細(xì)胞周期于凋亡

1、第七章第七章 細(xì)胞周期與腫瘤細(xì)胞周期與腫瘤 腫瘤共同特征腫瘤共同特征: : 細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞, , 細(xì)胞失控性生長。細(xì)胞失控性生長。 第一節(jié)第一節(jié) 歷史回顧歷史回顧 一、生命復(fù)制之迷被一層層揭開一、生命復(fù)制之迷被一層層揭開 第一次看見細(xì)胞；第一次看見細(xì)胞； 細(xì)胞理論細(xì)胞理論; 細(xì)胞生長過程細(xì)胞生長過程:有絲分裂期、細(xì)胞間期；有絲分裂期、細(xì)胞間期；1951年，細(xì)胞周期年，細(xì)胞周期G1期、期、S期、期、G2期、期、M期。期。傳統(tǒng)細(xì)胞周期分析：細(xì)胞的同步化；傳統(tǒng)細(xì)胞周期分析：細(xì)胞的同步化； S期或期或M期始末時(shí)間的觀察。期始末時(shí)間的觀察。 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 多參數(shù)流式

2、細(xì)胞術(shù)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù) DNA/RNA同步分析法同步分析法成熟促進(jìn)因子成熟促進(jìn)因子MPF:正常有絲分裂的啟動(dòng)因子正常有絲分裂的啟動(dòng)因子細(xì)胞分裂周期基因細(xì)胞分裂周期基因cdc MPF: p34cdc2/28，CDKs(細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶) 細(xì)胞周期素細(xì)胞周期素 Cyclins 二二.腫瘤發(fā)生、發(fā)展研究與生命復(fù)制研究的會(huì)合腫瘤發(fā)生、發(fā)展研究與生命復(fù)制研究的會(huì)合 癌基因時(shí)代癌基因時(shí)代 抑癌基因時(shí)代抑癌基因時(shí)代 多基因時(shí)代、癌基因蛋白網(wǎng)絡(luò)時(shí)代多基因時(shí)代、癌基因蛋白網(wǎng)絡(luò)時(shí)代 腫瘤多步驟理論、腫瘤多步驟理論、DNA修復(fù)理論、細(xì)胞凋亡理論修復(fù)理論、細(xì)胞凋亡理論 細(xì)胞周期核心理論

3、細(xì)胞周期核心理論三、腫瘤與細(xì)胞周期研究的重大突破三、腫瘤與細(xì)胞周期研究的重大突破 腫瘤是多基因變化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)腫瘤是多基因變化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞失控性生長所致的一類疾病。胞失控性生長所致的一類疾病。 腫瘤是多步驟發(fā)生、多基因突變的進(jìn)化性腫瘤是多步驟發(fā)生、多基因突變的進(jìn)化性疾病。疾病。 1. “二次打擊學(xué)說二次打擊學(xué)說”：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 具有一種遺傳缺陷的子代只是易患腫瘤，具有一種遺傳缺陷的子代只是易患腫瘤，還需要另外的基因缺陷，才發(fā)生腫瘤。還需要另外的基因缺陷，才發(fā)生腫瘤。 腫瘤抑制基因從結(jié)構(gòu)破壞到功能喪失。腫瘤抑制基因從結(jié)構(gòu)破壞到功能喪失。 2. 腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)

4、腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)化細(xì)胞克隆進(jìn)化的過程的過程 結(jié)腸癌：結(jié)腸癌：APC(腫瘤抑制基因腫瘤抑制基因), ras（信號(hào)（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑), p53（腫瘤抑制基因（腫瘤抑制基因)，DCC（粘附（粘附因子因子) 基因階段性突變基因階段性突變 癌基因、抑癌基因的功能效應(yīng)，都從不同的癌基因、抑癌基因的功能效應(yīng)，都從不同的途徑最終會(huì)聚到細(xì)胞周期機(jī)制上來，直接參與途徑最終會(huì)聚到細(xì)胞周期機(jī)制上來，直接參與調(diào)控或作為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的主要成分。調(diào)控或作為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的主要成分。 腫瘤是一類腫瘤是一類多步驟、多基因突變多步驟、多基因突變所致的所致的細(xì)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞、細(xì)胞克隆性、進(jìn)化性疾胞周期

5、調(diào)控機(jī)制破壞、細(xì)胞克隆性、進(jìn)化性疾病。病。 第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞周期機(jī)制的核心細(xì)胞周期機(jī)制的核心 CDKsCDKs調(diào)控機(jī)制調(diào)控機(jī)制 間期：間期：G1 、 S、G2期期 有絲分裂期：有絲分裂期：M期期 細(xì)胞周期調(diào)控核心機(jī)制：細(xì)胞周期調(diào)控核心機(jī)制： 依賴于細(xì)胞周期素特異性、時(shí)相性表達(dá)、依賴于細(xì)胞周期素特異性、時(shí)相性表達(dá)、累積與分解的累積與分解的CDKs 的時(shí)相激活。的時(shí)相激活。 CDK 催化亞單位：底物結(jié)合部位催化亞單位：底物結(jié)合部位 含含ATP結(jié)合位點(diǎn)側(cè)鏈結(jié)合位點(diǎn)側(cè)鏈 細(xì)胞周期調(diào)控核心：蛋白激酶細(xì)胞周期調(diào)控核心：蛋白激酶 M M期期： CDC2 cyclinCDC2 cyclin B1 B1； G

6、2G2期期：CDK2 cyclinCDK2 cyclin A A； S S期期： CDK2 cyclinCDK2 cyclin E; E; G1G1期期: CDK4,6- cyclin: CDK4,6- cyclin D1, D2, D3 D1, D2, D3 細(xì)胞周期過程中，某一細(xì)胞周期過程中，某一CDKCDK含量恒定，活含量恒定，活化與非活化化與非活化CDKCDK的總量不變。的總量不變。 一、一、CyclinsCyclins是調(diào)控是調(diào)控CDKsCDKs活性的最基本成分活性的最基本成分 特異性區(qū)域：特異性區(qū)域： 細(xì)胞周期素盒細(xì)胞周期素盒cyclincyclin box box：結(jié)合并激活：結(jié)

7、合并激活CDK CDK ； 特別區(qū)間特別區(qū)間：引導(dǎo)：引導(dǎo)CDKsCDKs到特定底物亞細(xì)胞部位。到特定底物亞細(xì)胞部位。 CyclinCyclin蛋白功能：蛋白功能： 激活激活CDKsCDKs并加強(qiáng)并加強(qiáng)CDKsCDKs對(duì)底物的作用。對(duì)底物的作用。 CyclinCyclin功能的調(diào)控：功能的調(diào)控： 依賴其蛋白質(zhì)水平的細(xì)胞周期特異性起伏。依賴其蛋白質(zhì)水平的細(xì)胞周期特異性起伏。 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的降解，控制著細(xì)胞周期內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的降解，控制著細(xì)胞周期內(nèi)一系列事件的運(yùn)行順序、方向和協(xié)調(diào)。一系列事件的運(yùn)行順序、方向和協(xié)調(diào)。 1. 1. 蛋白質(zhì)降解：蛋白質(zhì)降解： 19831983年首次提出；年首次提出

