第五章 單倍體細胞培養(yǎng)

1、5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)l 5.1單倍體的起源和遺傳行為單倍體的起源和遺傳行為 5.1.1單倍體的起源單倍體的起源:主要有主要有4種方法可以誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體：種方法可以誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體：l （1）種間和屬間雜交：）種間和屬間雜交：遠緣花粉刺激 。遠緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉，受精，由于遠緣花粉的誘導(dǎo)作用，卵細胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚。如馬鈴薯，大麥，小麥，玉米。l （2）物理照射和化學誘變）物理照射和化學誘變：花粉用射線照射后失去了受精能力， 然后與母株授粉，卵細胞在花粉的刺激作用下進行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體。如煙草，小麥，金魚草。 方法：射線、二甲基亞砜、

2、萘乙酸、馬來酰肼、秋水仙素。 l （3）雙生苗的篩選）雙生苗的篩選：有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個或多個胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體，二倍體-二倍體和單倍體-二倍體植株。在Capiscum中,雙生苗的頻率受母本基因型控制。通過篩選可以提高雙生苗的頻率。l （4）花藥、花粉培養(yǎng)）花藥、花粉培養(yǎng)：未授粉的子房、胚珠離體培養(yǎng)5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.1.2單倍體的遺傳行單倍體的遺傳行為為l 一倍的單倍體只有一倍的單倍體只有一個染色體基數(shù)一個染色體基數(shù)(X) ，減數(shù)分裂時染色體減數(shù)分裂時染色體不能配對，分離極不能配對，分離極不正常，但具有一不正常，但具有一定同源關(guān)系的染

3、色定同源關(guān)系的染色體可以部分配對，體可以部分配對，從而可以對染色體從而可以對染色體的演化過程進行研的演化過程進行研究。究。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng) 5.2單倍體的應(yīng)用價值單倍體的應(yīng)用價值（1）在植物育種中使后代迅速純合）在植物育種中使后代迅速純合母本母本 父本父本 F2F1品系比較試驗品系比較試驗區(qū)域試驗區(qū)域試驗品種品種花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花粉植株花粉植株加倍加倍選擇鑒定選擇鑒定5-8代代5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)（2）提高選擇效率）提高選擇效率AAbb(母本）母本）aaBB(父本）父本）Ab(雌配子）雌配子）aB(雄配子）雄配子）AaBb(F1）常規(guī)雜交育種常規(guī)雜交育種不同類型卵不

4、同類型卵ABAbaBab精精子子ABAbaBab單倍體育種單倍體育種AABB AABb AaBB AaBbAABb AAbb AaBb AabbAaBB AaBbaaBbaaBBAaBb Aabb aaBb aabbAABBAAbbAAbbaaBBaabb5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)l5.2單倍體的應(yīng)用價值單倍體的應(yīng)用價值l （3）排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾）排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾 l （4）遺傳研究的良好實驗材料體系）遺傳研究的良好實驗材料體系 l （5）突變體的篩選）突變體的篩選 l （6）消除致死基因）消除致死基因 l （7）選育新型自交系）選育新型自交系 l （8）遺傳轉(zhuǎn)化

5、的受體材料）遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料 l （9）基因表達研究的良好材料）基因表達研究的良好材料5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)l5.3離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育l 5.3.1小孢子的正常發(fā)育小孢子的正常發(fā)育5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)l5.3離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育l 5.3.1小孢子的正常發(fā)育小孢子的正常發(fā)育l 花粉的分裂增殖方式有四種類型花粉的分裂增殖方式有四種類型: l 1)營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑;l 2)生殖細胞發(fā)育途徑生殖細胞發(fā)育途徑 ;l 3)營養(yǎng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑營養(yǎng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑 ;l 4)花粉均

