肝豆?fàn)詈俗冃哉n題匯報(bào)

1、1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃怨撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃?肝纖維化治療的臨床研究肝纖維化治療的臨床研究 2主要研究開發(fā)內(nèi)容主要研究開發(fā)內(nèi)容 本研究采用分組對(duì)照臨床試驗(yàn)方法，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療HLD肝纖維化的安全性和有效性進(jìn)行評(píng)價(jià) 檢測(cè)多種肝纖維化指標(biāo)及肝組織形態(tài)學(xué)病理改變；以觀察自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)肝纖維化病理進(jìn)程的影響 為開展間充質(zhì)干細(xì)胞治療HLD肝纖維化提供試驗(yàn)依據(jù) 3申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) 概述概述 肝豆?fàn)詈俗冃裕℉epatolenticular degeneration，HLD） 又稱Wilson病（Wilson disease，WD），是一種難治

2、性的 常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病 由于銅在肝、腦等組織中異常沉積引起相應(yīng)器官組織損 傷，臨床以肝硬化、腦損害等相關(guān)癥狀為主要表現(xiàn) 臨床癥狀復(fù)雜多樣，但所有患者由于銅離子自膽道排泄障 礙，造成游離銅在肝組織長(zhǎng)期緩慢蓄積導(dǎo)致不同程度的肝 臟慢性損害，肝纖維化幾乎是每一個(gè)HLD患者肝臟的主要 病理改變4HLD流行病學(xué)調(diào)查流行病學(xué)調(diào)查 本病是較為常見的單基因遺傳病，國(guó)外Ferenci P等流行病學(xué)調(diào)查，本病發(fā)病率為1/3萬(wàn)人，患病率為1525/10萬(wàn)人，雜合子為1/100人 國(guó)內(nèi)劉焯霖等對(duì)19821991年神經(jīng)遺傳性疾病?？崎T診統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果HLD占10.14，居全部單基因遺傳病的第二位 我院統(tǒng)計(jì)

3、2010年7月2011年2月期間427例住院患者，約70%的患者在院外由于誤診誤治導(dǎo)致病情加重，甚至因?yàn)楦斡不Т鷥敾?及嚴(yán)重腦損害導(dǎo)致殘疾和死亡 申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) 5申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) Ferenci P等等 胡紀(jì)源等胡紀(jì)源等 楊任民等楊任民等 HLD的病理研究證實(shí)患者均存在 明顯的肝臟損害 絕大多數(shù)HLD患者存在著不同程度的肝纖維化聲像學(xué)改變 HLD的肝纖維化是患者最常見的病理改變 肝硬化失代償是本病患者致殘、致死的最主要原因我們認(rèn)為非常有必要對(duì)HLD的肝纖維化進(jìn)行系統(tǒng)研究研究證實(shí)研究證實(shí)HLD患者均存在明顯的肝臟損害患者均存在明顯的肝

4、臟損害干預(yù)干預(yù)6申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) 肝纖維化的病理機(jī)制肝纖維化的病理機(jī)制肝纖維化的形成涉及致病機(jī)體反應(yīng)的多個(gè)方面 反應(yīng)細(xì)胞 細(xì)胞因子 細(xì)胞過量表達(dá)產(chǎn)物以及降解酶等復(fù)雜的細(xì)胞及分子機(jī)制 ECM合成增加 ECM降解減少 致病因子使 肝組織中 竇內(nèi)皮細(xì)胞 肝細(xì) 胞等 形成復(fù)雜的細(xì)胞-細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò) 肝星狀細(xì)胞激活 這些物質(zhì)常被用作檢測(cè)肝纖維化水平的血清標(biāo)志物 HA LN PC-IV-CECM可被基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）降解 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs) 阻止肝臟ECM的降解 肝纖維化肝纖維化 呂有魁等臨床觀察到多數(shù)呂有魁等臨床觀察到多數(shù)HLD患者上述指標(biāo)明顯升高患者上