8、； 19891989年進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)；年進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)； 19911991年實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。年實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。 2.泛肽化介導(dǎo)的泛肽化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)水解 ：多個(gè)多個(gè)泛肽鏈接在底物上，被蛋白酶體識(shí)別、降解泛肽鏈接在底物上，被蛋白酶體識(shí)別、降解 E1 激活酶：激活酶： E1泛肽羥基泛肽羥基 硫酯結(jié)合硫酯結(jié)合； E2 結(jié)合酶：結(jié)合酶： E3 連接酶：靶蛋白的賴氨酸殘基連接酶：靶蛋白的賴氨酸殘基 SCF：G1/S期期 APC(anaphase promoting complex)：M期期 3. G1-S轉(zhuǎn)換中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換中的蛋白質(zhì)水解水解 SCF復(fù)合物：復(fù)合物： Skp1 、Cdc53/cullin 、

9、F-box(Protain) 有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)控蛋白有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)控蛋白Weel也同樣受到也同樣受到SCF系統(tǒng)的調(diào)控：當(dāng)系統(tǒng)的調(diào)控：當(dāng)Weel降解后，伴隨著降解后，伴隨著DNA復(fù)制的完成，細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。復(fù)制的完成，細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。 SCF系統(tǒng)的兩類底物：系統(tǒng)的兩類底物：cdc4 Sicl 4.有絲分裂中蛋白質(zhì)水解有絲分裂中蛋白質(zhì)水解 APC ： 有絲分裂后期促動(dòng)因子復(fù)合物有絲分裂后期促動(dòng)因子復(fù)合物 Cdc16, Cdc23, Cdc27 Cyclin B/Cdk1：1）驅(qū)動(dòng)著細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂）驅(qū)動(dòng)著細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，阻滯細(xì)胞完成有絲分裂；期，阻滯細(xì)胞完成有絲分裂； 2）滅活機(jī)制：

10、）滅活機(jī)制：APC催化催化Cyclin B降解降解; CDK抑制物抑制物Sic1與與Cyclin BCdk1復(fù)合物結(jié)合復(fù)合物結(jié)合; CyclinB降解降解 Cfi1：細(xì)胞間期，核仁，直接與：細(xì)胞間期，核仁，直接與Cdc14結(jié)合；結(jié)合；使使Cdc14磷酸化失活；磷酸化失活； Cdc14：1）磷酸酶，使轉(zhuǎn)錄因子）磷酸酶，使轉(zhuǎn)錄因子Swi5去磷酸化，去磷酸化，產(chǎn)生新的產(chǎn)生新的Sci1，后者被，后者被Cyclin B/Cdk1磷酸化而磷酸化而降解；降解； 2) 使使Sci1去磷酸化，降低去磷酸化，降低CyclinB/Cdk1 活性，通過活性，通過Cdh1去磷酸化，能去磷酸化，能與與APC結(jié)合，使結(jié)合，

11、使Cyclin B降解，降解，Cyclin B/Cdk1復(fù)合物徹底失活。復(fù)合物徹底失活。 APC 激活，使激活，使Cyclin B降解，降解， Cyclin B/Cdk1復(fù)合物滅活和復(fù)合物滅活和Sci1累積，使細(xì)胞出有絲累積，使細(xì)胞出有絲分裂后期，完成有絲分裂，進(jìn)入早分裂后期，完成有絲分裂，進(jìn)入早G1期。期。 二、二、Thr 160/161 磷酸化磷酸化 Thr160/161磷酸化是磷酸化是CDK激活的重要條件。激活的重要條件。 CAK(CDK-activating kinase)： CDK激活性蛋白激酶激活性蛋白激酶 1)催化亞單位蛋白激酶催化亞單位蛋白激酶MO1(CDK7);Cyclin

12、H； 2)一種一種CAK能使所有主要的能使所有主要的CDK-Cyclin底物底物 磷酸化而激活；磷酸化而激活； 3) 活性在細(xì)胞周期中無起伏狀態(tài)；活性在細(xì)胞周期中無起伏狀態(tài)； 4) 不是限速步驟。不是限速步驟。 滅活滅活CDK-Cyclin復(fù)合物重要機(jī)制：復(fù)合物重要機(jī)制： 1）Cyclin的去除；的去除； 2）Thr160/161 去磷酸化去磷酸化.三、三、Thr14 / Tyr15 磷酸化和去磷酸化磷酸化和去磷酸化 是是CDK 激活及失活的重要環(huán)節(jié)激活及失活的重要環(huán)節(jié)。 磷酸化磷酸化蛋白激酶蛋白激酶Weel , 使使 CDC2上的上的 Thr14 / Tyr15 磷酸化；磷酸化；磷酸酶磷酸酶

13、CDC25 使使CDC2上的上的 Thr14 / Tyr15 去磷酸化。去磷酸化。 CDC2的激活過程的激活過程： Cyclin B1與與CDC2結(jié)合結(jié)合； Weel對(duì)對(duì)Thr14/Tyr15進(jìn)行磷酸化，抑制進(jìn)行磷酸化，抑制CDC2的活性；的活性； CAK對(duì)對(duì)Thr160/161進(jìn)行磷酸化進(jìn)行磷酸化; CDC25 激活，使激活，使Thr14/Tyr15 去磷酸化；去磷酸化； CDC2被激活。被激活。 CDK激活條件：激活條件： 1. 與特定與特定Cyclin結(jié)合；結(jié)合； 2. Thr14/Tyr15磷酸化及去磷酸化；磷酸化及去磷酸化； 3. CAK 使使Thr160/161磷酸化；磷酸化； 4

14、. Cyclin-CDK活性高于活性高于CKI。 CDK失活條件：失活條件： 1. Cyclin 降低；降低； 2. Thr14/Tyr15磷酸化；磷酸化； 3. Thr160/161去磷酸化；去磷酸化； 4. TGF-11存在（存在（Cyclin D, E-CDK2, A ）；）； 5. CKI結(jié)合并失活結(jié)合并失活Cyclin-CDK。四、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物四、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物 調(diào)控調(diào)控CDKsCDKs活性機(jī)制：活性機(jī)制： CyclinsCyclins、CAKCAK、 Weel/Cdc25 Weel/Cdc25 的磷酸化和的磷酸化和去磷酸化、去磷酸化、CKIsCKIs（

15、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑（細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物）制物） CKICKI家族兩大類：家族兩大類： 1) 1) CipCip/Kip /Kip 家族：家族：p21 p27 p57p21 p27 p57 N N端端: :與與CDKCDK結(jié)合的相同結(jié)構(gòu)域；結(jié)合的相同結(jié)構(gòu)域； 與與CDKCDK結(jié)合后，抑制結(jié)合后，抑制G1G1、S S期期CyclinCyclin-CDK ,-CDK ,是控制是控制G1/SG1/S轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換的CDKCDK的抑制劑的抑制劑 ； C C端端: :結(jié)構(gòu)與功能各不相同。結(jié)構(gòu)與功能各不相同。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：p21 Cp21 C端有端有PCNAPCNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合結(jié)構(gòu)域， p2