6、等分裂途徑花粉均等分裂途徑 5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng) 取材取材 預(yù)處理預(yù)處理 消毒消毒 接種接種 培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件 花粉植株的誘導(dǎo)花粉植株的誘導(dǎo) 壯苗和移栽壯苗和移栽5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)5.4.1花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng) 操作技術(shù)操作技術(shù)5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4.2 影響花藥培養(yǎng)的因素影響花藥培養(yǎng)的因素供試植株的年齡供試植株的年齡：多數(shù)情況下幼年植株優(yōu)于老年植株多數(shù)情況下幼年植株優(yōu)于老年植株,可甘藍型油菜可甘藍型油菜卻相反卻相反. 花粉發(fā)育時期：花粉發(fā)育時期：因物種而異因物種而異.在煙草中在煙草中, 處于

7、第一次有絲分裂期處于第一次有絲分裂期的花粉效果最好的花粉效果最好,而在禾本科和蕓苔屬中而在禾本科和蕓苔屬中,單核早期最好單核早期最好. 花蕾和花藥的預(yù)處理：花蕾和花藥的預(yù)處理：對于有些物種對于有些物種,培養(yǎng)前對花藥和花蕾進培養(yǎng)前對花藥和花蕾進行預(yù)處理行預(yù)處理,能顯著提高培養(yǎng)效果能顯著提高培養(yǎng)效果.如大麥花藥如大麥花藥,在在40C 處理處理28 天天,或或70C 處處理理14 天天,能收到最好效果能收到最好效果. 除溫度處理以外除溫度處理以外,其它一些因素的預(yù)處理有時其它一些因素的預(yù)處理有時也能收效也能收效, 如用激素處理供體植株可以提高土豆花藥單倍體的形成能力如用激素處理供體植株可以提高土豆花

8、藥單倍體的形成能力.用用E MS,酒精酒精,射線射線,降低氣壓降低氣壓,高低滲處理進行預(yù)處理的也有報道高低滲處理進行預(yù)處理的也有報道. 供試植株的生長條件供試植株的生長條件：在煙草中,短光周期(8h)和高光強(16000lux)較有利.而大麥,低溫(120)和高光強(20000lux)較好.蕓苔屬的一些種(油菜) ,高光強和一定的溫度變化較有利,對于甘藍型冬油菜來講,植株在150 下生長比200 下好.對煙草植株進行氮饑餓處理可以提高花藥培養(yǎng)效果. 5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4.2 影響花藥培養(yǎng)的因素影響花藥培養(yǎng)的因素 活性炭的作用活性炭的作用：培養(yǎng)基中加入活性炭可以使煙草雄核發(fā)育的

9、花培養(yǎng)基中加入活性炭可以使煙草雄核發(fā)育的花藥數(shù)由藥數(shù)由15%增加到增加到45%。供體植株的基因型供體植株的基因型：小孢子能否進行胚胎發(fā)生受基因控制小孢子能否進行胚胎發(fā)生受基因控制,所以所以, 供體供體植株的基因型對花藥培養(yǎng)效果有重要影響植株的基因型對花藥培養(yǎng)效果有重要影響. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基:花藥培養(yǎng)時往往需要一定的滲透壓花藥培養(yǎng)時往往需要一定的滲透壓, 成熟花粉是二細胞結(jié)構(gòu)成熟花粉是二細胞結(jié)構(gòu)的往往需低濃度糖的往往需低濃度糖,而成熟花粉為三細胞結(jié)構(gòu)的植物往往需高滲條件而成熟花粉為三細胞結(jié)構(gòu)的植物往往需高滲條件,如如油菜小孢子培養(yǎng)時油菜小孢子培養(yǎng)時,糖的濃度可用到糖的濃度可用到13-17%.培養(yǎng)基

10、中激素的種類培養(yǎng)基中激素的種類,使用使用量和配比量和配比,對誘發(fā)小孢子啟動分裂對誘發(fā)小孢子啟動分裂,生長和分化常常起決定作用生長和分化常常起決定作用,而其它成而其它成分一般只起次要的輔助作用分一般只起次要的輔助作用.因此因此,在進行花藥培養(yǎng)時在進行花藥培養(yǎng)時,進行細致的激素方進行細致的激素方面的實驗是必要的面的實驗是必要的.氮素的量和各種氮素的比例對培養(yǎng)效果有明顯影響氮素的量和各種氮素的比例對培養(yǎng)效果有明顯影響.有機物質(zhì)在花藥培養(yǎng)中可能起重要作用有機物質(zhì)在花藥培養(yǎng)中可能起重要作用.在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中,谷谷氨酰胺對小孢子胚形成具有明顯的促進作用氨酰胺對小孢子胚形成具

