產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

1、發(fā)酵工程實驗報告產(chǎn)淀粉酷菌株的篩選姓名：XX班級：生物技術(shù)學(xué)號：XX指導(dǎo)老師：XXX產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選XX（長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)）【摘要】為篩選產(chǎn)淀粉酶的高產(chǎn)菌株，利用淀粉水解圈作為篩選模型，從學(xué)校附近土壤中篩選得到產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌。對其酶活力進(jìn)行測定，最終得到產(chǎn)淀粉酶的高產(chǎn)菌株?！娟P(guān)鍵詞】淀粉酶；水解圈；酶活力；高產(chǎn)菌株ScreeningofStrainsProducingStarchXX（TechnologyofBiologicalLifeScienceCollegeofChangchunNormalUniversity）Abstractforthehigh-yields

2、trainswerescreenedforamylase,thestarchhydrolysiscircleasamodelforscreening,screeningfromtheschoolnearthesoilproducedamylaseabilityofthebacteria.Determinationoftheenzymeactivity,highyieldstraineventuallyproducedamylase.KeywordsAmylase;Hydrolysiscircle;Enzymeactivity;Producingstrain前言：生活中的微生物無處不在，某些微生

3、物給人們帶來困擾，但更多的微生物對我們?nèi)祟愑斜夭豢缮俚淖饔?。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類的總稱，廣泛存在于動植物和微生物中，是最早實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)并且迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種。特別是20世紀(jì)60年代以來，由于酶法生產(chǎn)葡萄糖，以及用葡萄糖生產(chǎn)異構(gòu)糖漿的大規(guī)模工業(yè)化，淀粉酶的需要量越來越大，幾乎占整個酶制劑總產(chǎn)量的50%以上。微生物的許多種類都能產(chǎn)生淀粉酶。淀粉酶種類繁多，特點各異且用途廣泛。因為淀粉酶的用途廣泛，各國在對淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方面都做了大量的研究工作，目前所得淀粉酶活力最高可達(dá)到260U/mL左右。雖然不少微生物能產(chǎn)生淀粉酶，但適合商業(yè)生產(chǎn)需要的菌株仍然很少，在淀粉酶生產(chǎn)過

4、程中選擇適合的菌株是最重要的前提條件。本文以土壤作為原料，從中篩選出具有產(chǎn)淀粉酶能力的出發(fā)菌株，并對所得的出發(fā)菌株進(jìn)行酶活力測定，使其給工業(yè)生產(chǎn)帶來經(jīng)濟(jì)效益做大量的準(zhǔn)備工作。1 .材料與方法1.1 器材培養(yǎng)皿、量筒、試管、滴管、吸水紙、燒杯、移液管、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環(huán)、鐐子、天平、濾紙、pH試紙、試管架、容量瓶等。恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、無菌操作臺、控溫?fù)u床、分光光度計、離心機(jī)。棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、稱量紙、試管架、藥匙、吸耳球、鐐子、酒精棉、廢液瓶、膠塞、火柴。1.2 試齊IJ牛肉膏、蛋白月東、瓊脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸儲水、1mol/LNaOH1mol/LHCl、無菌

5、水、95充醇、75%酉精、酵母膏、KHPQ、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%、3,5一二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、磷酸緩沖液(0.2mol/L,pH6.8)、6mol/LNaOH。牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基、固體淀粉培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基。1.3 菌種土壤稀釋液2 .操作步驟2.1 培養(yǎng)基的配制2.1.1操作流程：稱量-溶解-調(diào)節(jié)p+>分裝->加棉塞->包扎->火菌->擺斜面2.1.2操作步驟：(1)稱量藥品：按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏和蛋白月東可分別放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后

6、倒入大燒杯。蛋白月東極易吸潮，故稱量時要迅速。(2)加熱溶解：在燒杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻璃棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，在此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)充所失水分。(3)調(diào)pH：用pH式紙檢測培養(yǎng)基的pH直，若pH酸，可滴加1mol/LNaoH邊加邊攪拌，并隨時檢測，直至達(dá)到所需pHE圍。若偏堿，則用1mol/lHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH直不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。(4)分裝：按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗

7、以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約試管高度的1/5;分裝入三角瓶內(nèi)的以不超過其容積的一半為宜，半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜。(5)加棉塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞，以防止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染。(6)包扎：加塞后，將三角瓶的棉花外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防止滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把裝同類培養(yǎng)基的試管扎成捆后，再于棉花塞外一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。(7)滅菌：將上述培養(yǎng)基于121.3C高壓鍋內(nèi)，高壓蒸汽滅菌20min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入

8、冰箱內(nèi)暫存。所用培養(yǎng)皿、移液管、涂布棒用牛皮紙包扎好，無菌水、試管包扎，一起高壓滅菌。(8)擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜面的長度不超過試管總長的1/2,待其凝固。2.2 微生物的分離與純化2.2.1 土樣的采集(1)地點選?。洪L春師范學(xué)院第一教學(xué)樓西側(cè)家屬樓門前菜園中的土壤(潮濕)。(2)采集時間：2013-3-28,10:30.(3)采集原則：地點選取后，用小鏟子除去5cm表土，取離地面5-10cm處的土壤盛與袋中并標(biāo)明時間、地點及環(huán)境情況。2.2.2 土壤稀釋液的制備(1)取10g土壤樣品加入裝有90ml無菌水的無菌燒杯中，輕輕搖晃混勻，制

9、成菌懸液。(2)再分別取5只試管，分別加入9ml無菌水。然后把土壤菌液和5管9ml的無菌水排列好，依次編號1,2,3,4,5及6號管。(3)在無菌操作條件下，用無菌移液管吸取1ml10-1濃度(菌懸液)的菌液于裝有9ml無菌水的2號管中，搖勻即制成10-2濃度菌液，然后再從2號管中取1ml10-2濃度的菌液于3號管中，搖勻，依次稀釋到IO-6,這樣就得到了10-110-6六個稀釋度的菌懸液。2.2.3 涂布平板（1）倒平板：將配置好并已滅菌的牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固。（2）涂布：分別取10-210-6濃度的菌液0.2ml倒入培養(yǎng)皿中，用涂布棒涂勻，做好標(biāo)記。2.2.4 培養(yǎng)將

10、標(biāo)記好的培養(yǎng)皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱，37c恒溫培養(yǎng)24小時。2.3 平板劃線分離微生物在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中挑取少量菌樣，在淀粉培養(yǎng)基上平板劃線分離（如圖1）,劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落。區(qū)t>£«<<圖1平板劃線方法2.3.1 初篩：分別挑取培養(yǎng)24h的五個濃度的菌落到淀粉培養(yǎng)基上，按照上述的劃線方法分離菌落，目的是獲得單菌落。將劃線分離完成的培養(yǎng)皿做好標(biāo)記，再倒置放入恒溫培養(yǎng)箱，37c恒溫培養(yǎng)24小時。2.3.2 純化（復(fù)篩）：培養(yǎng)24h后取出培養(yǎng)皿，加入少量碘液，觀察其透明圈的大小

11、。挑取透明圈較大的單菌落到新的淀粉培養(yǎng)基上，方法同上。重復(fù)操作2-3次，最后一次記錄菌圈的大小。2.4 菌種保存：將篩選出來的菌圈較大的菌株接到牛肉膏蛋白月東試管斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行保存。3 .淀粉酶活力的測定3.1 菌種活化：將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，37c培養(yǎng)24小時，備用。3.1.1 種子液的制備：取一環(huán)活化的菌種，接入裝量為50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37C,180r/min培養(yǎng)18h。3.1.2 搖瓶培養(yǎng)：分別取1ml種子液，接入盛有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的200ml三角瓶中（接種量為2%（。置搖床中，30c震蕩培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)速為160r/min。3.2 酶的提取：液體培養(yǎng)基

12、在3000r/min的離心機(jī)中離心10min,取上清液。3.3 淀粉酶活力測定取25ml刻度試管4只，按下表編號并操作，記錄實驗結(jié)果。pH6.8緩沖液1212蔗糖溶液11淀粉溶液11淀粉酶液11酶促反應(yīng)搖勻，37c水浴5minDNSM齊IJ2顯色反應(yīng)沸水浴5min光密度（D540）4 .實驗結(jié)果與分析4.1 初次培養(yǎng)的細(xì)菌：分別為10-210-5濃度的菌落（如圖2）。10-210-310-410-510-6圖2初次培養(yǎng)的細(xì)菌4.2 初篩菌落（如圖3）10-210-310-4圖3初篩菌落4.3復(fù)篩菌落（如圖4）圖4復(fù)篩菌落4.4 淀粉酶活力的測定表二復(fù)篩菌落直徑和水解圈直徑的結(jié)果編號水解圈直徑d

