抗生素效價測定

1、項目2青霉素效價測定一、知識連接（一）抗生素效價表示方法 效價是評價抗生素效能的標準，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度。效價一般指的是生物活性的大小或者高低，生物活性的大小和高低是和效價成正比的。實際應用中，合理使用抗生素的劑量十分重要?？股貞脮r劑量小，因此除重量外，常用特定的效價單位（unit）表示，效價單位也稱抗菌活性單位。最初，由于抗生素無法制得純品，用其生物活性的大小來表示其劑量。 一個青霉素的效價單位（U）：能在50mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標準菌株的發(fā)育的最小青霉素劑量。 一個鏈霉素效價單位（U）：能在1mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑制大腸桿菌（ATCC9637）發(fā)育的最小

2、劑量。 重量單位（g）：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作為抗生素的基準單位（大多數(shù)使用）。（二）抗生素效價測定抗生素微生物檢定法可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴散法（管碟法和打孔法）。各國藥典通常采用后兩種方法測定抗生素的效價。管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴散滲透作用，在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管內(nèi)放入標準品和檢品的溶液，經(jīng)1618小時恒溫培養(yǎng)，當抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當抗生素濃度達到

3、或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的無菌生長的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。抑菌圈的大小代表藥劑抗菌力的高低。在一定的藥劑濃度范圍內(nèi)，藥劑的濃度越高則抑菌圈的直徑越大。目前最常用的是游標卡尺和直尺直接測量抑菌圈直徑。根據(jù)擴散定律的推導，抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系，即通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，比較標準品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價。管碟法的基本操作和設計適用于各種抗生素，試驗結(jié)果較穩(wěn)定；樣品用量少，靈敏度高；適合于大批樣品的測定。然而凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會干擾測定結(jié)果；試驗過程長，得出結(jié)果慢；操作手工化，需熟練人員才

4、能得到較正確的結(jié)果；受擴散因素的影響，如培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量，一般瓊脂中的雜質(zhì)可能影響擴散速度及效價強度。盡管如此，由于它有上述的獨特優(yōu)點而被世界各國所公認，成為國際通用的方法被列入各國藥典法規(guī)內(nèi)。二、制訂方案根據(jù)情境導入中的問題，制訂抗生素生物效價的測定方案表，如表5-2-1所示。表5-2-1 抗生素生物效價的測定方案 抗生素效價的測定方案任務信息描述任務描述獨立完成發(fā)酵終點抗生素生物效價的測定設備/工具/耗材發(fā)酵罐及附屬裝置、三角瓶、雙碟（或內(nèi)徑9cm的培養(yǎng)皿）、鋼管（內(nèi)徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm）、鋼管放置器、毛細滴管

5、、滅菌刻度吸管、容量瓶、稱量瓶、天平、直尺或游標卡尺、超凈工作臺等操作步驟1.預試驗：確定最佳的試驗條件，調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定2.試驗準備：雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、刻度吸管的清洗滅菌；培養(yǎng)基、緩沖液的準備、無菌室的紫外消毒等3.金黃色葡萄球菌菌懸液的制備：將37培養(yǎng)1618h的斜面菌種,用0.85%的生理鹽水洗下,離心沉淀(3000rpm×5min),傾去上清液,沉淀菌體再用生理鹽水離心洗滌12次。再將其稀釋至一定濃度(約109個/ml，或用分光光度計在波長650nm測透光率為20%左右即可)4.雙碟的制備：

6、在超凈工作臺上，取已經(jīng)融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml注入雙碟底層，作為培養(yǎng)基的底層，待培養(yǎng)基凝固后換干燥的陶瓷蓋，放置2030min，備用。取出試驗用菌懸液，按預實驗的菌量（高濃度所致的抑菌圈直徑1822mm），用滅菌的吸管吸取菌懸液加入已經(jīng)融化并保溫在水浴中（一般細菌4850，芽孢可至60）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。取菌層培養(yǎng)基5ml，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺上待凝固，用陶瓷蓋覆蓋，放置2030min，備用5.供試品、標準品溶液的制備：從冰箱取出的標準品溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達到室溫后，稱量前，供試品應放于干燥器內(nèi)至少30 min方可稱取。供試品與標準品應用同一天平；吸