11、有明顯的促進作用.有些作物的花藥對培養(yǎng)基有些作物的花藥對培養(yǎng)基的的pH 值有一定要求值有一定要求 。培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件:多數(shù)植物在多數(shù)植物在250 下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織, 可某些植物可某些植物,尤其是蕓苔屬尤其是蕓苔屬,在高溫在高溫350 下處理幾天下處理幾天,然后進入然后進入250 培養(yǎng)能收到最培養(yǎng)能收到最好培養(yǎng)效果好培養(yǎng)效果. 5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)5.4.3逆境處理對小孢子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)作用逆境處理對小孢子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)作用 熱激、熱激、射線、秋水仙素處理對孤雄生殖均有誘導(dǎo)作用。射線、秋水仙素處理對孤雄生殖均有誘導(dǎo)作用。如熱激處理在甘藍型

12、油菜中應(yīng)用最普遍，如熱激處理在甘藍型油菜中應(yīng)用最普遍，32處理處理8h8h以上誘導(dǎo)孤雄生殖。以上誘導(dǎo)孤雄生殖。射線射線對小孢子胚胎發(fā)生具有刺激作用，尤其與高溫熱激處理相結(jié)合。如對小孢子胚胎發(fā)生具有刺激作用，尤其與高溫熱激處理相結(jié)合。如5rad/min的低照射率，可有效刺激小孢子胚胎發(fā)生。的低照射率，可有效刺激小孢子胚胎發(fā)生。低溫處理（冷激處理）：低溫處理（冷激處理）：花粉花粉/花藥在低溫（花藥在低溫（4-13）處理一段時間，）處理一段時間，再轉(zhuǎn)移到再轉(zhuǎn)移到25培養(yǎng)，能促進孤雄生殖。最適處理時間的長短隨溫度、花粉發(fā)培養(yǎng)，能促進孤雄生殖。最適處理時間的長短隨溫度、花粉發(fā)育時期和基因型而變化。育時期

13、和基因型而變化。營養(yǎng)饑餓處理：營養(yǎng)饑餓處理：在在25條件下對煙草小孢子饑餓處理，或有糖存在情況條件下對煙草小孢子饑餓處理，或有糖存在情況下下33-37的熱激均能使小孢子實現(xiàn)胚胎發(fā)生。的熱激均能使小孢子實現(xiàn)胚胎發(fā)生。重金屬脅迫：重金屬脅迫：能促進小孢子胚胎發(fā)生，如硝酸銀可提高油菜花藥的培養(yǎng)能促進小孢子胚胎發(fā)生，如硝酸銀可提高油菜花藥的培養(yǎng)效果。效果。上述多因子的結(jié)合上述多因子的結(jié)合 其機理是改變細胞分裂周期，改變細胞發(fā)育途徑等。其機理是改變細胞分裂周期，改變細胞發(fā)育途徑等。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)5.4.4單倍體植株再生單倍體植株再生 花藥培養(yǎng)可以通過小孢子分裂直接

14、產(chǎn)生胚，從而產(chǎn)生單倍體植株，也可以先形成胚結(jié)構(gòu)或愈傷組織額，再通過胚胎發(fā)生或器官發(fā)生形成植株。胚萌發(fā)成苗的培養(yǎng)基一般與誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同，大量的胚形成后可以轉(zhuǎn)移到不同的培養(yǎng)條件下，尋找最合適的促進胚萌發(fā)成苗的培養(yǎng)條件。如適當?shù)乃置{迫可以提高秈稻花培綠苗的分化率。當pH6.0-6.2時，培養(yǎng)基硬度變大，有利于愈傷組織生理狀態(tài)的改善，提高綠苗分化率。瓊脂濃度6.5-7.0g/L也能促進綠苗分化。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)5.4.5單倍體植株的加倍處理單倍體植株的加倍處理 單倍體植株通常情況下表現(xiàn)為植株矮小，生長瘦弱，由于染色體在減數(shù)分裂時不能正常配對，所以表現(xiàn)為高度不育。