16、1 p21 有兩個(gè)有兩個(gè)p27p27結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn) 2)2) INK4INK4家族家族：p15 p16 p18 p19p15 p16 p18 p19 主要與主要與CDK4CDK4、CDK6CDK6的抑制密切有關(guān)。的抑制密切有關(guān)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： p16p16不隨細(xì)胞周期時(shí)相變化；不隨細(xì)胞周期時(shí)相變化； p19 p19 隨細(xì)胞周期規(guī)律性震蕩。隨細(xì)胞周期規(guī)律性震蕩。 TGF-TGF-11能促進(jìn)能促進(jìn) p15 mRNA p15 mRNA 表達(dá)，抑制細(xì)表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。胞增殖。 CKIsCKIs所識(shí)別的是多數(shù)所識(shí)別的是多數(shù)CDK-CyclinCDK-Cyclin復(fù)合物，復(fù)合物，不是不是CDKCDK單

17、體；單體；p16 INK4ap16 INK4a同同CDK4 CDK4 單體結(jié)合。單體結(jié)合。 當(dāng)當(dāng) DNADNA損傷及細(xì)胞衰老，具有轉(zhuǎn)錄因子作損傷及細(xì)胞衰老，具有轉(zhuǎn)錄因子作用的用的 p53p53增高，誘導(dǎo)增高，誘導(dǎo) p21Cip1p21Cip1的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，后的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，后者與相應(yīng)的者與相應(yīng)的 CDK-CyclinCDK-Cyclin 復(fù)合物結(jié)合，抑制蛋復(fù)合物結(jié)合，抑制蛋白激酶的激活，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)行。白激酶的激活，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)行。 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞周期調(diào)控的兩大機(jī)制細(xì)胞周期調(diào)控的兩大機(jī)制 一系列一系列CyclinsCyclins 時(shí)相性起伏，相應(yīng)時(shí)相性起伏，相應(yīng)CDKsCDKs依依次激活

18、，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞通過次激活，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞通過G1G1、S S、G2G2期，到達(dá)期，到達(dá)M M期。期。 一、一、細(xì)胞周期的啟動(dòng)機(jī)制細(xì)胞周期的啟動(dòng)機(jī)制 主要調(diào)控點(diǎn)：主要調(diào)控點(diǎn)：G1G1期期 酵母：酵母：“起始點(diǎn)起始點(diǎn)” ” STARTSTART，細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)，細(xì)胞內(nèi)外信號(hào) 人類細(xì)胞：人類細(xì)胞： “ “限制點(diǎn)限制點(diǎn)” ” restriction pointrestriction point， 早期應(yīng)答基因（早期應(yīng)答基因（c-Fosc-Fos,c-Jun),c-Jun), 延遲應(yīng)答基因延遲應(yīng)答基因 (Cyclin(Cyclin D) D) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 細(xì)胞周期的聯(lián)結(jié)途徑：細(xì)胞周期的聯(lián)結(jié)途徑： Cyclin

19、Cyclin D - Cdk4/6 D - Cdk4/6 CyclinCyclin E - Cdk2 E - Cdk2 G1G1期限速步驟期限速步驟 生長信號(hào)（信號(hào)途徑、早期應(yīng)答基因）生長信號(hào)（信號(hào)途徑、早期應(yīng)答基因） Cyclin D,CyclinCyclin D,Cyclin D-Cdk4/6 D-Cdk4/6 CyclinCyclin D-Cdk4/6 - p27Kip1 D-Cdk4/6 - p27Kip1復(fù)合物復(fù)合物 Cdk4/6Cdk4/6攝取、轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)攝取、轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán) 1 1）pRBpRB低磷酸化狀態(tài)：低磷酸化狀態(tài)：pRBpRB與與E2FE2F結(jié)合，抑制結(jié)合，抑制S S期必

20、須基因產(chǎn)物表達(dá)，阻止期必須基因產(chǎn)物表達(dá)，阻止G1/SG1/S、DNADNA合成，合成，阻斷細(xì)胞周期；阻斷細(xì)胞周期； 2）pRB高磷酸化狀態(tài)：高磷酸化狀態(tài)：pRB失活，釋放轉(zhuǎn)錄失活，釋放轉(zhuǎn)錄因子（如因子（如E2F），產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞），產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行；周期的進(jìn)行；Cyclin E升高，升高，Cyclin E-Cdk2復(fù)合物，促使復(fù)合物，促使p27Kip1減少，減少，Cdk2活化；活化；Cyclin E-Cdk2使使p27Kip1磷酸化，成為泛肽磷酸化，成為泛肽化蛋白水解的靶化蛋白水解的靶 ，降解。，降解。 正是正是Rb pathway 的的E2F正反饋機(jī)制協(xié)同正反饋機(jī)

21、制協(xié)同 p27Kip1降解機(jī)制，使細(xì)胞在降解機(jī)制，使細(xì)胞在“restriction point”后，越來越少地依賴生長因子或有絲分后，越來越少地依賴生長因子或有絲分裂因子。裂因子。 二、二、 細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制 檢測(cè)點(diǎn)檢測(cè)點(diǎn) checkpointcheckpoint 功能分類功能分類: DNA: DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)損傷檢測(cè)點(diǎn) 時(shí)相次序檢測(cè)點(diǎn)時(shí)相次序檢測(cè)點(diǎn) 監(jiān)控機(jī)制監(jiān)控機(jī)制: : 探測(cè)部分（特定基因產(chǎn)物）探測(cè)部分（特定基因產(chǎn)物） 制動(dòng)部分（細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）制動(dòng)部分（細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)） 檢修部分檢修部分 處理部分處理部分 1. DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)損傷檢測(cè)點(diǎn) p53 pathway ;

22、Cdc25 pathway DNA損傷損傷，信號(hào)傳遞給信號(hào)傳遞給p53; p53 穩(wěn)定性增高，穩(wěn)定性增高，p53蛋白水平升高蛋白水平升高; 啟動(dòng)啟動(dòng)p21的轉(zhuǎn)錄，的轉(zhuǎn)錄，p21蛋白迅速升高，與多蛋白迅速升高，與多種種CDK-Cyclin復(fù)合物直接結(jié)合復(fù)合物直接結(jié)合, 抑制抑制CDKs的的激活激活，阻滯阻滯G1/S的過渡的過渡，為修復(fù)為修復(fù)DNA提供足夠提供足夠的時(shí)間。的時(shí)間。 ARF-Mdm2-p53 pathwayARF-Mdm2-p53 pathway INK4a INK4a基因編碼基因編碼 p16INK4ap16INK4a、ARF/p14ARFARF/p14ARF）。）。 RbRb pa

23、thway pathway激活后，激活后，E2F1E2F1、MycMyc等將導(dǎo)致等將導(dǎo)致ARFARF蛋蛋白的積累：白的積累：1 1）破壞破壞Mdm2Mdm2的功能（阻斷的功能（阻斷p53p53轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄、使使p53p53泛肽化、強(qiáng)制性使泛肽化、強(qiáng)制性使p53p53轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中），轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中），結(jié)果是結(jié)果是p53p53出現(xiàn)積累，導(dǎo)致細(xì)胞周期運(yùn)行滯留，出現(xiàn)積累，導(dǎo)致細(xì)胞周期運(yùn)行滯留，乃至發(fā)生細(xì)胞凋亡；乃至發(fā)生細(xì)胞凋亡； 2 2）細(xì)胞對(duì)細(xì)胞對(duì)DNADNA損傷更為敏感。損傷更為敏感。 G2G2期檢測(cè)點(diǎn)：期檢測(cè)點(diǎn)： 當(dāng)當(dāng)DNADNA損傷，激活損傷，激活hATM/hATRhATM/hATR，使，使Chk

