第六節(jié) 藥物的抗病毒實(shí)驗(yàn) - 安徽醫(yī)科大學(xué)

1、第六節(jié)第六節(jié) 藥物的抗病毒實(shí)驗(yàn)藥物的抗病毒實(shí)驗(yàn)一、目的和要求一、目的和要求1.掌握藥物體外抗病毒的實(shí)驗(yàn)方法和操作步驟。2.熟悉病毒感染性動物模型的建立和評價(jià)。二、內(nèi)容二、內(nèi)容（一）原理（一）原理 病毒是一類結(jié)構(gòu)簡單、非細(xì)胞形態(tài)的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，必須在易感的活的動物、雞胚或細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行復(fù)制增殖。因此可用動物、雞胚或細(xì)胞來進(jìn)行病毒培養(yǎng)和藥物的抗病毒試驗(yàn)。可通過觀察細(xì)胞培養(yǎng)液酸堿度的變化、病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）、病毒滴度（PFU）改變、病毒基因組mRNA水平變化、雞胚尿囊液或動物血清等相應(yīng)指標(biāo)的改變，來判斷藥物的抗病毒試驗(yàn)效果。（二）材料（二）材料1. 910 d日齡雞胚，殼白凈且厚

2、薄均勻的雞卵（萊亨雞的受精卵由于卵殼薄，在孵育過程中便于檢查，為首選）2. Hep-2細(xì)胞或MDCK細(xì)胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.藥物：試驗(yàn)藥物，陽性對照藥5.動物：小鼠等（三）操作方法（三）操作方法 雞胚培養(yǎng)為常用的病毒培養(yǎng)法之一，目前主要用于痘類病毒、粘病毒、皰疹病毒的分離、鑒定、制備抗原和疫苗的生產(chǎn)等。1.接種方法接種方法病毒的雞胚培養(yǎng)法主要有四種接種途徑，即尿囊腔、絨毛尿囊膜、羊膜腔和卵黃囊，不同的病毒應(yīng)選擇各自適宜的接種途徑，并根據(jù)接種途徑確定雞胚的孵育日齡（見表）。下面將以流感病毒為例進(jìn)行說明。一）雞胚法一）雞胚法表6-1 雞胚孵育日齡及接種途徑選擇接

3、種病毒名稱接種病毒名稱接種部位接種部位雞胚日齡雞胚日齡收獲材料收獲材料痘類病毒、單純皰疹病毒絨毛尿囊膜9-10絨毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒初次分離羊膜腔12-14羊水某些嗜神經(jīng)性病毒卵黃囊5-6卵黃液2. IFV-FM1的的50%雞胚感染量（雞胚感染量（EID50）測定）測定 用生理鹽水將病毒作10倍系列稀釋，分別接種雞胚，0.1ml /胚，同時(shí)設(shè)正常對照，共6組，每組5胚。35孵育72 h，置4冰箱過夜，收集尿囊液做血凝試驗(yàn)，按Reed-Muench法計(jì)算FM1的EID50。3. 藥物對雞胚的毒性作用藥物對雞胚的毒性作用 選用健康的911日齡雞胚，消毒備用。將受

4、試藥和對照藥作10倍系列稀釋56個濃度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100g/ml、10g/ml，每個濃度接種5胚，0.25ml /胚。35培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果（死亡/存活）。確定兩種藥物對雞胚的最大無毒劑量（TC0），用于正式實(shí)驗(yàn)。4. 藥物對藥物對FM1的抑制作用的抑制作用 雞胚隨機(jī)分為14組，每組5胚，即試驗(yàn)藥的六個劑量組（從TC0開始作10倍系列稀釋）、陽性對照藥六個劑量組（同前）、生理鹽水和病毒對照組。將不同濃度的藥液注入雞胚中，0.25ml /胚，30 min后經(jīng)相同途徑注入100 EID50病毒0.1ml，對照組以生理鹽水代替。35溫箱孵育5 d。收獲尿囊液