15、對單倍體進行加倍處理，使其成為雙單倍體，是穩(wěn)定其遺傳行為和為育種服務(wù)的必要措施。方法如(1)自然加倍、(2)秋水仙素誘導(dǎo)。具體方法是：把幼小的花粉植株浸入過濾滅菌的秋水仙素溶液中96小時,然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上使其進一步生長。秋水仙素處理也可通過羊毛脂進行，即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部葉片的腋芽上，然后將主莖的頂芽去掉，以刺激側(cè)芽長成二倍體的可育枝條。為了加倍顛茄的單倍體細胞，Rashid & Street(1974)在懸浮培養(yǎng)基中加入1g/L 秋水仙素，處理24 小時之后，再把細胞轉(zhuǎn)移到不含秋水仙素的培養(yǎng)基中，結(jié)果可使70%的細胞二倍化。(3) 氟樂靈，是一種植物特異性微管形成抑制劑

16、,也可使染色體加倍。5.4.6 孤雌生殖誘導(dǎo)的分子機制孤雌生殖誘導(dǎo)的分子機制5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.4花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)5.4.6 孤雌生殖誘導(dǎo)的分子機制孤雌生殖誘導(dǎo)的分子機制1986年有些花粉特異性基因的下調(diào)與孤雄生殖的誘導(dǎo)有關(guān)，封阻花粉花粉特異性基因的轉(zhuǎn)錄對煙草孤雄生殖的啟動有幫助作用。1994年在油菜中得到的與孤雄生殖有關(guān)的分子標記是napin基因的表達孤雄生殖過程的一致性。1997年從小麥中分離到一種類似于金屬硫蛋白的蛋白，證明是胚特異性的，受ABA調(diào)節(jié)。在煙草中分離到一個基因，在孤雄生殖過程中上升調(diào)控。單倍體的誘導(dǎo)受基因控制，并可以雜交轉(zhuǎn)育，同一種基因型的個體間，花藥培養(yǎng)特

17、性也存在差異，通過選擇可提高花藥培養(yǎng)的反應(yīng)能力。關(guān)于花粉單倍體及其植株形成的分子機制仍欠缺，但至少已認識到一些基因的 上升或下降調(diào)控、新基因的表達等與這一過程有關(guān)。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.5花粉（小孢子）培養(yǎng)花粉（小孢子）培養(yǎng)5.5.1 花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)的技術(shù)?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)的范疇，而花粉培養(yǎng)與單細胞培養(yǎng)相似?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)實質(zhì)：花藥和花粉培養(yǎng)實質(zhì)：把發(fā)育到一定階段的花藥（或花粉）接種在人工培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化，最

18、終發(fā)育成完整植株的過程。 廣義的花粉培養(yǎng)，孤雄生殖。 培養(yǎng)類型：花藥-器官培養(yǎng) 培養(yǎng)類型：花粉-單細胞培養(yǎng)兩者目的一致：誘導(dǎo)花粉細胞發(fā)育成單倍體植株。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.5花粉（小孢子）培養(yǎng)花粉（小孢子）培養(yǎng)5.5.1 花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較花粉培養(yǎng)在某些方面比花藥培養(yǎng)有一定優(yōu)勢：花粉培養(yǎng)在某些方面比花藥培養(yǎng)有一定優(yōu)勢：花藥培養(yǎng)有時會由于花藥中的有害物質(zhì)而不能誘導(dǎo)小孢子啟動第一次分裂。小孢子培養(yǎng)存在的問題：小孢子培養(yǎng)存在的問題：花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙倍體，不含有因藥壁、花絲、花隔等體細胞組織的干擾而