24、1Chk1蛋白蛋白激酶激酶磷酸化磷酸化，作用于磷酸酶作用于磷酸酶Cdc25(Ser-216Cdc25(Ser-216磷磷酸化酸化) )，磷酸化后，磷酸化后Cdc25Cdc25與與14-3-314-3-3蛋白結(jié)合、扣蛋白結(jié)合、扣留、失活，不能將留、失活，不能將CDC2CDC2蛋白激酶蛋白激酶Thr-14/Tyr-Thr-14/Tyr-1515位去磷酸化，使位去磷酸化，使CDC2CDC2不能激活不能激活，導(dǎo)致，導(dǎo)致G2G2期阻期阻滯。滯。 2.時(shí)相次序檢測(cè)點(diǎn)時(shí)相次序檢測(cè)點(diǎn) 有絲分裂與有絲分裂與DNA復(fù)制嚴(yán)格的時(shí)相次序。復(fù)制嚴(yán)格的時(shí)相次序。 1）有絲分裂促進(jìn)因子有絲分裂促進(jìn)因子MPF：G2、S期，期

25、， 誘發(fā)誘發(fā) 有絲分裂；染色體凝集。有絲分裂；染色體凝集。 2）S期促進(jìn)因子期促進(jìn)因子SPF： 誘發(fā)誘發(fā)G1期細(xì)胞核進(jìn)入期細(xì)胞核進(jìn)入S期；期； S期期CDKs存在于存在于S期的開始到期的開始到M期的結(jié)束；期的結(jié)束； 只啟動(dòng)一次只啟動(dòng)一次DNA復(fù)制。復(fù)制。 3）S期啟動(dòng)期啟動(dòng) (1) S期開始前組裝期開始前組裝pre-RC（復(fù)制前復(fù)合物復(fù)制前復(fù)合物） ORC Cdc6p Mcm (2) S期期CDKs和和DDK（Cdc7-Dbf4）共同啟動(dòng)）共同啟動(dòng)DNA的復(fù)制。的復(fù)制。 4） S期期CDKs的雙重功能的雙重功能：引發(fā)引發(fā)DNA復(fù)制的啟復(fù)制的啟動(dòng)；防止動(dòng)；防止pre- RC重復(fù)組裝。重復(fù)組裝。

26、M期期CDKs：防止防止pre-RC重復(fù)組裝重復(fù)組裝。 5）有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物）有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase-promoting complex, APC, cyclosome)： 調(diào)控姐妹染色體的分離和調(diào)控姐妹染色體的分離和M期期Cyclin的降解。的降解。 M期期CDKs的激活并積累使的激活并積累使APC處于活化處于活化 狀態(tài)，一直持續(xù)到狀態(tài)，一直持續(xù)到G1期；期；G1期期CDKs的激活的激活 并積累又抑制了并積累又抑制了M期期Cyclin和和APC底物的成熟底物的成熟前累積。前累積。 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞周期的界面機(jī)制細(xì)胞周期的界面機(jī)制 細(xì)胞周期與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周

27、期與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、DNA修修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等多種生命活動(dòng)密切復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等多種生命活動(dòng)密切相關(guān)。相關(guān)。 一、一、細(xì)胞周期與細(xì)胞周期與DNA修復(fù)修復(fù) 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)DNA損傷損傷/錯(cuò)誤的傳感器，受損細(xì)胞的錯(cuò)誤的傳感器，受損細(xì)胞的扣留，修復(fù)扣留，修復(fù)DNA，決定繼續(xù)分裂或死亡。，決定繼續(xù)分裂或死亡。 傳感器傳感器：人類：人類ATM，p53基因基因 ATM 編碼蛋白激酶，結(jié)合在損傷的編碼蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，能將某些蛋白磷酸化，中斷細(xì)胞周期。上，能將某些蛋白磷酸化，中斷細(xì)胞周期。 信號(hào)通路：信號(hào)通路：1）激活）激活Chk1，引起，引起Ser216磷酸磷酸化，抑制化，抑制C

28、DC25，抑制，抑制M-CDK，阻斷細(xì)胞周，阻斷細(xì)胞周期；期；2）激活）激活Chk2，使，使p53磷酸化，磷酸化，p21表達(dá)增表達(dá)增加，抑制加，抑制G1-S期期CDK，阻斷細(xì)胞周期。，阻斷細(xì)胞周期。 低等生物低等生物Rad24，Rad17，Mec3，DDC1，Rad9 Rad9，Rad24與單鏈與單鏈DNA結(jié)合，激活蛋白激酶結(jié)合，激活蛋白激酶Mec1，使，使Rad9、Rad53、Pds1等蛋白磷酸化，等蛋白磷酸化，導(dǎo)致導(dǎo)致G2/M期過度的阻滯；期過度的阻滯；Mec1激活激活Rad53，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)Sml1，導(dǎo)致，導(dǎo)致dNTP合成增加，以供合成增加，以供DNA修修復(fù)需要；復(fù)需要；Mec1、Rad53

29、及及Dun1的激活，使的激活，使Crt1磷酸化，解除轉(zhuǎn)錄抑制，開始磷酸化，解除轉(zhuǎn)錄抑制，開始DNA修復(fù)。修復(fù)。 DNA修復(fù)的兩大類形式修復(fù)的兩大類形式： 1）切除修復(fù)切除修復(fù)(excision repair)： 堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)BER：酶切錯(cuò)誤的堿基并替換：酶切錯(cuò)誤的堿基并替換 核苷酸切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)NER：單個(gè)核苷酸或一段寡：單個(gè)核苷酸或一段寡核苷酸切除、修復(fù)。核苷酸切除、修復(fù)。 全基因組切除修復(fù)全基因組切除修復(fù)：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/DNA直接作用直接作用識(shí)別、修復(fù)，可發(fā)生在基因的任何部位；識(shí)別、修復(fù)，可發(fā)生在基因的任何部位； 轉(zhuǎn)錄切除修復(fù)轉(zhuǎn)錄切除修復(fù)：在轉(zhuǎn)錄過程中完成切除、修復(fù)在轉(zhuǎn)

30、錄過程中完成切除、修復(fù) TFIIH，是一個(gè)多功能蛋白復(fù)合物，由，是一個(gè)多功能蛋白復(fù)合物，由XP-B、XP-D和和TTD-A基因的蛋白產(chǎn)物構(gòu)成，基因的蛋白產(chǎn)物構(gòu)成，與基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)密切相關(guān)。在與基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)密切相關(guān)。在CAK的作用下，的作用下，TFIIH被激活。被激活。 TFIIH將細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、將細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)修復(fù)聯(lián)系在一起。聯(lián)系在一起。 2）錯(cuò)配修復(fù)錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair)： MSH2基因產(chǎn)物識(shí)別基因產(chǎn)物識(shí)別; 與與DNA直接形成復(fù)合物直接形成復(fù)合物; 內(nèi)源性核酸酶和核酸多聚酶作用內(nèi)源性核酸酶和核酸多聚酶作用,去除重復(fù)去除重復(fù)錯(cuò)配的錯(cuò)配的DNA鏈鏈