5、，測其血凝效價(jià)，以能抑制32倍以上所注射的最小藥物量，即為其最小抑制劑量（MIC）。4.1雞胚接種雞胚接種（1）孵育910 d左右的雞胚，在照蛋燈下用蠟筆標(biāo)出氣室和胎位。（2）雞胚直立于固定架上，氣室端向上，按常規(guī)以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在氣室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸取病毒懸液，針頭從氣室小孔刺入，沿胚胎的長軸刺入0.51.0cm深度；此時(shí)針頭已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒懸液。（5）拔出針頭，用鑷子將膠布沾酒精燒灼后將小孔封閉，置于3536溫箱內(nèi)培養(yǎng)二天，每天翻動兩次，用照蛋燈檢視一次。培養(yǎng)二天后。置 -20冰箱2 h后，無菌操作收獲尿囊液。4.2尿囊液的

6、收獲尿囊液的收獲（1）從冰箱中取出雞胚，用碘酒，酒精消毒氣室部位。（2）用無菌鑷子除去膠布并去除氣室部分的卵殼。（3）用無菌的毛細(xì)吸管插入尿囊腔中輕輕吸取尿囊液（避免血管破裂），置于無菌試管中。（4）獲得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制試驗(yàn)（定性），判斷病毒的增殖情況并對病毒進(jìn)行鑒定；同時(shí)做無菌實(shí)驗(yàn)。4.3血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)（1）血凝實(shí)驗(yàn)血凝實(shí)驗(yàn)的具體操作方法，參照本教材的第四章第四節(jié)內(nèi)容：病毒的分離培養(yǎng)鑒定和血清學(xué)檢測。 結(jié)果判斷 以“+”號多少表示血凝程度： + 100的RBC發(fā)生血凝，形成花邊拉網(wǎng)狀，紅細(xì)胞呈薄層均勻鋪于板孔底，呈細(xì)沙狀或薄膜狀； + 75的RBC發(fā)生血

7、凝，紅細(xì)胞雖鋪于孔底，呈細(xì)沙狀，但邊緣不整有下沉趨勢； + 50的RBC發(fā)生血凝，紅細(xì)胞在孔底呈一環(huán)狀，四周有小凝集塊； + 25的RBC發(fā)生血凝，紅細(xì)胞在孔底沉聚呈小圓點(diǎn)，邊緣不光滑，周圍有小凝集塊； - 100的RBC沉積，紅細(xì)胞于孔底呈一小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，無凝集現(xiàn)象。以使50的RBC發(fā)生凝集的最高稀釋倍數(shù)，為病毒的血凝效價(jià)。計(jì)算藥物的MIC。（2）病毒血凝抑制實(shí)驗(yàn) 根據(jù)血凝試驗(yàn)滴定的病毒血凝效價(jià)，以“2”的凝集者含有1個病毒血凝單位。如流感病毒的血凝效價(jià)為1:160，即病毒液稀釋至1:160時(shí)，每0.25ml中含1個血凝單位，若要將0.25ml病毒液配制成含4個血凝單位時(shí)，應(yīng)稀釋成1

8、:（1604），即1:40稀釋。在做血凝抑制試驗(yàn)時(shí)用4個血凝單位。 將病毒液配成4個血凝單位。血凝抑制實(shí)驗(yàn)的方法，參照本教材的第四章第四節(jié)內(nèi)容：病毒的分離培養(yǎng)鑒定和血清學(xué)檢測。 主要根據(jù)細(xì)胞對病毒的敏感性選擇適宜細(xì)胞株。人類病毒用人或猴的組織較敏感，因此，研究人的病毒性疾病常用人胚腎、人胚肺或人羊膜細(xì)胞。組織培養(yǎng)的方法中以單層細(xì)胞培養(yǎng)是最常用的方法，它又有原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)、二倍體細(xì)胞株和傳代細(xì)胞系三種類型。本實(shí)驗(yàn)僅介紹對傳代細(xì)胞的操作方法。二）細(xì)胞培養(yǎng)法二）細(xì)胞培養(yǎng)法1.病毒病毒TCID50滴定滴定（1）原理 多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞后，常引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞團(tuán)縮、裂解和細(xì)胞腫大等，

