補(bǔ)充酶催化活性的測(cè)定方法1ppt課件

1、 補(bǔ)補(bǔ) 充充 2酶催化活性的測(cè)定方法酶催化活性的測(cè)定方法目目 的的掌握定時(shí)法和延續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性的原理及方法掌握定時(shí)法和延續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性的原理及方法一、測(cè)定酶促反響速度的兩類方法一、測(cè)定酶促反響速度的兩類方法一酶促反響速度的表示方法一酶促反響速度的表示方法 單位時(shí)間的底物的耗費(fèi)量單位時(shí)間的底物的耗費(fèi)量-dS/min-dS/min 單位時(shí)間的產(chǎn)物的生成量單位時(shí)間的產(chǎn)物的生成量dP/mindP/min來表示來表示二測(cè)定方法分類二測(cè)定方法分類 定時(shí)法定時(shí)法 在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)過測(cè)定總變化量再計(jì)算出速度在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)過測(cè)定總變化量再計(jì)算出速度. . 延續(xù)監(jiān)測(cè)法延續(xù)監(jiān)測(cè)法 直接用來測(cè)定速度直接用來測(cè)定

2、速度一定時(shí)法一定時(shí)法1.1.概念概念 在足量的底物系統(tǒng)中，參與一定量的酶試劑，反響一在足量的底物系統(tǒng)中，參與一定量的酶試劑，反響一定時(shí)間后，參與終止劑終止反響，然后測(cè)定底物的耗費(fèi)量或產(chǎn)定時(shí)間后，參與終止劑終止反響，然后測(cè)定底物的耗費(fèi)量或產(chǎn)物的生成量物的生成量2.2.酶活性的結(jié)果計(jì)算酶活性的結(jié)果計(jì)算 假設(shè)某一樣品的酶活性為假設(shè)某一樣品的酶活性為X XU/LU/L，取樣品量，取樣品量VsVs毫升與底毫升與底物緩沖液物緩沖液VrVr毫升孵育，經(jīng)過毫升孵育，經(jīng)過t t分鐘反響，參與終止液分鐘反響，參與終止液 Ve(ml) Ve(ml)，檢測(cè)到產(chǎn)物凈吸光度添加為檢測(cè)到產(chǎn)物凈吸光度添加為A A，該產(chǎn)物的摩

3、爾消光系數(shù)為，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為 終點(diǎn)法的摩爾消光系數(shù)普通可經(jīng)過帶規(guī)范求得比色皿光徑終點(diǎn)法的摩爾消光系數(shù)普通可經(jīng)過帶規(guī)范求得比色皿光徑為為b(cm)b(cm)假設(shè)把假設(shè)把A/tA/t以以A/minA/min表示，那么此定時(shí)法測(cè)定酶活性的計(jì)算公式與延續(xù)監(jiān)測(cè)法一樣表示，那么此定時(shí)法測(cè)定酶活性的計(jì)算公式與延續(xù)監(jiān)測(cè)法一樣3.3.定時(shí)法與終點(diǎn)法和兩點(diǎn)法的區(qū)別定時(shí)法與終點(diǎn)法和兩點(diǎn)法的區(qū)別定時(shí)法定時(shí)法 是經(jīng)過一定時(shí)間固定的時(shí)間反響后終止反響是經(jīng)過一定時(shí)間固定的時(shí)間反響后終止反響 終點(diǎn)法終點(diǎn)法 指反響根本到達(dá)平衡，信號(hào)變化很小，但可以不需指反響根本到達(dá)平衡，信號(hào)變化很小，但可以不需求終止反響求終止反響兩點(diǎn)

4、法兩點(diǎn)法 監(jiān)測(cè)反響過程中的兩個(gè)點(diǎn)，即某一段時(shí)間內(nèi)的底物監(jiān)測(cè)反響過程中的兩個(gè)點(diǎn)，即某一段時(shí)間內(nèi)的底物或產(chǎn)物的變化或產(chǎn)物的變化二延續(xù)監(jiān)測(cè)法二延續(xù)監(jiān)測(cè)法1.1.原理原理 延續(xù)監(jiān)測(cè)法是將酶與底物在特定條件緩沖液、溫度延續(xù)監(jiān)測(cè)法是將酶與底物在特定條件緩沖液、溫度等下孵育，每隔一定時(shí)間等下孵育，每隔一定時(shí)間2-60s2-60s延續(xù)測(cè)定酶促反響過程延續(xù)測(cè)定酶促反響過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號(hào)如中某一底物或產(chǎn)物的特征信號(hào)如NADHNADH在在340nm340nm的吸光度的的吸光度的變化，從而計(jì)算出每分鐘的信號(hào)變化速率變化，從而計(jì)算出每分鐘的信號(hào)變化速率2.2.酶促反響動(dòng)力學(xué)曲線酶促反響動(dòng)力學(xué)曲線 一個(gè)典型的

