免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

1、第三章第三章 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù) 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù) 酶酶-辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶 酶標(biāo)記已知酶標(biāo)記已知Ab(Ab(或或Ag) + Ag) + 組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的Ag(Ag(或或Ab)Ab) 抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物( (酶標(biāo)酶標(biāo)) ) 底物底物 有色沉淀有色沉淀 定位；定位； 圖像分析儀半定量圖像分析儀半定量免疫組化方法免疫組化方法v酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué) 直接法直接法 間接法間接法v非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué) 酶橋法酶橋法 PAPPAP法、法、APAAPAPAAP法法 一

2、、酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法一、酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法（一）原理（一）原理 直接法和間接法。直接法和間接法。 直接法直接法- 是將酶標(biāo)記在第一抗體上是將酶標(biāo)記在第一抗體上, ,直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特異性抗原。直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特異性抗原。 間接法間接法-兩步法兩步法 一抗：是細(xì)胞組織內(nèi)抗原的特異性抗體；一抗：是細(xì)胞組織內(nèi)抗原的特異性抗體； 二抗：是抗一抗的抗體二抗：是抗一抗的抗體, ,并且已用酶標(biāo)記。并且已用酶標(biāo)記。 ( (注意注意: :第二抗體與第一抗體須是不同種屬動(dòng)物制備的第二抗體與第一抗體須是不同種屬動(dòng)物制備的, ,因因?yàn)榈诙贵w往往是用第一種動(dòng)物的為第二抗體往往是用第一種動(dòng)物的IgGIgG所

3、制備。所制備。) )原理：原理：將酶直接標(biāo)記在一抗上，將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成形成復(fù)合物，最后復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。用底物顯色劑顯色。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低。非特異性背景反應(yīng)低。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：浪費(fèi)抗體、敏感性極低。浪費(fèi)抗體、敏感性極低。依靠化學(xué)連接（共價(jià)鍵）對(duì)酶及依靠化學(xué)連接（共價(jià)鍵）對(duì)酶及抗體活性有影響?？贵w活性有影響。每種抗原必須分別用其抗體的酶每種抗原必須分別用其抗體的酶標(biāo)記物。標(biāo)記物。酶標(biāo)抗體法酶標(biāo)抗體法- -直接法直接法酶標(biāo)抗體法酶標(biāo)抗體法- -間接法間接法原理

4、：原理：將酶標(biāo)記在二抗上，先將將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗原抗體復(fù)合物，再用二抗( (酶標(biāo)抗酶標(biāo)抗體體) )與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成形成復(fù)合物，復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。最后用底物顯色劑顯色。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：只需一種酶標(biāo)抗體即可只需一種酶標(biāo)抗體即可 。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，但優(yōu)于直接法。敏感性低，但優(yōu)于直接法。依靠化學(xué)連接對(duì)酶及抗體活性有依靠化學(xué)連接對(duì)酶及抗體活性有影響。影響。v 免疫酶組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記免疫酶組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，再依據(jù)

5、酶與底物作用生成不溶的抗原抗體復(fù)合物，再依據(jù)酶與底物作用生成不溶性的有色產(chǎn)物沉積在抗原抗體反應(yīng)原位，并借此確性的有色產(chǎn)物沉積在抗原抗體反應(yīng)原位，并借此確定該抗原的性質(zhì)、存在的部位和含量。定該抗原的性質(zhì)、存在的部位和含量。v 酶酶 + + 底物底物=不溶性的色素不溶性的色素標(biāo)記酶標(biāo)記酶: : 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)(HRP) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(ALP)(ALP) 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(GOD)(GOD) -D- -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶v 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) : 1 1 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶 HRPHRP：顯色：顯色：產(chǎn)物棕褐色產(chǎn)物棕褐色 HRPHRP與與底物過(guò)

6、氧化氫和底物過(guò)氧化氫和DABDAB作用產(chǎn)物棕褐色，有嗜鋨性。作用產(chǎn)物棕褐色，有嗜鋨性。DABDAB性質(zhì)：性質(zhì)： 電子供體，較敏感，室溫時(shí)較穩(wěn)定，顯色后切片可長(zhǎng)期電子供體，較敏感，室溫時(shí)較穩(wěn)定，顯色后切片可長(zhǎng)期保存?？芍掳?，可將保存。可致癌，可將DABDAB制成制成1010倍濃度儲(chǔ)存液，分裝后倍濃度儲(chǔ)存液，分裝后-20-20貯存。貯存。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：孵育時(shí)間和配置方式易產(chǎn)生背景著色孵育時(shí)間和配置方式易產(chǎn)生背景著色濃縮的濃縮的DABDAB按照說(shuō)明書；注意校正蒸餾水的按照說(shuō)明書；注意校正蒸餾水的PHPH值；值；粉劑粉劑DAB-DAB-溶解時(shí)濾去不溶性顆粒；溶解時(shí)濾去不溶性顆粒；現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配