9、這種改變稱為病毒致病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色得以識別和判斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來測定病毒的毒力。即能在半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板孔或試管內(nèi)引起細(xì)胞發(fā)生病變所需的病毒量，定義為病毒的50組織細(xì)胞感染指數(shù)（50tissue culture infectious dose，TCID50）。在從事藥物的抗病毒試驗(yàn)中，常用100 TCID50的病毒感染量進(jìn)行。 測定時(shí)，首先在微量細(xì)胞板上培養(yǎng)敏感細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做連續(xù)10倍系列稀釋后加入細(xì)胞單層，逐日觀察，直至病毒產(chǎn)生的CPE不

10、再進(jìn)展為止。具體時(shí)間根據(jù)病毒的增殖特點(diǎn)而定，如腸道病毒增殖迅速，一般48 h即可；RSV、VSV增殖也較快，因此4872 h也可以觀察、染色、計(jì)算。（2）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：MDCK細(xì)胞或Hep-2細(xì)胞，或其它敏感細(xì)胞。病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、鏈霉素100 U/ml，MTT (4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，結(jié)晶紫染液等。材料：細(xì)胞培養(yǎng)板（1塊/組），tip頭（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/組），青霉素瓶帶塞（10個/組），酒精缸，鑷子（2個

11、/組），1ml注射器，毛細(xì)吸管等。（3）操作步驟1）制備細(xì)胞將細(xì)胞生長面朝上，輕輕倒掉瓶中培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌2次，注意吸管尖頭不要伸到細(xì)胞瓶中。用上述吸管吸取1ml VTP加入細(xì)胞瓶中，鋪滿整個細(xì)胞生長面即可；室溫或手握住消化，約35min。當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大呈拉網(wǎng)狀后，即可停止消化，盡可能棄盡消化液，繼續(xù)利用殘余的消化液消化，直至細(xì)胞大部分易在外力作用下從細(xì)胞瓶表面脫落下來為止。加入適量營養(yǎng)液到細(xì)胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細(xì)胞以及脫落細(xì)胞充分使細(xì)胞均勻，吹打時(shí)動作要輕柔不要用力過猛，盡可能不要出現(xiàn)泡沫。吸一滴細(xì)胞懸液于Ep管中。計(jì)數(shù)：用吸管吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液與等量0

12、.04臺盼蘭混勻，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加該細(xì)胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。當(dāng)細(xì)胞密度為106/ml時(shí)即可。 一瓶細(xì)胞消化后加入適量營養(yǎng)液制成所需細(xì)胞懸液，濃度約為1106/ml。用微量移液器將細(xì)胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100l，37、5%CO2孵育箱培養(yǎng)24 h，形成單層后，做病毒滴定用。2）50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）測定稀釋病毒液：取無菌青霉素瓶9支，各管分別加3%小牛血清的維持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反復(fù)吹吸混合三次，從第一管內(nèi)吸液0.3ml加入第二管內(nèi)，反復(fù)混合三次，從第二管內(nèi)吸液0.3ml加入第三管內(nèi)，反復(fù)混合三次，依此

13、類推將待測的病毒液做連續(xù)10倍稀釋，使病毒稀釋為10-1，10-2，10-3 10-9。病毒接種：將長好單層細(xì)胞的培養(yǎng)板各孔細(xì)胞液全部傾棄，用微量移液器把各稀釋度的IFV病毒從低濃度開始依次加入各微孔中，每稀釋度平行加2孔，每孔100l。細(xì)胞對照孔不加病毒液，只加維持液。置37、5%CO2孵育箱中孵育。結(jié)果觀察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置顯微鏡下觀察CPE，病毒可引起細(xì)胞圓縮、堆聚及脫落等現(xiàn)象?！?”表示細(xì)胞正常；“+”表示有25%細(xì)胞產(chǎn)生病變、圓縮、破碎脫落；“2+”有50%細(xì)胞產(chǎn)生病變；“3+”有75%細(xì)胞產(chǎn)生病變；“4+”有75%以上細(xì)胞產(chǎn)生病變（實(shí)驗(yàn)時(shí)，有的觀察24h