31、二、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡二、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡 不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)生在細(xì)胞周不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)生在細(xì)胞周期的不同時(shí)相。期的不同時(shí)相。三、細(xì)胞周期與細(xì)胞分化三、細(xì)胞周期與細(xì)胞分化 角化細(xì)胞分化角化細(xì)胞分化: p21Cip1與細(xì)胞分化有關(guān)與細(xì)胞分化有關(guān); 角化細(xì)胞分化時(shí)，角化細(xì)胞分化時(shí)，p21Cip1水平下降；水平下降； 當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)，當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)，p21Cip1能抑制角化細(xì)胞分化，能抑制角化細(xì)胞分化，同時(shí)與同時(shí)與DNA多聚酶的主要成分多聚酶的主要成分PCNA結(jié)合，影結(jié)合，影響細(xì)胞周期中響細(xì)胞周期中DNA合成期的進(jìn)行。合成期的進(jìn)行。 Rb的研究中發(fā)現(xiàn)，的研究中發(fā)現(xiàn)，Rb磷酸化時(shí)，能釋

32、放所磷酸化時(shí)，能釋放所“扣留扣留”的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子E2F，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行；當(dāng)行；當(dāng)Rb處于去磷酸化狀態(tài)時(shí)，促使成肌細(xì)胞處于去磷酸化狀態(tài)時(shí)，促使成肌細(xì)胞/脂肪細(xì)胞分化脂肪細(xì)胞分化 第五節(jié)第五節(jié) 腫瘤細(xì)胞周期機(jī)制的破壞腫瘤細(xì)胞周期機(jī)制的破壞 甲狀旁腺腺瘤甲狀旁腺腺瘤 - Cyclin D1基因突變基因突變 肝細(xì)胞癌肝細(xì)胞癌 - 乙肝病毒嵌入乙肝病毒嵌入Cyclin A基因序列基因序列 乳腺癌乳腺癌 - Cyclin E 過度表達(dá)過度表達(dá) 從三個(gè)方向（細(xì)胞分子生物學(xué)、腫瘤生物從三個(gè)方向（細(xì)胞分子生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)）、三類基因（癌基因、抑癌學(xué)和臨床腫瘤學(xué)）、三類基

33、因（癌基因、抑癌基因和腫瘤易感基因）、三種細(xì)胞歸宿（細(xì)胞基因和腫瘤易感基因）、三種細(xì)胞歸宿（細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡）會(huì)聚到細(xì)胞周期分裂、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡）會(huì)聚到細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)集中在三調(diào)控機(jī)制，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)集中在三個(gè)層面：個(gè)層面： 監(jiān)控機(jī)制監(jiān)控機(jī)制 / 保真性（保真性（fidelity） 驅(qū)動(dòng)機(jī)制驅(qū)動(dòng)機(jī)制 / 決策性（決策性（decision） 相關(guān)生物學(xué)相關(guān)生物學(xué) / 延伸性（延伸性（expanding） 一、細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制的破壞一、細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制的破壞 腫瘤是一類多基因疾病：腫瘤是一類多基因疾?。?1）遺傳物質(zhì)）遺傳物質(zhì)DNA（或基因）的改變；

34、（或基因）的改變； 2）多步驟、多基因變化；）多步驟、多基因變化； 3）最終導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長。）最終導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長。 DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)損傷檢測(cè)點(diǎn) 1）G1-S過渡期過渡期：防止防止DNA受損細(xì)胞進(jìn)入受損細(xì)胞進(jìn)入S期，期， 2）G2-M過渡期過渡期：防止受損的防止受損的DNA和未完成復(fù)制和未完成復(fù)制的的DNA進(jìn)入有絲分裂。進(jìn)入有絲分裂。 DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)的主要機(jī)制損傷檢測(cè)點(diǎn)的主要機(jī)制 1）p53依賴性機(jī)制依賴性機(jī)制 2）p53非依賴性機(jī)制非依賴性機(jī)制 檢測(cè)點(diǎn)的四部分功能檢測(cè)點(diǎn)的四部分功能： 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)detect、制動(dòng)、制動(dòng)stop、工作、工作work、決定、決定decision 典型例

35、子典型例子- p53基因的突變基因的突變 DNA病毒（病毒（SV40、HPV、腺病毒等），、腺病毒等），首先導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定性，通過其產(chǎn)物，結(jié)合首先導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定性，通過其產(chǎn)物，結(jié)合并使并使p53蛋白滅活，減弱細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)功能；蛋白滅活，減弱細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)功能； 缺乏缺乏p53或或AT基因的細(xì)胞基因的細(xì)胞 ，經(jīng)放射線照射，經(jīng)放射線照射后，遺傳的不穩(wěn)定性明顯增加，即使該基因是后，遺傳的不穩(wěn)定性明顯增加，即使該基因是雜合性丟失，也將導(dǎo)致乳腺癌。雜合性丟失，也將導(dǎo)致乳腺癌。 二、細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制的破壞二、細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制的破壞 在正常細(xì)胞在正常細(xì)胞S期，期，Cyclin A蛋白與轉(zhuǎn)錄因子蛋白與轉(zhuǎn)

36、錄因子E2F結(jié)合。結(jié)合。 研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌的細(xì)胞中，乙肝病毒研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌的細(xì)胞中，乙肝病毒的的DNA片段整合到了片段整合到了Cyclin A 基因中；在腺病基因中；在腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，Cyclin A與腺病毒轉(zhuǎn)化蛋白與腺病毒轉(zhuǎn)化蛋白EIA結(jié)合在一起。結(jié)合在一起。 PRAD1與與bcl-1基因序列聯(lián)在一起，在基因序列聯(lián)在一起，在B淋淋巴細(xì)胞白血病時(shí)，巴細(xì)胞白血病時(shí)，bcl-1移位到免疫球蛋白基移位到免疫球蛋白基因增強(qiáng)子而被激活；因增強(qiáng)子而被激活； 在甲狀旁腺腫瘤細(xì)胞中，染色體重排，使在甲狀旁腺腫瘤細(xì)胞中，染色體重排，使PRAD1與甲狀旁腺激素基因的增強(qiáng)子并置，與甲狀旁腺

37、激素基因的增強(qiáng)子并置，導(dǎo)致導(dǎo)致PRAD1大量表達(dá)。大量表達(dá)。 正常情況下，正常情況下，PRAD1產(chǎn)物能激活產(chǎn)物能激活Cdc2/Cdc2類蛋白激酶（類蛋白激酶（Cyclin D1）。）。直接的直接的CKIs、Rb和和p53的破壞更常見。的破壞更常見。 DNA損傷所致的經(jīng)典途徑損傷所致的經(jīng)典途徑 p53-p21-CDKs-Cyclins DNA損傷損傷p53表達(dá)增加表達(dá)增加 p21Cip1轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄增加增加細(xì)胞周期運(yùn)行受阻細(xì)胞周期運(yùn)行受阻 p53突變時(shí)，喪失了促進(jìn)突變時(shí)，喪失了促進(jìn)p21Cip1轉(zhuǎn)錄的功轉(zhuǎn)錄的功能，導(dǎo)致含有受損能，導(dǎo)致含有受損DNA的細(xì)胞，仍然處于細(xì)胞的細(xì)胞，仍然處于細(xì)胞周期運(yùn)行中復(fù)