7、濕性較強的抗生素在稱量前12小時更換天平內(nèi)干燥劑。標準品稱量不可少于20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水。稱樣量的計算：W=V*C/P式中：W：需稱取標準品或供試品的重量（mg）V：溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（mL）C：標準品或供試品高劑量的濃度（U/mL，g/mL）P：標準品的純度或供試品的估計效價（U/mg，g/mg）標準品或供試品溶液的稀釋應采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不少于2ml，稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶

8、液。稀釋標準品和供試品用的緩沖液應同一批和同瓶（預計不夠時，應事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預定結(jié)果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準確補加至刻度。標準品與供試品高低濃度之比為2：1或4：1，但所選用的濃度必須在劑量反應直線范圍內(nèi)6.放置鋼管：用鋼管放置器，或其他方法將鋼管一致平穩(wěn)地放入培養(yǎng)基上，鋼管放妥后，應使雙碟靜置510min,使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液7.滴加抗生素溶液：每批供試品取510個雙碟，滴加溶液用毛細滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗23次。在雙碟的4個鋼管中以對角線滴加標準品與供試品溶液

9、的高、低二種濃度的溶液，滴加順序為SH-TH-SL-TL，也可用SL-TL-TH-SH。（S代表標準品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度），滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴撒時間不同影響測定結(jié)果。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3個，避免受熱不均，影響抑菌圈大小8.雙碟的培養(yǎng)：將制好的雙碟以水平位置平穩(wěn)移入3537恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至所需時間。培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜9.抑菌圈的測量：用直尺或游標卡尺測量抑菌圈的直徑，以毫米為單位，誤差不超過0.1mm10.結(jié)果與計算：根據(jù)實驗測量的抑菌圈大小，計算抗生素供試品的效

10、價單位。（1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL）V=（UH+UL）-（SH+SL）式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑； UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑； SH：標準品高劑量之抑菌圈直徑； SL：標準品低劑量之抑菌圈直徑；（2）求出： =D·log（IV/W）式中：供試品和標準品的效價比； D：標準品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1； I：高低劑量之比的對數(shù)，即log2或log4。（3）求出Pr ：Pr = Ar×式中：Pr：供試品實際單位數(shù)；Ar：供試品標示量或估計單位 教師對學生進行分組，每組選出一個小組長，小組長根據(jù)小組成員任務分工不同，確定不同任務的

11、責任人。小組成員任務的劃分可以參考下面的小組任務分配表，如表5-2-2所示。表5-2-2 小組任務分配表小組任務個人職責（任務）小組成員1預試驗確定最佳的試驗條件，調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，做好記錄2試驗準備實驗室及實驗工具的消毒滅菌3金黃色葡萄球菌菌懸液的制備注意菌體濃度4雙碟的制備每只雙碟加好培養(yǎng)基并凝固好備用5供試品、標準品溶液的制備設計供試品、標準品的稱量、溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標準品相關(guān)劑量的溶液6放置鋼管使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，在開始滴加抗生素溶液7滴加抗生素溶液保證滴加速度和加量的均勻一致8雙碟的培養(yǎng)注意培養(yǎng)溫度、時間9抑菌圈的測量確保測量結(jié)果準確真實10結(jié)果與計算結(jié)果計算正確三、實施依據(jù)制訂方案實施，并填寫實驗記錄表，如表5-2-3所示。表5-2-3 實訓結(jié)果項目表小組任務完成情況完成人員檢查人員及情況說明1 預試驗2試驗準備、3金黃色葡萄球菌菌懸液的制備4雙碟的制備5供試品、標準品溶液的制備6菌層的制備7滴加抗生素溶液8雙碟的培養(yǎng)9抑菌圈的測量10結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定四、作業(yè)1通過實訓后完善本次任務的實訓方案2抗生素