14、48 h即可染色計(jì)算；或逐日觀察CPE，直至病毒產(chǎn)生的CPE不再進(jìn)展為止）。3）按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，參見下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累積數(shù)（孔）累積數(shù)（孔）病變細(xì)胞孔病變細(xì)胞孔病毒稀釋度病毒稀釋度 病變孔病變孔數(shù)數(shù)/接種孔數(shù)接種孔數(shù)有病變有病變無病變無病變比例比例百分比百分比% 按表中可見，10-3稀釋的病變高于50%；10-4稀釋的病變低于50%；50%病變分布于10-3與10-4之間，計(jì)算公式如下： 高于5

15、0%病變率 -（50%） 距離比例= - 高于50%的病變率-低于50%的病變率 lg稀釋倍數(shù) 100-50 = - 100-25 lg10= -0.67lg TCID50 =高于50%病變的低稀釋度對數(shù)+距離比= -3+(-0.67)=-3.67 即1個TCID50=10-3.67，查0.67的反對數(shù)為4.68，即病毒做4.68103倍稀釋時(shí)取0.1ml接種細(xì)胞，可使50%細(xì)胞產(chǎn)生病變。附錄：如何計(jì)算200個TCID50？4.68103200=23.4，將病毒作23.4倍稀釋時(shí)即得200個TCID50。 按計(jì)算結(jié)果，用100個TCID50病毒進(jìn)行藥物的體外抗病毒試驗(yàn)。2.病毒增殖及病毒感染單

16、位量測定病毒增殖及病毒感染單位量測定2.1病毒增殖病毒增殖 將凍存的病毒株復(fù)蘇后接種于敏感細(xì)胞進(jìn)行增殖，23 d后出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，待病變達(dá)8090時(shí)收獲病毒。反復(fù)凍融3次并低速離心取上清，分裝后用空斑形成單位實(shí)驗(yàn)（plaque forming unit, PFU）測定病毒的感染量，保存于-80備用。在進(jìn)行藥物的抗病毒試驗(yàn)中，亦可用該實(shí)驗(yàn)測定藥物對病毒增殖的影響，而且結(jié)果可能更準(zhǔn)確、可靠。2.2病毒感染單位量測定病毒感染單位量測定用 PFU 表示。 以5.0105 /ml的密度接種敏感細(xì)胞于6孔細(xì)胞板中。置37、5CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其24 h內(nèi)長成單層； 在冰盤上操作，用維持液將病毒作

17、10倍連續(xù)系列稀釋（10-110-8）（操作如下圖所示）；注：即在一系列注：即在一系列2ml2ml的的EpEp管中先加入管中先加入1.8ml1.8ml維持液，維持液，取取 0.2ml 0.2ml 病毒加入第一只病毒加入第一只EpEp管中，充分混勻后病毒稀管中，充分混勻后病毒稀釋度為釋度為1010-1，取混合后的，取混合后的0.2ml0.2ml 病毒懸液加入第二只病毒懸液加入第二只EpEp管中作為稀釋度管中作為稀釋度10-2，依此類推作系列稀釋，則得到連，依此類推作系列稀釋，則得到連續(xù)續(xù)1010倍稀釋的病毒懸液。倍稀釋的病毒懸液。 棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔中的營養(yǎng)液，每孔接種相應(yīng)稀釋度的病毒懸液0.

18、5ml，每個稀釋度重復(fù)3孔。37吸附2 h，每15min搖動數(shù)下以保證病毒吸附分布均勻； 棄去各孔中的病毒液，PBS輕輕洗滌一次。每孔加入2ml覆蓋層（含6新生牛血清的DMEM與1.5瓊脂糖等體積混勻，配好后立即使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固； 33，5CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。剔除覆蓋層，每孔加入1ml 0.5結(jié)晶紫染色10min，自來水沖洗后選擇空斑數(shù)清晰且易于分辨的稀釋度計(jì)數(shù)空斑，根據(jù)空斑數(shù)計(jì)算病毒的PFU。下圖顯示的是RSV的空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PFU的計(jì)算方法： ab PFU v（PFU：空斑形成形成單位/ml； a：空斑均數(shù)；b：病毒稀釋度的倒數(shù)；v：病毒量/ml）