38、制。周期運(yùn)行中復(fù)制。 p21Cip1的雙重制動(dòng)作用：的雙重制動(dòng)作用： 1）抑制）抑制CDKs的活性；的活性； 2）直接結(jié)合，抑制增殖細(xì)胞核抗原。）直接結(jié)合，抑制增殖細(xì)胞核抗原。 “多腫瘤抑制基因多腫瘤抑制基因”MTS1（multipletumor suppressor）：）： 編碼蛋白產(chǎn)物為編碼蛋白產(chǎn)物為p16，一種蛋白激酶抑制物，一種蛋白激酶抑制物，1）特異性抑制）特異性抑制Cdk4-Cyclin D蛋白激酶的活性；蛋白激酶的活性；2）不能對(duì)其底物）不能對(duì)其底物Rb進(jìn)行磷酸化，阻止了進(jìn)行磷酸化，阻止了G1-S 的過渡；的過渡； 3）使）使Cyclin D不能連接生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)不能連接生

39、長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì) 胞周期調(diào)控機(jī)制，阻礙胞周期調(diào)控機(jī)制，阻礙 細(xì)胞的生長、復(fù)細(xì)胞的生長、復(fù) 制與分裂。制與分裂。 第六節(jié)第六節(jié) 問題與展望問題與展望 細(xì)胞周期細(xì)胞周期核心機(jī)制核心機(jī)制的精確解剖的精確解剖 細(xì)胞周期細(xì)胞周期界面聯(lián)系界面聯(lián)系的精確解剖的精確解剖 第一節(jié)第一節(jié) 歷史回顧歷史回顧 第二節(jié)細(xì)胞周期機(jī)制的核心第二節(jié)細(xì)胞周期機(jī)制的核心CDKs調(diào)控機(jī)制調(diào)控機(jī)制 Cyclins是調(diào)控是調(diào)控CDK活性的最基本成分活性的最基本成分 Thr160/161磷酸化磷酸化 Thr14/Tyr15磷酸化和去磷酸化磷酸化和去磷酸化 細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞周期

40、調(diào)控的兩大機(jī)制細(xì)胞周期調(diào)控的兩大機(jī)制 細(xì)胞周期的啟動(dòng)機(jī)制細(xì)胞周期的啟動(dòng)機(jī)制 細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞周期的界面機(jī)制細(xì)胞周期的界面機(jī)制 細(xì)胞周期與細(xì)胞周期與DNA修復(fù)修復(fù) 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期與細(xì)胞分化細(xì)胞周期與細(xì)胞分化 第五節(jié)第五節(jié) 腫瘤細(xì)胞周期機(jī)制的破壞腫瘤細(xì)胞周期機(jī)制的破壞 細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制的破壞細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制的破壞 細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制的破壞細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制的破壞 第六節(jié)第六節(jié) 問題與展望問題與展望 第九章第九章 細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞凋亡與腫瘤 1858年年 細(xì)胞細(xì)胞退化、壞疽、軟化、壞死；退化、壞疽、軟化、壞死； 1885年年 “染

41、色體裂解染色體裂解”； 1914年年 提出了提出了平衡機(jī)制平衡機(jī)制，認(rèn)為是生理性認(rèn)為是生理性 清除細(xì)胞；清除細(xì)胞； 1951年年 提出提出“程序化細(xì)胞死亡程序化細(xì)胞死亡”； 20年后年后 提出提出“固縮性壞死固縮性壞死” 1972年年 正式以正式以“細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡”（apoptosis）命）命名名 1976-1981年年 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)“梯樣梯樣”DNA電泳圖譜；電泳圖譜； 1984年年 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性核酸酶內(nèi)源性核酸酶的激活；的激活； 直到直到20世紀(jì)世紀(jì)80年代末期，才真正開始認(rèn)識(shí)到細(xì)年代末期，才真正開始認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義。胞凋亡的生物學(xué)意義。 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)及其意義細(xì)胞

42、凋亡的特點(diǎn)及其意義 一、細(xì)胞凋亡的基本特點(diǎn)及其評(píng)價(jià)方法一、細(xì)胞凋亡的基本特點(diǎn)及其評(píng)價(jià)方法 （一）凋亡細(xì)胞的（一）凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)特征特征 胞漿空泡，膜發(fā)泡，空泡排出，細(xì)胞固縮，胞漿空泡，膜發(fā)泡，空泡排出，細(xì)胞固縮，細(xì)胞體積縮??；細(xì)胞膜和核膜保持完整細(xì)胞體積縮??；細(xì)胞膜和核膜保持完整；線粒；線粒體超濃縮、染色質(zhì)進(jìn)行性固縮，體超濃縮、染色質(zhì)進(jìn)行性固縮，核凝聚核凝聚；核周核周出現(xiàn)塊狀結(jié)構(gòu)、出現(xiàn)塊狀結(jié)構(gòu)、“致密球體致密球體”或葡萄串樣小球或葡萄串樣小球體或半月形，體或半月形，凋亡小體凋亡小體存在。存在。 （二）（二）非隨機(jī)性非隨機(jī)性DNA降解降解 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)DNA梯狀圖

43、譜梯狀圖譜（DNA ladder），是細(xì)胞凋亡的重要生物化學(xué)標(biāo)志。），是細(xì)胞凋亡的重要生物化學(xué)標(biāo)志。 原位末端標(biāo)記原位末端標(biāo)記（in site end labeling，ISEL）技術(shù)技術(shù)：根據(jù)根據(jù)DNA聚合酶能夠填補(bǔ)雙鏈聚合酶能夠填補(bǔ)雙鏈DNA中中單鏈的缺失部分，應(yīng)用標(biāo)記的三磷酸核苷酸形單鏈的缺失部分，應(yīng)用標(biāo)記的三磷酸核苷酸形成新的成新的DNA。）DNA缺口平移法：缺口平移法：）原位末端標(biāo)記法：）原位末端標(biāo)記法：）末端）末端DNA轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法。缺口末端標(biāo)記法。（三）（三）細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻膽堿類磷脂（磷脂酰膽堿、鞘磷脂）膽堿類磷脂（磷脂酰膽堿、

44、鞘磷脂）氨基類磷脂（磷脂酰絲氨酸氨基類磷脂（磷脂酰絲氨酸PS、磷脂酰乙醇胺）、磷脂酰乙醇胺） PS外翻現(xiàn)象是早期凋亡細(xì)胞重要特征之一。外翻現(xiàn)象是早期凋亡細(xì)胞重要特征之一。 由于由于Ca+ 依賴的磷脂結(jié)合蛋白依賴的磷脂結(jié)合蛋白annexin V 能與能與PS高親和結(jié)合，同時(shí)結(jié)合膜非通透性高親和結(jié)合，同時(shí)結(jié)合膜非通透性DNA染料（染料（PI）則能從染色細(xì)胞中將凋亡和壞）則能從染色細(xì)胞中將凋亡和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。死細(xì)胞區(qū)分開來。 （四）（四）保持充足的能量代謝直至細(xì)胞凋亡末期保持充足的能量代謝直至細(xì)胞凋亡末期 在在ATP存在下，鈣親合劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；反存在下，鈣親合劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；反之，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生