19、形成的體細胞植株；由于起始材料是小孢子，獲得的材料總是純合的；小孢子培養(yǎng)可觀察到由單細胞開始雄核發(fā)育的全過程；是很好的遺傳與發(fā)育研究的材料體系；由于花粉能均勻的接觸化學的和物理的誘變因素，花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.5花粉（小孢子）培養(yǎng)花粉（小孢子）培養(yǎng)5.5.1 花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較花藥和花粉培養(yǎng)實質(zhì)：花藥和花粉培養(yǎng)實質(zhì)：把發(fā)育到一定階段的花藥（或花粉）接種在人工培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化，最終發(fā)育成完整植株的過程。 廣義的花粉培養(yǎng)，孤雄生殖。 培養(yǎng)類型：花藥-器官培養(yǎng)

20、培養(yǎng)類型：花粉-單細胞培養(yǎng)兩者目的一致：兩者目的一致：誘導(dǎo)花粉細胞發(fā)育成單倍體植株。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.5花粉（小孢子）培養(yǎng)花粉（小孢子）培養(yǎng)5.5.2 分離花粉的方法分離花粉的方法1）花粉漂浮自然釋放法）花粉漂浮自然釋放法:將花藥接種于液體培養(yǎng)中，使花粉自然釋放。 2）研磨過濾收集法：）研磨過濾收集法：將花蕾消毒后，放入含培養(yǎng)基或分離液的無菌研磨器中研磨，使花粉（小孢子）釋放出來，然后再通過一定孔徑的網(wǎng)篩過濾，離心收集花粉并用培養(yǎng)基或分離液洗滌，然后用培養(yǎng)基將花粉調(diào)整到理想的培養(yǎng)密度，移入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。3）剖裂釋放法）剖裂釋放法:借助一定工具剖裂藥壁使花粉釋放出來。 4）磁拌

21、法：）磁拌法：將花藥接種與盛有培養(yǎng)液的無菌器皿中，再放入一根磁棒，置于磁力攪拌器上，低速旋轉(zhuǎn)，使花藥張的小孢子釋放出來。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.5花粉（小孢子）培養(yǎng)花粉（小孢子）培養(yǎng)5.5.2 花粉（小孢子）培養(yǎng)方法花粉（小孢子）培養(yǎng)方法1.液體淺層培養(yǎng)：液體淺層培養(yǎng)：分離的小孢子經(jīng)洗滌純化后，調(diào)整到需要的濃度，根據(jù)培養(yǎng)皿的大小，適量加入培養(yǎng)皿培養(yǎng)。2.平板培養(yǎng)：平板培養(yǎng)：直接取新鮮花藥的花粉粒在平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的方法。3.看護培養(yǎng)：看護培養(yǎng)：將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆蓋小圓形濾紙，在濾紙滴加0.5ml含10個花粉粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。4. 微室懸滴培養(yǎng)：微室懸滴培

22、養(yǎng)：將一滴含50-80粒的花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來放在凹穴載玻片上，蓋玻片四周用石蠟密封。5.條件培養(yǎng)法：條件培養(yǎng)法：在合成培養(yǎng)基中加入失活的花藥提取物，再接入花粉進行培養(yǎng)。由于失活花藥的提取物中含有促進花粉發(fā)育的物質(zhì)，有利于花粉培養(yǎng)成功。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.5花粉（小孢子）培養(yǎng)花粉（小孢子）培養(yǎng)5.5.4 影響花粉（小孢子）培養(yǎng)的因素影響花粉（小孢子）培養(yǎng)的因素1. 選擇合適的基因型分離小孢子是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素，不選擇合適的基因型分離小孢子是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素，不同植物、不同基因型獲得最佳培養(yǎng)效果的花蕾大小也不一樣。同植物、不同基因型獲

23、得最佳培養(yǎng)效果的花蕾大小也不一樣。2. 一定條件下預(yù)培養(yǎng)后的花藥分離出的花粉再進行培養(yǎng)容易一定條件下預(yù)培養(yǎng)后的花藥分離出的花粉再進行培養(yǎng)容易收到良好的效果，如低溫預(yù)處理、饑餓、高滲處理等。收到良好的效果，如低溫預(yù)處理、饑餓、高滲處理等。3.培養(yǎng)基的成分影響花粉的培養(yǎng)效果，但需要設(shè)置不同處理培養(yǎng)基的成分影響花粉的培養(yǎng)效果，但需要設(shè)置不同處理進行試驗，不斷探索和完善。進行試驗，不斷探索和完善。4. 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)與培養(yǎng)效果有關(guān)。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)與培養(yǎng)效果有關(guān)。5.良好的培養(yǎng)與再生效果需要多種因素綜合改進使用，如在良好的培養(yǎng)與再生效果需要多種因素綜合改進使用，如在芝麻菜（芝麻菜（rocket）的小