5、述指標(biāo)明顯升高 劉焯霖等觀察到兒童HLD肝組織內(nèi)TIMP-1、TIMP-2表達(dá)量增強(qiáng)7國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)在治療國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)在治療HLD肝纖維化現(xiàn)狀肝纖維化現(xiàn)狀 國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)在治療HLD肝纖維化尚屬空白，已報(bào)導(dǎo)的藥物尚無(wú)一種被正式批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床抗肝纖維化，這是因?yàn)樯暾?qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) 某些藥物雖具有抗肝纖維化作用，但其靶向性不強(qiáng)，對(duì)其它組織也有影響，長(zhǎng)期應(yīng)用副作用大許多藥物早期或短期有預(yù)防作用，對(duì)已形成的肝纖維化療效并不明顯某些藥物在某一環(huán)節(jié)有抗肝纖維化效果，但在其它環(huán)節(jié)又促進(jìn)纖維化矛盾的作用 尋找有效治療HLD肝纖維化的途徑任重而道遠(yuǎn)卻又迫在眉睫 8 干細(xì)胞干預(yù)肝纖維化

6、的研究現(xiàn)狀干細(xì)胞干預(yù)肝纖維化的研究現(xiàn)狀申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) Peresen 等Higashiyama R等Sakaida等 Aziz等 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞，可誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，明顯減少膠原沉積 骨髓干細(xì)胞定植于肝臟，一部分表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)纖維條索的溶解而發(fā)揮抗纖維作用骨髓干細(xì)胞移至肝臟纖維條索周圍 分泌MMP-2、914增多 細(xì)胞外基質(zhì)及膠原條索降解增多有利肝功改善 通過將MSCs由尾靜脈注入肝纖維化模型鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)MSCs具有向肝細(xì)胞方向的轉(zhuǎn)化及減輕肝纖維化的功能 MSCs移植具有抗肝纖維化作用9骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝損害的優(yōu)勢(shì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治

7、療肝損害的優(yōu)勢(shì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，來(lái)源豐富分化能力強(qiáng)免疫原性低沒有倫理學(xué)障礙，不受道德及法律方面的限制具有跨胚層向多組織細(xì)胞分化的潛能和自我更新的高增值能力。申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) 10本課題意義本課題意義 骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝豆?fàn)詈俗冃詫?dǎo)致的肝纖維化的安全性和有效性還需進(jìn)一步的評(píng)估 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療該病肝纖維化的機(jī)制也具有重要的意義申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目的必要性和依據(jù) 11實(shí)施方案實(shí)施方案采用臨床試驗(yàn)方法，將病人分為三組: 青霉胺組 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)組; 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)加青霉胺組。 隨訪1-2年；治療后3、6、9、12

8、個(gè)月觀察患者日常生活能力評(píng)價(jià)、臨床分級(jí)評(píng)價(jià)、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量變化、治療1年后肝組織活檢進(jìn)行病理檢查，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS處理。項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 12給藥方案給藥方案 青霉胺組：青霉胺(上海信誼制藥公司生產(chǎn))，劑量為每日40mg/kg，連續(xù)816周骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)：將3l06細(xì)胞/ml的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞液2ml+生理鹽水100ml經(jīng)靜脈移入人體。每10天靜脈干細(xì)胞移植一次，三次為一個(gè)療程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)加青霉胺組：將3l06細(xì)胞/ml的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞液2m+生理鹽水100ml經(jīng)靜脈移入人體，每10天靜脈干細(xì)胞移植一次，三次為一個(gè)療程。另將青霉胺（

9、劑量為每日40mg/kg），每日分3次口服，連續(xù)816周項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 13標(biāo)本收集標(biāo)本收集分別于治療后3、6、9、12個(gè)月抽取病人外周血1.2ml，用于細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量檢測(cè)；治療后1年進(jìn)行肝臟組織病理檢查項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 14觀察指標(biāo)與方法觀察指標(biāo)與方法取血1.2ml，血標(biāo)本經(jīng)低速冷凍離心(3000轉(zhuǎn)/分)10分鐘后取血清約0.5ml進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目檢測(cè)。如：血清生化、肝纖維化指標(biāo)及相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)血清銅藍(lán)蛋白采用免疫比濁法，ALT采用比色法，LN、HA采用放射免疫法(RIA)，PDGF、 TGF1、IL-10、TNF-、MMP-1及TIM

