算出它們之間的峰高比和面積比，結(jié)果見表1。表1：煙堿/喹啉的峰高比及面積比Table 1:peak height ratio and area ratio of nicotine/ quinolineTest

23、uL - peak height ratio area ratio No. nicotine quinoline methyl hydroxide1 0 500 500 0 02 100 500 400 0.07296 0.072933 200 500 300 0.18129 0.173914 300 500 200 0.24000 0.550565 400 500 100 0.63736 0.552876 500 500 0 0.80085 0.67499 圖1 煙堿/喹啉的峰高比Fig. 1 peak height ratio of nicotine/ quinoline 以煙堿與喹啉的峰

24、高比為Y軸，以煙堿含量（單位ug）為X軸的回歸方程分別為Y=-0.07088+0.00174X (r=0.98356 )由此可以看出煙堿含量在050ug/ml范圍內(nèi)，采用氣相色譜法測定時其濃度與峰高比呈良好的線性關(guān)系。用Origin7.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖如下：圖2 煙堿與喹啉的面積比Fig. 2 area ratio of nicotine/ quinoline 以煙堿與喹啉的面積比為Y軸，以煙堿含量（單位ug）為X軸的回歸方程分別為Y=-0.04956+0.00143X (r=0.9892 )由此可以看出煙堿含量在050ug/ml范圍內(nèi)，采用氣相色譜法測定時其濃度與峰面積比呈良好的線性關(guān)系。用Origin7.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖如下：2.4.2 精密度實驗的考察 配制濃度為50ug/ml的煙堿甲醇溶液，內(nèi)含50ug/mL的喹啉，取同一支試管中的試液連續(xù)進5針，并記錄煙堿和喹啉的峰面積及峰高，計算出它們之間的峰高比和面積比，結(jié)果見表2。表2：精密度試驗Table 2 ：precisionTest uL - peak height ratio area