7、-保存時(shí)可產(chǎn)生氧化物沉積在切片上，形成斑點(diǎn)。保存時(shí)可產(chǎn)生氧化物沉積在切片上，形成斑點(diǎn)。 臨用前加臨用前加H H2 2O O2 21 1 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶 HRPHRP：v2 2 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 ALPALP：v顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX為底物，被為底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚AS-MXAS-MX，再與孵育液內(nèi)的堅(jiān)牢藍(lán)，再與孵育液內(nèi)的堅(jiān)牢藍(lán)B B鹽或堅(jiān)牢紅鹽或堅(jiān)牢紅TRTR鹽等鹽等偶聯(lián)生成不溶性染料偶聯(lián)生成不溶性染料( (堅(jiān)牢藍(lán)或堅(jiān)牢紅堅(jiān)牢藍(lán)或堅(jiān)牢紅) )而成。而成。v優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性

8、磷酸酶很容易被優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被抑制和破壞，而不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高抑制和破壞，而不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高特異性。特異性。v缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明確。確。v2 2 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 ALPALP：v顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX為底物，被為底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚AS-MXAS-MX，再與孵育液內(nèi)的堅(jiān)牢藍(lán)，再與孵育液內(nèi)的堅(jiān)牢藍(lán)B B鹽或堅(jiān)牢紅鹽或堅(jiān)牢紅TRTR鹽等鹽等偶聯(lián)生成不溶性染料偶聯(lián)生成不溶性染料(

9、(堅(jiān)牢藍(lán)或堅(jiān)牢紅堅(jiān)牢藍(lán)或堅(jiān)牢紅) )而成。而成。v優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被抑制和破壞，而不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高抑制和破壞，而不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高特異性。特異性。v缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明確。確。3 GOD(3 GOD(葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶) )： 以以-D-D-葡萄糖底物葡萄糖底物，被，被GODGOD氧化生成的氧化生成的H H2 2O O2 2，又作為，又作為HRPHRP的催化底物，最后仍可用的催化底物，最后仍可用DABDAB顯色。顯色。 適用于

10、兩種酶的放大技術(shù)：適用于兩種酶的放大技術(shù)： 即用即用GODGOD和和HRPHRP分別標(biāo)記第二和第三抗體分別標(biāo)記第二和第三抗體( (如第一抗體是如第一抗體是小鼠小鼠mAbmAb，第二抗體為，第二抗體為GODGOD標(biāo)記的兔抗小鼠標(biāo)記的兔抗小鼠IgGIgG，第三抗，第三抗體為體為HRPHRP標(biāo)記的羊抗兔標(biāo)記的羊抗兔IgG)IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又，孵育液即含有葡萄糖，又含有含有DABDAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特異性。，此法可提高免疫染色的敏感性和特異性。呈色反應(yīng)注意要點(diǎn)：呈色反應(yīng)注意要點(diǎn)： 底物濃度：底物濃度： 應(yīng)夠高，保證最大反應(yīng)速度應(yīng)夠高，保證最大反應(yīng)速度; ; pH pH值：

11、值： 滿足酶活性的最適滿足酶活性的最適pHpH，常由緩沖液提供，常由緩沖液提供; ; 溫度：溫度： 室溫即室溫即18-2218-22，或，或3737； 時(shí)間時(shí)間： 顯色反應(yīng)時(shí)間應(yīng)在鏡下觀察來(lái)控制，顯色反應(yīng)時(shí)間應(yīng)在鏡下觀察來(lái)控制， 以特異性顯色清晰而背景又無(wú)非特異性著色時(shí)即可以特異性顯色清晰而背景又無(wú)非特異性著色時(shí)即可終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。（二）染色程序（二）染色程序1 1 直接法（冰凍切片）直接法（冰凍切片）1 1）新鮮組織切片）新鮮組織切片, ,冷丙酮固定冷丙酮固定10min,10min,干燥后干燥后, ,入入PBSPBS。2 2）0.3H H2 2O O2 2 - -甲醇液處理甲醇液處理30

12、30, ,封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶; ;3 3）0.0l molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。4) 54) 5-10-10正常羊血清室溫處理正常羊血清室溫處理30min30min。5) 1:50-1:100 HRP-5) 1:50-1:100 HRP-標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體, 37, 37孵育孵育6060或或44過(guò)夜。過(guò)夜。6) 6) 0.0l molmolL PBSL PBS洗洗3 3次。次。7) DAB7) DABH H2 2O O2 2顯色顯色( (新鮮配制新鮮配制) )。8) 8) 0.01molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。9) 9) 梯度乙醇脫水，二甲