10、P-1采用ELISA法肝臟組織病理檢查:肝臟標(biāo)本均作連續(xù)切片，每份標(biāo)本均行下述檢查：普通HE染色、膠原纖維采用Masson氏染色、網(wǎng)狀纖維采用Gomori染色 肝臟組織銅含量測(cè)定采用原子吸收分光光度法檢測(cè)項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 15統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS處理，各組間比較采用one way ANOVA 分析項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 16關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù) 肝臟穿刺可能會(huì)給病人帶來(lái)一定的痛苦和創(chuàng)傷，我們將請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生在彩超監(jiān)測(cè)下進(jìn)行活檢 建立一套穩(wěn)定的檢測(cè)細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量方法直關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶時(shí)，出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，對(duì)于這一問題，

11、我們正請(qǐng)有關(guān)專家?guī)椭⒎€(wěn)定、可靠的方法項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 17 技術(shù)路線技術(shù)路線項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 18本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處 首次應(yīng)用人骨髓干細(xì)胞移植干預(yù)HLD患者，為開展骨髓干細(xì)胞移植治療HLD肝纖維化提供新的 理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù)項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容 19已具備的試驗(yàn)手段已具備的試驗(yàn)手段 南方醫(yī)科大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院2008年成立了院士工作站，并開展了干細(xì)胞治療。與此相適應(yīng)的投入一千萬(wàn)元建立了一個(gè)現(xiàn)代化試驗(yàn)室，配備了先進(jìn)的試驗(yàn)設(shè)備。有能力提供高質(zhì)量、高活性的細(xì)胞 該研究與我們剛獲得的國(guó)家自然基金項(xiàng)目可以共享試驗(yàn)設(shè)備和人力資源，我們

12、又投入500多萬(wàn)元，購(gòu)買了與試驗(yàn)相關(guān)的設(shè)備， 如ABI3730XL序列儀、高速冷凍離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、PCR儀、分子生物學(xué)平臺(tái)、高速離心機(jī)、懸渦振蕩器，磁力攪拌器，PH計(jì)，立式高壓消毒鍋，微波爐等 院士工作站具備完成本課題所需的條件實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件 20已具備的技術(shù)力量已具備的技術(shù)力量姓姓 名名性性 別別出生年月出生年月學(xué)學(xué) 歷歷職稱（職務(wù)）職稱（職務(wù)）從事專業(yè)從事專業(yè)工作單位及部門工作單位及部門張東鋒男1976.10碩士主治醫(yī)師神經(jīng)內(nèi)科鄭州人民醫(yī)院、腦科醫(yī)院曹 巍男1963.01博士教 授分子病理鄭州人民醫(yī)院、院士工作站王大忠男1968.08碩士副主任醫(yī)師神經(jīng)內(nèi)科鄭州人民醫(yī)院、腦科醫(yī)院吳牽峰男1973.12碩士主治醫(yī)師神經(jīng)內(nèi)科鄭州人民醫(yī)院、腦科醫(yī)院劉 榮女1975.05博士副研究員 藥理學(xué)鄭州人民醫(yī)院、院士工作站張 巖男1983.02學(xué)士住院醫(yī)師神經(jīng)內(nèi)科鄭州人民醫(yī)院、腦科醫(yī)院葛長(zhǎng)勇男1970.02博士副研究員干細(xì)胞研究鄭州人民醫(yī)院、院士工作站實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件 21項(xiàng)目的預(yù)期經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益項(xiàng)目的預(yù)期經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益通過以下三方面的研究 評(píng)價(jià)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療HLD患者的安全性和有效性（血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能） 探討經(jīng)人靜脈骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)肝纖維化的病理過程 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