24、孢子培養(yǎng)中，活性炭與高溫處理對?。┑男℃咦优囵B(yǎng)中，活性炭與高溫處理對小孢子很重要，并能夠建立一個高效的培養(yǎng)體系，可獲得大量孢子很重要，并能夠建立一個高效的培養(yǎng)體系，可獲得大量的小孢子胚，有效促進胚萌發(fā)而發(fā)育成植株。的小孢子胚，有效促進胚萌發(fā)而發(fā)育成植株。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.6 禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象象禾谷類植物花粉單倍體生產(chǎn)中存在的一個嚴重問題是出現(xiàn)大量白化苗。水稻白化苗禾谷類植物花粉單倍體生產(chǎn)中存在的一個嚴重問題是出現(xiàn)大量白化苗。水稻白化苗的產(chǎn)生與基因型和培養(yǎng)溫度有密切關(guān)系，小麥白化苗產(chǎn)生的頻率隨溫度增加而增加的產(chǎn)生與基因型和培養(yǎng)溫度有

25、密切關(guān)系，小麥白化苗產(chǎn)生的頻率隨溫度增加而增加（25-35）。）。白化苗的產(chǎn)生與很多因素有關(guān)，包括內(nèi)部因素和外部因素。內(nèi)因：基因型和花粉發(fā)白化苗的產(chǎn)生與很多因素有關(guān)，包括內(nèi)部因素和外部因素。內(nèi)因：基因型和花粉發(fā)育時期的影響最明顯；外因：高溫、高濃度育時期的影響最明顯；外因：高溫、高濃度2,4-D、延遲分化培養(yǎng)時間等。、延遲分化培養(yǎng)時間等。白化苗產(chǎn)生的機制可能是由于質(zhì)體基因組的變異造成的，或來自染色體畸變的花粉，白化苗產(chǎn)生的機制可能是由于質(zhì)體基因組的變異造成的，或來自染色體畸變的花粉，也可能是花粉有絲分裂過程中，質(zhì)體不能分化并降解。也可能是花粉有絲分裂過程中，質(zhì)體不能分化并降解?？赏ㄟ^適當?shù)恼{(diào)整

26、措施降低白化苗的頻率，如大麥控制白化苗的產(chǎn)生的措施：可通過適當?shù)恼{(diào)整措施降低白化苗的頻率，如大麥控制白化苗的產(chǎn)生的措施：1）采用同高綠苗分化率的品種雜交，再對）采用同高綠苗分化率的品種雜交，再對F1進行花培，可改善和提高綠苗分化率。進行花培，可改善和提高綠苗分化率。2）田間用）田間用10-20mg/L BA處理大麥花粉。處理大麥花粉。3）取花粉發(fā)育時期處于單核早、中期的大麥穗子。）取花粉發(fā)育時期處于單核早、中期的大麥穗子。4）用約）用約4 低溫預(yù)處理。低溫預(yù)處理。5）脫分化培養(yǎng)基使用）脫分化培養(yǎng)基使用2,4-D配以少量配以少量2,4,5-T和和BA，將碳源改為麥芽糖。，將碳源改為麥芽糖。6）提

27、早進行花粉脫分化的轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)。）提早進行花粉脫分化的轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)。7）誘導(dǎo)花粉細胞走胚胎發(fā)生途徑，可根本克服花粉白化苗的產(chǎn)生。）誘導(dǎo)花粉細胞走胚胎發(fā)生途徑，可根本克服花粉白化苗的產(chǎn)生。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.7 從雌配子體誘導(dǎo)單倍體植株從雌配子體誘導(dǎo)單倍體植株通過未受精子房、胚珠等培養(yǎng)可以誘導(dǎo)獲得單倍體。成熟胚囊含有通過未受精子房、胚珠等培養(yǎng)可以誘導(dǎo)獲得單倍體。成熟胚囊含有8個單個單倍體核，通過培養(yǎng)，倍體核，通過培養(yǎng)，8個核都有發(fā)育成單倍體的潛力，但對于向日葵來說，個核都有發(fā)育成單倍體的潛力，但對于向日葵來說，多數(shù)情況下單倍體從卵細胞發(fā)育而來。水稻子房培養(yǎng)的單倍體從助細胞發(fā)多數(shù)情況下