13、苯透明，封片。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。2 2 間接法間接法1) 1) 石蠟切片脫蠟至水；石蠟切片脫蠟至水； 冰凍切片冰凍切片 室溫干燥室溫干燥-丙酮固定丙酮固定-緩沖液漂洗溶去緩沖液漂洗溶去OCTOCT包埋劑包埋劑2) 2) 甲醇雙氧水室溫處理切片甲醇雙氧水室溫處理切片151530min,30min,封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。3) PBS3) PBS漂洗漂洗4) 4) 0.11 1牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA),(BSA),濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育15152525, ,然后吸去孵育然后吸去孵育液液, ,不沖洗不沖洗. . 5% 5%1010正常兔血清正

14、常兔血清( (或山羊血清或山羊血清),),濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育15152020然后吸去。然后吸去。5)5)滴加滴加PBSPBS適當(dāng)稀釋的第一抗體適當(dāng)稀釋的第一抗體, ,濕盒內(nèi)孵育濕盒內(nèi)孵育, ,或或44過(guò)夜過(guò)夜, ,或室溫或室溫2 24h4h。6) PBS6) PBS充分沖洗充分沖洗7) 7) 滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)第二抗體滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)第二抗體, ,濕盒孵育濕盒孵育45456060( (室溫或室溫或37)37)。8) PBS8) PBS漂洗漂洗(3(3次次, ,每次每次2-52-5) )。9)9)顯色：顯色： HRPHRP標(biāo)記抗體（標(biāo)記抗體（0.01- -0.1% H% H2 2O

15、O2 2 + + 0.01- -0.5DABDAB液）液） ALPALP標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體（2mg2mg磷酸萘酚磷酸萘酚AS-MX+AS-MX+0.2mlml二甲基甲酰胺，用前加堅(jiān)牢紅二甲基甲酰胺，用前加堅(jiān)牢紅TRTR鹽鹽) )。 切片入此液切片入此液, ,室溫室溫10101515。 GODGOD標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體（-D-D-葡萄糖葡萄糖67mg + 67mg + 硝基藍(lán)四唑硝基藍(lán)四唑6.7mg+6.7mg+吩嗪甲硫酸酯吩嗪甲硫酸酯0.107mgmg， 3737孵育孵育1h1h。10) 10) 流水中終止呈色反應(yīng)；流水中終止呈色反應(yīng)；11) 11) 復(fù)染細(xì)胞核（甲綠、蘇木精）；復(fù)染細(xì)胞核（甲綠、蘇

16、木精）；10s10s12) DAB12) DAB顯色標(biāo)本顯色標(biāo)本-樹膠封固。樹膠封固。 其它其它-水溶性介質(zhì)水溶性介質(zhì)( (如甘油明膠如甘油明膠) )封固。封固。13) 13) 鏡檢結(jié)果：按上法鏡檢結(jié)果：按上法HRPHRP陽(yáng)性者呈棕色，陽(yáng)性者呈棕色，ALPALP法陽(yáng)性者呈紅法陽(yáng)性者呈紅 色，色，GODGOD法陽(yáng)性者呈藍(lán)色。法陽(yáng)性者呈藍(lán)色。 二、非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法二、非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法 酶橋法、過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法酶橋法、過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 PAPPAP( (一一) ) 酶橋法酶橋法1 1 原理：三種抗體原理：三種抗體一抗一抗二抗二抗-橋抗體橋抗體三抗三抗-抗酶抗酶

17、(HRP)(HRP)抗體抗體, , 酶酶(HRP)(HRP)與抗酶抗體結(jié)合與抗酶抗體結(jié)合, ,經(jīng)底物的顯色反應(yīng)將抗原顯示出來(lái)。經(jīng)底物的顯色反應(yīng)將抗原顯示出來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記任何抗體均未被酶標(biāo)記, ,酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合, , 避免因避免因共價(jià)結(jié)合對(duì)抗體和酶活性的影響共價(jià)結(jié)合對(duì)抗體和酶活性的影響, ,敏感性高敏感性高, , 可節(jié)約一抗?？晒?jié)約一抗。需要同一種屬動(dòng)物制備一抗和抗酶抗體。需要同一種屬動(dòng)物制備一抗和抗酶抗體。非標(biāo)記抗體酶法非標(biāo)記抗體酶法 酶橋法酶橋法原理：原理：首先用酶免疫動(dòng)物，制備首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗

18、酶抗體；效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體；以二抗作橋，將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在以二抗作橋，將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上；一抗上； 再將酶結(jié)合在抗酶抗體再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，形成上，形成復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記。任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。避免了共價(jià)連接對(duì)抗體和合的。避免了共價(jià)連接對(duì)抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏酶活性的損害，提高了方法的敏感性，而且節(jié)省一抗的用量。感性，而且節(jié)省一抗的用量。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，抗酶抗體不易敏感性低，抗酶抗體不易純化。純化。2 2 酶橋法染色程序酶橋法