13、i(cm)菌落直徑d2(cm)酶活力(U/g)11.240.6153.421.010.6046.330.920.6441.740.870.5644.650.720.6030.4圖5淀粉圈大小圖從圖中可以看到淀粉圈的大小，即代表了酶活力強(qiáng)弱，淀粉圈越大越明顯，說明酶活力越強(qiáng)，反之越弱。圖中1號菌酶活力最強(qiáng)，2、4號菌的酶活力較強(qiáng)，3、5號菌酶活力一般，但相對其他菌活力較好。5 .總結(jié)與討論5.1 實驗總結(jié)本實驗的最終目的就是要把自然界土壤中混雜的微生物通過以下步驟完成分離純化，首先利用牛肉膏蛋白臍培養(yǎng)基培養(yǎng)出細(xì)菌，然后在把這些菌群通過劃線分離的方法接種到淀粉培養(yǎng)基上，此步的目的是獲得能分解淀粉的

14、單個菌落。最后挑選幾個產(chǎn)淀粉能力強(qiáng)的單個菌落中的菌接種到斜面上，進(jìn)行保種，這樣就獲得純凈的能分解淀粉的菌落。5.2 討論5.2.1 實驗可靠性分析由于實驗過程有涉及到無菌操作，所以操作不當(dāng)或操作方法錯誤都有可能對實驗結(jié)果造成影響，使實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。但總體上除去這些外在因素，實驗結(jié)果還是可靠的。5.2.2 實驗中的問題及原因分析制備培養(yǎng)基時出現(xiàn)的問題：加熱熔解瓊脂時液體劇烈沸騰溢出三角燒瓶，導(dǎo)致實驗重新進(jìn)行，浪費(fèi)了人力物力，由于攪拌不夠，出現(xiàn)了糊底的現(xiàn)象。以后的實驗中要引起足夠的重視接種操作時沒有盡量避免外界細(xì)菌的摻入，使得最后培養(yǎng)得到的菌落可能摻雜了空氣中的雜菌，而在灼燒接種環(huán)時也有因接種環(huán)過

15、熱使得一部分菌體被殺死。劃線時沒有嚴(yán)格按照老師的標(biāo)準(zhǔn)，再加上操作不熟練，劃的線太過稀疏，分離不明顯，未得到太多的單一菌落6 .實驗注意事項1)稱藥品的牛角匙不能混用，稱完藥品后應(yīng)及時蓋緊瓶蓋。2)使用高壓滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序(如加水、排冷空氣、降零)進(jìn)行，避免發(fā)生事故。滅菌時操作者切勿擅自離開。3)干熱滅菌時消毒箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與消毒箱內(nèi)壁的鋼板接觸，以防包裝紙烤焦起火。4) 一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，故從土壤中分離細(xì)菌時，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計數(shù)。5)在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管

16、，使計數(shù)準(zhǔn)確。6)在接種時候應(yīng)先用酒精燈將接種環(huán)前面的鉗絲燒紅，即對其進(jìn)行滅菌；待溫度降下來之后再接種。每次接種完后，要進(jìn)行下一次接種之前，都要采取同樣的方式。7 .參考文獻(xiàn)1沈萍，陳向東主編.微生物學(xué)實驗M.第四版.高等教育出版社.2谷軍主編.淀粉酶的生產(chǎn)與應(yīng)用J.生物技術(shù)，1994,4(3):1-5.3白坤，于德貴，周冬穎主編.淀粉酶的性質(zhì)及其液化作用J.中國釀造,1995(5):1-5.4張強(qiáng)，劉成君，蔣芳等主編.耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及發(fā)酵條件與酶性質(zhì)研究J.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005,31(2):34-37.5羅志剛，楊景峰，羅發(fā)興編.淀粉酶的性質(zhì)及應(yīng)用J.食品研究與研發(fā)，2007,28(8):1-18.6張麗蘋，徐巖，金建中主編.酸性淀粉酶的研究與應(yīng)用J.釀酒,2002,29(3):4-15.7沈萍主編.微生物學(xué)M.2版.北京：高等教育出版社,