45、壞死。之，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死。 在預(yù)先耗竭在預(yù)先耗竭ATP的情況下，凋亡誘導(dǎo)劑和的情況下，凋亡誘導(dǎo)劑和Fas配體誘導(dǎo)的配體誘導(dǎo)的T細(xì)胞死亡形式由凋亡轉(zhuǎn)向死亡。細(xì)胞死亡形式由凋亡轉(zhuǎn)向死亡。（五）（五）細(xì)胞凋亡的結(jié)局細(xì)胞凋亡的結(jié)局 凋亡小體凋亡小體（apoptotic body） 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別區(qū)別： 1）形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)：細(xì)胞體積細(xì)胞體積 細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核 溶酶體、線粒體溶酶體、線粒體 2）生物化學(xué)生物化學(xué)：DNA、蛋白質(zhì)（、蛋白質(zhì)（Caspases） 底物、抗死亡分子底物、抗死亡分子 對(duì)對(duì)ATP的需求的需求 3) 組織分布、組織反應(yīng)組織分布、

46、組織反應(yīng) 特特 點(diǎn)點(diǎn) 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死細(xì)胞膜細(xì)胞膜通透性正常通透性正常完整性破壞完整性破壞染色質(zhì)染色質(zhì)凝聚，半月狀凝聚，半月狀絮狀絮狀細(xì)胞器細(xì)胞器完整完整損傷損傷細(xì)胞核細(xì)胞核固縮，降解固縮，降解溶解溶解溶酶體溶酶體完整完整裂解裂解線粒體線粒體濃縮，濃縮，cytocyto C C釋放釋放腫脹、破壞腫脹、破壞DNADNA核小體間剪切核小體間剪切非特征性剪切非特征性剪切蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)CaspasesCaspases活化活化非特異性降解非特異性降解ATPATP必需必需無需無需分布分布單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞群體細(xì)胞群體凋亡小體凋亡小體有有，被吞噬，被吞噬無，細(xì)胞自溶無，細(xì)胞自溶炎癥反應(yīng)炎癥

47、反應(yīng)無無，補(bǔ)釋放內(nèi)容物，補(bǔ)釋放內(nèi)容物有，釋放內(nèi)容物有，釋放內(nèi)容物 形態(tài)學(xué)改變的檢測(cè)方法形態(tài)學(xué)改變的檢測(cè)方法 1. 普通光學(xué)顯微鏡；普通光學(xué)顯微鏡； 2. 熒光顯微鏡；熒光顯微鏡； 3. 電鏡；電鏡； 4. 凋亡指數(shù)和細(xì)胞活力定量測(cè)定凋亡指數(shù)和細(xì)胞活力定量測(cè)定 生物化學(xué)方法生物化學(xué)方法 （瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳） 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法（ELISA法法） 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（熒光酶標(biāo)記熒光酶標(biāo)記） 靶細(xì)胞靶細(xì)胞DNA片段定量分析及細(xì)胞溶解試驗(yàn)片段定量分析及細(xì)胞溶解試驗(yàn) 流式細(xì)胞分析技術(shù)流式細(xì)胞分析技術(shù) 二、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用二、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞凋亡研究

48、中的應(yīng)用 流式細(xì)胞儀是流式細(xì)胞儀是分析細(xì)胞學(xué)分析細(xì)胞學(xué)研究的重要工具。研究的重要工具。 三、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義概述三、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義概述 細(xì)胞凋亡具有極其廣泛的生物學(xué)意義，涉細(xì)胞凋亡具有極其廣泛的生物學(xué)意義，涉及及胚胎發(fā)育胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞穩(wěn)定及及免疫防御免疫防御機(jī)制機(jī)制等諸多方面等諸多方面。 細(xì)胞凋亡的異常，可引起多種疾?。ㄗ陨砑?xì)胞凋亡的異常，可引起多種疾病（自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤等發(fā)免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤等發(fā)生）。生）。 研究細(xì)胞凋亡具有重要的生物學(xué)意義：研究細(xì)胞凋亡具有重要的生物學(xué)意義： 細(xì)胞凋亡在細(xì)胞凋亡在維持組織及器官的正

49、常形態(tài)和維持組織及器官的正常形態(tài)和功能功能方面起著重要作用；方面起著重要作用； 細(xì)胞凋亡在細(xì)胞凋亡在腫瘤形成和治療腫瘤形成和治療中具有重要作中具有重要作用；用； 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡與免疫學(xué)關(guān)系與免疫學(xué)關(guān)系十分密切。十分密切。 第二節(jié)第二節(jié) Caspases和死亡受體相關(guān)的和死亡受體相關(guān)的 細(xì)胞凋亡途徑細(xì)胞凋亡途徑 細(xì)胞凋亡的過程分為三個(gè)時(shí)期細(xì)胞凋亡的過程分為三個(gè)時(shí)期： 誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期 效應(yīng)期效應(yīng)期 降解期降解期 在研究模型中，發(fā)現(xiàn)三個(gè)重要基因在研究模型中，發(fā)現(xiàn)三個(gè)重要基因： 促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因：細(xì)胞凋亡基因：ced-3 、ced-4 抑制抑制細(xì)胞凋亡基因：細(xì)胞凋亡基因：ced-9 CED-3：半

50、胱氨酸蛋白酶，激活的：半胱氨酸蛋白酶，激活的CED-3 特異特異 性降解蛋白底物；性降解蛋白底物； CED-4：與：與CED-3結(jié)合并促進(jìn)結(jié)合并促進(jìn)CED-3激活，激活， CED-9：與：與CED-4結(jié)合并阻止它激活結(jié)合并阻止它激活CED-3 誘導(dǎo)、調(diào)控凋亡的基本機(jī)制：誘導(dǎo)、調(diào)控凋亡的基本機(jī)制： 在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)作用下，在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)作用下，Ced-9自三體復(fù)自三體復(fù)合物合物（ Ced-3- Ced-4- Ced-9 ）中解離，導(dǎo)致中解離，導(dǎo)致Ced-4 激活激活Ced-3，活化的，活化的Ced-3特異地降解蛋特異地降解蛋白底物，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。白底物，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。 哺乳動(dòng)物體內(nèi)，哺乳動(dòng)

51、物體內(nèi)，caspases與與ced-3同源同源；Apaf-1基因與基因與ced-4同源同源；Bcl-2基因家族與基因家族與 ced-9在結(jié)構(gòu)和功能上相似在結(jié)構(gòu)和功能上相似( (分為促進(jìn)和抑制亞分為促進(jìn)和抑制亞群群) ) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的主要途徑：哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的主要途徑： 死亡受體途徑、線粒體途徑。死亡受體途徑、線粒體途徑。 凋亡后期的共同途徑：凋亡后期的共同途徑： Caspases激活激活 一、一、Caspases的結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn) 1993年，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素年，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶 ICE（interleukin-1B-converting enzyme）與）與

52、Ced-3基因存在功能和序列相似性?；虼嬖诠δ芎托蛄邢嗨菩?。 1996年，統(tǒng)一命名為年，統(tǒng)一命名為天冬氨酸特異性半胱天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶氨酸蛋白酶(caspase) 。 ICE分為分為2 2個(gè)亞族個(gè)亞族 ICE亞族亞族：參與炎癥反應(yīng)：參與炎癥反應(yīng) CED-3家族家族：參與細(xì)胞凋亡：參與細(xì)胞凋亡 啟動(dòng)者：啟動(dòng)者：caspase-8caspase-8、9 9 ，能通過自剪接而，能通過自剪接而激活，然后引起激活，然后引起caspasecaspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)；級(jí)聯(lián)反應(yīng)； 執(zhí)行者：執(zhí)行者：caspase-3caspase-3、6 6、7 7，可直接降解胞，可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引