5、酶促反一個(gè)典型的酶促反應(yīng)過程普通包括延滯應(yīng)過程普通包括延滯期、線性期和非線性期期、線性期和非線性期1.1.延滯期延滯期 對(duì)單一酶促反響而言，是指酶促反響從開場到達(dá)最大反響對(duì)單一酶促反響而言，是指酶促反響從開場到達(dá)最大反響速度所需求的間，包括酶催化位點(diǎn)的暴露、底物解離后與酶結(jié)合速度所需求的間，包括酶催化位點(diǎn)的暴露、底物解離后與酶結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合、酶與輔酶的結(jié)合、酶的激活等等位點(diǎn)的結(jié)合、酶與輔酶的結(jié)合、酶的激活等等 對(duì)于酶偶聯(lián)反響而言，延滯期還包括中間產(chǎn)物堆積到一定對(duì)于酶偶聯(lián)反響而言，延滯期還包括中間產(chǎn)物堆積到一定程后，導(dǎo)致指示反響速度添加，直到與待測(cè)酶酶促反響速度到達(dá)程后，導(dǎo)致指示反響速度添加，直

6、到與待測(cè)酶酶促反響速度到達(dá)平衡所需的時(shí)間。普通來說，輔助酶越多，延滯期越長平衡所需的時(shí)間。普通來說，輔助酶越多，延滯期越長2.2.線性期線性期 是指酶促反響速度堅(jiān)持恒定的時(shí)期，不受底物濃度的影響。是指酶促反響速度堅(jiān)持恒定的時(shí)期，不受底物濃度的影響。此期底物雖被不斷耗費(fèi)但還缺乏以明顯改動(dòng)酶促反響的速度，即此期底物雖被不斷耗費(fèi)但還缺乏以明顯改動(dòng)酶促反響的速度，即以初速度進(jìn)展以初速度進(jìn)展3.3.非線性期非線性期 隨著反響的進(jìn)展，底物耗費(fèi)越來越明顯，反響速度明顯下降隨著反響的進(jìn)展，底物耗費(fèi)越來越明顯，反響速度明顯下降而進(jìn)入非線性期。酶濃度越高在選定條件下線性期就越短。其他而進(jìn)入非線性期。酶濃度越高在選

7、定條件下線性期就越短。其他呵斥進(jìn)入非線性期的緣由有可逆反響加強(qiáng)、產(chǎn)物抑制添加、酶變呵斥進(jìn)入非線性期的緣由有可逆反響加強(qiáng)、產(chǎn)物抑制添加、酶變性失活添加、酶聚合或解離添加等等性失活添加、酶聚合或解離添加等等二延續(xù)監(jiān)測(cè)法酶活性的結(jié)果計(jì)算二延續(xù)監(jiān)測(cè)法酶活性的結(jié)果計(jì)算 假設(shè)某一樣品的酶活性為xU/L，取樣品量Vs與底物緩沖液Vr孵育，延滯期為t0分鐘，測(cè)定間隔時(shí)間為t1分鐘，讀數(shù)次數(shù)為n，每間隔時(shí)間吸光度變化平均值為A，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為比色皿光徑為bcm。反響速度分別用產(chǎn)物的生成速度和樣品中酶的催化才干來表示 二、酶活性測(cè)定方法原理二、酶活性測(cè)定方法原理 一直接法一直接法 根據(jù)待測(cè)酶的酶促反響底物