28、單倍體從卵細胞發(fā)育而來。水稻子房培養(yǎng)的單倍體從助細胞發(fā)育而來。育而來。很多因素影響單倍體雌配子體胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)。供體植株的生長環(huán)境、植很多因素影響單倍體雌配子體胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)。供體植株的生長環(huán)境、植株生長季節(jié)、預(yù)處理情況等。株生長季節(jié)、預(yù)處理情況等。從遺傳因素講，基因型對培養(yǎng)效果有重要影響。從遺傳因素講，基因型對培養(yǎng)效果有重要影響。 如甜菜如甜菜1300個基因型個基因型50%的基因型能產(chǎn)生單倍體植株，單倍體獲得的頻率平均為的基因型能產(chǎn)生單倍體植株，單倍體獲得的頻率平均為1%。同小孢子體細胞培養(yǎng)一樣，培養(yǎng)基對胚珠同小孢子體細胞培養(yǎng)一樣，培養(yǎng)基對胚珠/子房培養(yǎng)的單倍體胚胎發(fā)生有明子房培養(yǎng)的單倍體胚

29、胎發(fā)生有明顯影響。顯影響。當培養(yǎng)基中當培養(yǎng)基中BA的含量為的含量為0-2.0mg/L時，甜菜的單倍體產(chǎn)量可增加時，甜菜的單倍體產(chǎn)量可增加1.5-7.5%。5 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)5.8 單倍體細胞培養(yǎng)與植物育種單倍體細胞培養(yǎng)與植物育種我國花培育種技術(shù)走在世界前列，育成各種農(nóng)作物新品種幾十個，有的已推廣很大我國花培育種技術(shù)走在世界前列，育成各種農(nóng)作物新品種幾十個，有的已推廣很大面積，在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用。面積，在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用。如水稻花培育種最突出的成就是李梅芳等育成的如水稻花培育種最突出的成就是李梅芳等育成的“中花中花8 號號” ,“中花中花9 號號”,“中花中花10 號號”,

30、“中花中花11 號號”粳稻花培新品種粳稻花培新品種,豐產(chǎn)豐產(chǎn),品質(zhì)好。其它花培水稻品種還有品質(zhì)好。其它花培水稻品種還有“ 朝朝花矮花矮”,“寧糯寧糯1 號號”,“寧糯寧糯6 號號”,“ 單單209”,“浙粳浙粳66”,“京花京花101”,“京花京花103”,“中花中花12”,“花汕優(yōu)花汕優(yōu)63”,“花花8504”等品種等品種,累計推廣面積累計推廣面積1360 多萬畝多萬畝,社會和經(jīng)濟效益顯著。社會和經(jīng)濟效益顯著。 油菜小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成為油菜育種的重要輔助手段，由于小孢子培養(yǎng)群體大油菜小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成為油菜育種的重要輔助手段，由于小孢子培養(yǎng)群體大, 便于便于選擇，可以有效地縮短育種周期。華中農(nóng)業(yè)大學利用小孢子培養(yǎng)與常規(guī)育種相結(jié)合，選擇，可以有效地縮短育種周期。華中農(nóng)業(yè)大學利用小孢子培養(yǎng)與常規(guī)育種相結(jié)合，培育出培育出“華雙華雙3 號號”雙低油菜品種，累計推廣面積達雙低油菜品種，累計推廣面積達3000 萬畝。萬畝?；ㄋ幓ㄋ?小孢子培養(yǎng)是縮短育種周期、提高選擇效率、獲得遺傳材料和有用突變體的小孢子培養(yǎng)是縮短育種周期、提高