19、染色程序同上述酶標(biāo)抗體法。同上述酶標(biāo)抗體法。 滴加滴加第一抗體第一抗體, ,于濕盒內(nèi)于濕盒內(nèi)44孵育孵育161624h24h。 PBSPBS洗洗2 2次，每次次，每次5 5( (可振搖可振搖) )。 加加第二抗體第二抗體( (橋抗體橋抗體),),濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。 加加抗酶抗酶(HRP)(HRP)抗體抗體, ,濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。 加加過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶(HRP)(HRP)溶液溶液(70(70100g100gm1),m1),濕盒內(nèi)室

20、溫濕盒內(nèi)室溫 孵育孵育3030。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。換。換TrisTris緩沖液洗緩沖液洗5 5。 顯色反應(yīng)及后處理同酶標(biāo)記法。顯色反應(yīng)及后處理同酶標(biāo)記法。 酶橋法的缺點(diǎn)：酶橋法的缺點(diǎn)： 抗酶抗體內(nèi)存在低親和力和高親和力兩類抗體；抗酶抗體內(nèi)存在低親和力和高親和力兩類抗體；低親和力抗酶抗體低親和力抗酶抗體-與酶結(jié)合力較弱，漂洗時(shí)易解離，與酶結(jié)合力較弱，漂洗時(shí)易解離，可使約可使約7070的酶丟失，因而降低了方法的敏感性；的酶丟失，因而降低了方法的敏感性；在抗酶抗體內(nèi)，也含有在抗酶抗體內(nèi)，也含有非特異性非特異性( (抗酶抗酶) )抗體抗體，因其抗，因其抗原性與抗酶抗

21、體相同，故也可與橋抗體結(jié)合，由于其未原性與抗酶抗體相同，故也可與橋抗體結(jié)合，由于其未與酶結(jié)合，也會(huì)影響細(xì)胞組織內(nèi)抗原的顯示。與酶結(jié)合，也會(huì)影響細(xì)胞組織內(nèi)抗原的顯示。( (二二) PAP) PAP法（過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法）法（過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法） PAPPAP復(fù)合物：復(fù)合物： 抗酶抗體抗酶抗體 + + 足量的酶足量的酶 = = 形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物 ( (由三個(gè)過(guò)氧化物酶分子和二個(gè)抗酶抗體分子組成由三個(gè)過(guò)氧化物酶分子和二個(gè)抗酶抗體分子組成) ) 原理：三種抗體原理：三種抗體 PAPPAP復(fù)合物代替了酶橋法中的抗酶抗體。復(fù)合物代替了酶橋法中的抗酶抗體。 一抗一抗

22、二抗二抗-橋抗體橋抗體 PAPPAP復(fù)合物復(fù)合物 要求：要求： 抗酶抗體的動(dòng)物種屬應(yīng)和制備第一抗體的動(dòng)物相同?？姑缚贵w的動(dòng)物種屬應(yīng)和制備第一抗體的動(dòng)物相同。 非標(biāo)記抗體酶法非標(biāo)記抗體酶法-PAP-PAP法法雙雙PAPPAP法法原理：原理：同酶橋法，只是把抗酶抗體同酶橋法，只是把抗酶抗體- -酶制成酶制成復(fù)合物（復(fù)合物（PAPPAP復(fù)合物），形成復(fù)合物），形成復(fù)合物。復(fù)合物。v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： PAPPAP復(fù)合物結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，沖洗時(shí)酶分子不會(huì)脫落，靈敏度高，比酶橋法復(fù)合物結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，沖洗時(shí)酶分子不會(huì)脫落，靈敏度高，比酶橋法高高2020倍；倍； PAPPAP是一種復(fù)合物，無(wú)游離免疫球蛋白存在，不易引起非特異性染色；是一種復(fù)合物，無(wú)游離免疫球蛋白存在，不易引起非特異性染色； 雙雙PAPPAP法：通過(guò)兩次連接橋抗體和法：通過(guò)兩次連接橋抗體和PAPPAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了更多的酶分子，使敏感性大大增強(qiáng)，更適用于常規(guī)石蠟切片中微量和合了更多的酶分子，使敏感性大大增強(qiáng)，更適用于常規(guī)石蠟切片中微量和抗原性減弱的抗原檢測(cè)。抗原性減弱的抗原檢測(cè)。v缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： PAPPAP復(fù)合物制備較復(fù)雜；復(fù)合物制備較復(fù)雜； 免疫染色步驟多、需時(shí)長(zhǎng)；免疫染色步驟多、需時(shí)長(zhǎng)； 由于由于PAPPAP復(fù)合物分子量較大，對(duì)