53、起凋亡，但不能內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化或自剪接的方式激活通過自催化或自剪接的方式激活 CaspaseCaspase分子是一類在進(jìn)化上非常保守的分子是一類在進(jìn)化上非常保守的蛋白酶類分子。蛋白酶類分子。 CaspaseCaspase的特性表現(xiàn)在兩個(gè)方面（）為的特性表現(xiàn)在兩個(gè)方面（）為半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶類；（）類；（）切割天冬氨酸的羧切割天冬氨酸的羧基基與下一個(gè)氨基酸的氨基形成的肽鍵。與下一個(gè)氨基酸的氨基形成的肽鍵。 Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，能特異地剪屬于半胱氨酸蛋白酶，能特異地剪切割天冬氨酸殘基后的肽鍵。切割天冬氨酸殘基后的肽鍵。 Caspases家族

54、成員具有家族成員具有相似相似的氨基酸序列、的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性。結(jié)構(gòu)和底物特異性。 Caspase前體前體：原結(jié)構(gòu)域、大亞基和小亞基。原結(jié)構(gòu)域、大亞基和小亞基。 Caspase前體的活化，涉及結(jié)構(gòu)域間的蛋前體的活化，涉及結(jié)構(gòu)域間的蛋白水解和大小亞基整合形成異二聚體。白水解和大小亞基整合形成異二聚體。 基于基于Caspases的嚴(yán)格底物特異性和高度有的嚴(yán)格底物特異性和高度有效性，從而確保了細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生專一性效性，從而確保了細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生專一性的蛋白消化。的蛋白消化。二、死亡受體和二、死亡受體和Caspases的活化的活化 死亡受體（死亡受體（death receptor, D

55、R）： 傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)的細(xì)胞膜蛋白傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)的細(xì)胞膜蛋白. 腫瘤壞死因子受體腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族超家族. 分為兩大類：分為兩大類： 上游始動(dòng)上游始動(dòng)Caspases （Caspase -2, -8, -9, -10） 下游效應(yīng)下游效應(yīng)Caspases （ Caspase -3, -6,-7） Caspases活化的活化的“級(jí)聯(lián)級(jí)聯(lián)”模型：模型： 凋亡誘導(dǎo)信號(hào)凋亡誘導(dǎo)信號(hào) 始動(dòng)始動(dòng)Caspases活化活化 活化下游活化下游Caspases 參與重要底物的剪切參與重要底物的剪切 死亡受體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：死亡受體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1）具有相似的、富集半胱氨酸）具有相似的、富集半胱氨酸胞外結(jié)

56、構(gòu)域胞外結(jié)構(gòu)域； 2）胞漿區(qū)具有同源性）胞漿區(qū)具有同源性死亡結(jié)構(gòu)域死亡結(jié)構(gòu)域（death domain, DD）TNFR 分為兩種亞型分為兩種亞型： 1）TNFR-I 型型，具有具有DD，介導(dǎo)刺激和凋亡，介導(dǎo)刺激和凋亡 2）TNFR-II型型 ，缺乏缺乏DD，介導(dǎo)刺激效應(yīng)，介導(dǎo)刺激效應(yīng),也也 能介導(dǎo)凋亡效應(yīng)。能介導(dǎo)凋亡效應(yīng)。 TNF誘導(dǎo)凋亡主要機(jī)制：誘導(dǎo)凋亡主要機(jī)制： TNF-TNFR-I，TNFR-I形成同三聚體，形成同三聚體， DD/TNFR-I 與與DD/TRADD（TNF receptor-associated death domain）交聯(lián)）交聯(lián); DED/TRADD 與與 DED/

57、上游上游Caspase結(jié)合；結(jié)合； Caspase-8寡聚體寡聚體下游下游Caspase細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 Fas介導(dǎo)的凋亡途徑介導(dǎo)的凋亡途徑 Fas-FasL，F(xiàn)as分子分子 形成同三聚體；形成同三聚體； DD/Fas與與DD/適應(yīng)蛋白結(jié)合；適應(yīng)蛋白結(jié)合； DED/適應(yīng)蛋白與適應(yīng)蛋白與DED/上游上游Caspase結(jié)合；結(jié)合； caspase-8寡聚體寡聚體下游下游caspases細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡。 死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）： 死亡受體死亡受體 適應(yīng)蛋白適應(yīng)蛋白 caspase-8 三、三、 Caspases 的作用底物的作用底物 ICE亞家族亞家族： caspas

58、e-1，-4，-5； 主要輔助促炎主要輔助促炎 癥反應(yīng)；癥反應(yīng)； Ced-3亞家族亞家族： caspase-2，-3，-6 -10； 主要參與細(xì)胞凋亡過程。主要參與細(xì)胞凋亡過程。參與凋亡的機(jī)制：參與凋亡的機(jī)制： 1.滅活細(xì)胞凋亡抑制蛋白滅活細(xì)胞凋亡抑制蛋白 細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞凋亡時(shí)， caspase對(duì)對(duì)ICAD進(jìn)行剪切，進(jìn)行剪切，使之失活，使之失活，CAD游離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)降解游離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)降解DNA。 ICADDFF45 2. 以結(jié)構(gòu)蛋白為靶子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體以結(jié)構(gòu)蛋白為靶子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體 細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞凋亡時(shí)， caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白，導(dǎo)致核板塌

59、陷及染色質(zhì)濃縮。層蛋白，導(dǎo)致核板塌陷及染色質(zhì)濃縮。3. 以效應(yīng)蛋白為靶子，導(dǎo)致其調(diào)節(jié)和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域以效應(yīng)蛋白為靶子，導(dǎo)致其調(diào)節(jié)和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域解體解體 Caspase作用于作用于DNA修復(fù)、修復(fù)、mRNA拼接及拼接及DNA復(fù)制相關(guān)蛋白；還可剪切某些激酶并使之復(fù)制相關(guān)蛋白；還可剪切某些激酶并使之激活，參與細(xì)胞凋亡中的膜重建和發(fā)泡等。激活，參與細(xì)胞凋亡中的膜重建和發(fā)泡等。 第三節(jié)第三節(jié) 線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑 細(xì)胞游離系統(tǒng)細(xì)胞游離系統(tǒng) cell-free system 線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用：線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用： DNA的裂解的裂解依賴線粒體依賴線粒體的存在；的

60、存在； ATP存在時(shí)，存在時(shí)，caspases的活化依賴細(xì)胞色的活化依賴細(xì)胞色素素C自線粒體釋放自線粒體釋放; 線粒體膜線粒體膜上存在許多上存在許多調(diào)控凋亡分子調(diào)控凋亡分子. 一、細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的變化一、細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的變化 生理狀況下，生理狀況下，線粒體跨膜電位線粒體跨膜電位表現(xiàn)為內(nèi)負(fù)表現(xiàn)為內(nèi)負(fù)外正的電化學(xué)梯度。外正的電化學(xué)梯度。 膜外室含有膜外室含有cytoC、caspases前體、乙?；绑w、乙酰化激酶激酶2和凋亡誘導(dǎo)因子（和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等。）等。 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔MMP： 定位于線粒體內(nèi)外膜之間的一定位于線粒體內(nèi)外膜之間的一