19、1：正常對照；：正常對照；2 26 6：病毒稀釋度分別為：病毒稀釋度分別為104，10105，10106，10107，10108病毒的空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖病毒的空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖3216542.藥物對細(xì)胞的毒性測定藥物對細(xì)胞的毒性測定 已長成單層的細(xì)胞（96孔板），傾去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入用無血清1640作連續(xù)10倍系列稀釋的受試藥物，100l/孔，每個濃度重復(fù)4孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。整個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 d，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），按Reed-Muench法計(jì)算藥物的半數(shù)中毒濃度（TD50）和最大無毒濃度（TD0）。陽性對照藥的毒性測定，與受試藥

20、物同法同步在同一板中進(jìn)行。4.藥物的抗病毒實(shí)驗(yàn)藥物的抗病毒實(shí)驗(yàn)4.1微量細(xì)胞病變抑制法微量細(xì)胞病變抑制法 已長成單層的細(xì)胞（96孔板），傾去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入100 TCID50病毒，100l/孔，375%CO2下吸附2h，使病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。棄病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游離病毒。加入受試藥的TD0濃度作連續(xù)2倍系列稀釋的6個濃度，每個濃度均重復(fù)3孔，并分別設(shè)立細(xì)胞對照、病毒對照和空白對照孔，陽性對照藥同上。37、5%CO2下培養(yǎng)3 d，記錄CPE，按Reed-Muench法計(jì)算能抑制50%CPE產(chǎn)生的藥物有效濃度（EC50）。整個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。4.2中性紅染色法中性紅染色法 基

21、本步驟同上，加入藥物培養(yǎng)3 d后待CPE不再進(jìn)展時(shí)，棄維持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性紅染液（0.04%），避光，37、5%CO2孵育1.5 h。棄染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml的90%乙醇（無水乙醇：0.2M，pH4.2枸櫞酸緩沖液=9：1），室溫放置23 h，搖勻，以空白對照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀546nm處比色，測定其吸光度A值。根據(jù)各組的平均A值，計(jì)算藥物的抑制百分率，再按Reed-Muench法計(jì)算50%抑制濃度（IC50）等各項(xiàng)結(jié)果。整個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 實(shí)驗(yàn)組平均實(shí)驗(yàn)組平均A值值-病毒對照組平均病毒對照組平均A值值抑制百分率抑制百分率 =細(xì)胞對照組平均細(xì)胞

22、對照組平均A值值-病毒對照組平均病毒對照組平均A值值 100%4.3 MTT法法 基本步驟同上，當(dāng)病毒對照組細(xì)胞CPE在(+ + +)(+ + + +)時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5gL MTT的培養(yǎng)液50l，繼續(xù)培養(yǎng)23 h后棄去MTT上清，每孔加DMSO 100l，混勻5min后，用酶標(biāo)儀測570nm波長處的吸光度A值。按下述公式計(jì)算藥物對病毒的抑制率： 病毒抑制率(%)=(藥物處理組A均值-病毒對照組A均值)/(細(xì)胞對照組A均值-病毒對照組A均值) 100%，結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0的Probit回歸法，或按Reed-Muench法，計(jì)算受試藥的半數(shù)中毒濃度TD5

23、0和半數(shù)有效濃度EC50，并計(jì)算藥物的治療指數(shù)（TI）。4.4空斑抑制法空斑抑制法 參照上述方法進(jìn)行（略），與病毒對照組比較，計(jì)算藥物的50%抑制濃度IC50。4.4藥物對RSV侵入細(xì)胞的阻斷作用 根據(jù)藥物毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從藥物的最大無毒濃度開始，將不同濃度受試藥100l預(yù)先處理細(xì)胞2 h, 以PBS洗滌2次后用100 TCID50 的病毒每孔100l攻擊,吸附2 h，每隔15min搖晃 1次，使病毒均勻吸附。棄病毒液,加100l細(xì)胞維持液，置37、5%CO2培養(yǎng)，每日觀察并記錄CPE。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和藥物組。當(dāng)病毒對照組CPE在75%100%時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔

24、加入含5gL MTT的培養(yǎng)液50l，繼續(xù)培養(yǎng)23h后棄去MTT上清，每孔加100l DMSO，混勻5min后，用酶標(biāo)儀測490nm波長處的A值。按Reed-Muench法計(jì)算藥物的半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50。4.5藥物對藥物對RSV的直接殺傷作用的直接殺傷作用 根據(jù)藥物毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從藥物的最大無毒濃度開始，將不同濃度的含藥維持液與100l的100 TCID50病毒等體積混合，37、5% CO2條件下作用2 h后，再將其感染Hep-2細(xì)胞，100l/孔，吸附2 h后用PBS洗滌2次，每日觀察并記錄細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和藥物組。當(dāng)

25、病毒對照組細(xì)胞CPE在75%100%時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5gL MTT的培養(yǎng)液50l，繼續(xù)培養(yǎng)23h后棄去MTT上清，每孔加DMSO100l，混勻5min后，用酶標(biāo)儀測490 nm波長處的A值。按Reed-Muench法計(jì)算藥物的半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50。5.治療指數(shù)（治療指數(shù)（TI） 按TI= TD50/EC50 或TD50/IC50進(jìn)行計(jì)算。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)定，TI4表示藥物有效。三）體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)三）體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇 試驗(yàn)動物在病毒學(xué)研究中的用途主要有：分離與鑒定病毒、制備疫苗及診斷抗原、制備免疫血清、研究病毒的致病性、免疫性、發(fā)病機(jī)理及

26、有效藥物療法等。病毒接種于何種動物以及選擇何種接種途徑，主要取決于病毒的種類和實(shí)驗(yàn)研究的目的。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇最敏感動物作為實(shí)驗(yàn)對象，常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接種時(shí)要根據(jù)病毒對動物及組織細(xì)胞的親嗜性而選擇特定的部位，常用接種途徑有鼻腔、腹腔、腦內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈及小鼠經(jīng)口接種、家兔角膜注射等。給藥方式亦可有腹腔、灌胃、靜脈注射、肌肉注射、吸入等。 采集全血、血漿、血清、組織臟器或細(xì)胞等標(biāo)本，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測。為減少個體差異，一般試驗(yàn)選擇成年動物，動物體重盡可能一致；如無特殊要求，實(shí)驗(yàn)動物的性別應(yīng)先選雄性動物或雌雄各半，且動物要健康，雌性動物懷孕及授哺期不宜采用。

27、此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究不同的精確程度要求，選擇標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)動物。標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)動物是指按遺傳控制方法和微生物控制標(biāo)準(zhǔn)培育而成的動物。按遺傳學(xué)控制原理可分為近交系、遠(yuǎn)交系、突變系、雜交一代等，按微生物學(xué)控制原理可分為無菌動物、悉生動物、無特定病原體動物、清潔動物等。病毒接種完成后，按一定級別的動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，對照組與實(shí)驗(yàn)組分籠飼養(yǎng)。2.病毒接種方法病毒接種方法2.1鼻腔接種法鼻腔接種法 實(shí)驗(yàn)組小鼠先用乙醚淺麻后，將小鼠頭部仰起，向鼻腔內(nèi)緩慢滴入一定感染量的病毒懸液100l左右，正常對照組鼻腔滴入等量不含病毒的PBS或生理鹽水，要掌握麻醉的深淺度。麻醉太深，小鼠能將病毒懸液直接吸入肺中，引起肺水腫，往往于接種后1d內(nèi)死亡；麻醉太淺，小鼠又試圖將接種物咳出。2.2小白鼠腹腔接種小白鼠腹腔接種（1）用無菌注射器以無菌操作法吸取病毒懸液，排除氣泡（將注射器針頭朝上，使氣泡上升，在針頭上裹以消毒棉球，然后輕輕將氣泡推出）。（2）右手輕拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，迅