8、或產(chǎn)物有特征性的理化性質(zhì)，根據(jù)待測(cè)酶的酶促反響底物或產(chǎn)物有特征性的理化性質(zhì)，然后經(jīng)過特殊的儀器直接檢測(cè)然后經(jīng)過特殊的儀器直接檢測(cè)1.基于基于NADH或或NADPH的反響原理的反響原理 NADH或或NADPH在在340nm處有特異吸收峰，而處有特異吸收峰，而NAD+或或NADP+只在只在260nm處有處有明顯的吸收峰，監(jiān)測(cè)明顯的吸收峰，監(jiān)測(cè)340nm吸光度變化可以反響吸光度變化可以反響NADH或或NADPH的變化。利用該原理可以測(cè)定以的變化。利用該原理可以測(cè)定以NADP+或或NADPH為輔酶的氧化復(fù)原酶為輔酶的氧化復(fù)原酶例如例如LD、G-6-PD、-HBD、AD、SD、GLDH等等 一些水解酶類

9、或轉(zhuǎn)移酶類經(jīng)過酶促反響將化合物中的某一基團(tuán)水解或移去，使無顏色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物。人們把這類底物稱為色素原底物。根據(jù)這一原理，人們有認(rèn)識(shí)地合成一系列底物用來測(cè)定酶活性，即人工合成色素原底物，利用這類底物測(cè)定的酶2基于人工合成色素原底物反響原理基于人工合成色素原底物反響原理色素原底物待測(cè)酶產(chǎn)物的毫摩爾吸光系數(shù)4-硝基磷酸酚鈉鹽ALPPNP（4-硝基酚405nm）,18.53-羧基-L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺GGT5-氨基-2-硝基苯甲酸,405nm,9.872-氯-硝基苯-半乳糖-麥芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP405nm）,6.23.3.基于氧的耗費(fèi)基于氧的耗費(fèi) 氧化酶在催化反響時(shí)會(huì)不斷耗費(fèi)氧

10、氣，可以設(shè)計(jì)氧電極來氧化酶在催化反響時(shí)會(huì)不斷耗費(fèi)氧氣，可以設(shè)計(jì)氧電極來延續(xù)監(jiān)測(cè)氧的耗費(fèi)速度延續(xù)監(jiān)測(cè)氧的耗費(fèi)速度4.4.其他其他 膽堿酯酶催化乙酰膽堿產(chǎn)生乙酸，呵斥膽堿酯酶催化乙酰膽堿產(chǎn)生乙酸，呵斥pHpH下降，可以用下降，可以用pHpH差示法測(cè)定膽堿酯酶。脫羧酶在反響過程中產(chǎn)生差示法測(cè)定膽堿酯酶。脫羧酶在反響過程中產(chǎn)生CO2CO2，可以用，可以用量積法測(cè)定量積法測(cè)定 二間接法二間接法 是指酶促反響底物和產(chǎn)物之間沒有特征性的理化性質(zhì)，需經(jīng)過另一個(gè)化學(xué)反響或生化反響，將底物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有明顯特征理化性質(zhì)的另一個(gè)化合物。用直接法來測(cè)定的酶類非常有限，很多情況下不得不運(yùn)用間接法 大多數(shù)定時(shí)法都是在酶促

11、反響終止后參與另一個(gè)試劑與底物或產(chǎn)物反響，轉(zhuǎn)化為有色化合物，再用分光光度法檢測(cè)。也有個(gè)別酶類不終止反響，參與與酶促反響無關(guān)的試劑，但能與酶促反響的某一產(chǎn)物反響生成有特征性的化合物。例如：膽堿酯酶催化酰基硫代膽堿類底物后，生成的硫代膽堿SCh與5，5-二硫代-雙2-硝基苯甲酸DTNB反響，生成黃色陰離子5-巰基-2-硝基苯甲酸5-TNBA 酸性磷酸酶測(cè)定，利用-萘酚磷酸鹽做底物，經(jīng)酸性磷酸酶水解后釋放萘酚，與試劑中的固紅TR發(fā)生偶氮反響，生成黃色化合物 1.1.化學(xué)法化學(xué)法 在酶活性測(cè)定時(shí)，常采用另一個(gè)指示酶或幾個(gè)酶輔助酶和指示酶將測(cè)定酶的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為新的產(chǎn)物，當(dāng)其他酶的反響速度與待測(cè)酶反響速度到達(dá)平衡時(shí)，可以用指示酶的反響速度來代表待測(cè)酶的活性?？梢员硎緸椋褐甘久甘侵改鼙O(jiān)測(cè)反響速度的酶輔助酶在酶偶聯(lián)反響中可以一個(gè)或多個(gè)，也可以不需求輔助酶 由于NADP+或NADPH在340nm的光吸收特性