疏水色譜201306051

1、疏水色譜的進(jìn)展研究添加文本隨著生命科學(xué)的發(fā)展,用生物技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品需要進(jìn)行分離和分析。作為分離、純化和制備生物大分子有效手段的高效液相色譜法(HPLC)在生物工程的下游技術(shù)中占有重要的地位。但是,眾所周知,在生化分離過程中,普遍存在蛋白質(zhì)易失活問題,特別是用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)純化時(shí),由于流動(dòng)相中大量有機(jī)溶劑的存在,使蛋白質(zhì)的生物活性難以保持。高效疏水色譜法(HPHIC)則克服了這一缺點(diǎn)。由于它是用含鹽水溶液作為流動(dòng)相,固定相的疏水性適中,具有分離條件溫和、不損傷蛋白質(zhì)活性、分離效率高以及柱容量大等優(yōu)點(diǎn),因此在生化分離中,特別在活性蛋白質(zhì)的分離中,日益成為人們優(yōu)先考慮的色譜分離

2、手段。前言目錄疏水色譜法的理論疏水色譜法的理論疏水色譜法疏水色譜法的的固定相固定相疏水色譜法的應(yīng)用疏水色譜法的應(yīng)用添加文本疏水色譜填料是由化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,機(jī)械強(qiáng)度好的載體(如瓊脂糖、硅膠等)和疏水配基(如C6、C8等)組成。一般來說,蛋白質(zhì)表面存在著一些疏水區(qū)域,借助于疏水區(qū)域和疏水配基間的疏水相互作用力,蛋白質(zhì)被吸附在色譜填料的表面,并且高鹽濃度可以加強(qiáng)這一作用力。因此,可以利用不同蛋白質(zhì)間的疏水性差異,通過改變洗脫時(shí)的鹽濃度就可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行有效地分離純化。一、疏水色譜法的理論研究疏水色譜法的理論研究二、疏水色譜法疏水色譜法的的固定相固定相非多孔填料非多孔填料有機(jī)填料有機(jī)填料無機(jī)填料無機(jī)填料

3、大孔膜大孔膜添加文本疏水色譜法固定相疏水色譜法固定相的發(fā)展與其它色譜法一樣,HPHIC發(fā)展的技術(shù)核心仍然是研制和開發(fā)新型的色譜填料。添加文本在無機(jī)填料中,由于硅膠的機(jī)械性能好,孔結(jié)構(gòu)和表面積易于人為控制,并有較好的化學(xué)穩(wěn)定性,因此應(yīng)用最廣泛。但硅膠的pH值應(yīng)用范圍較窄(2. 08. 0),且殘留在硅膠表面上的硅羥基會(huì)對蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附。另外,硅羥基的解離也會(huì)使填料具有陽離子交換性質(zhì),從而使分離產(chǎn)生混合機(jī)理。為了克服這些缺點(diǎn),近年來多用高分子涂層硅膠填料代替單純的硅膠填料。這種填料通常選用合適的聚合物、寡聚物或單體,使其在硅膠表面上形成致密的聚合物涂層,它既具有高聚物的化學(xué)穩(wěn)定性,又具有硅膠

4、基質(zhì)的高機(jī)械強(qiáng)度。1.無機(jī)填料無機(jī)填料Schomburg和Petro已先后對聚合物涂層技術(shù)的發(fā)展作了評述。目前出現(xiàn)的HPHIC的涂層硅膠種類很多,如用乙烯基甲基二乙氧基硅烷與乙烯基吡咯在硅膠表面上聚合得到的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)涂層硅膠填料,對蛋白質(zhì)和多肽具有良好的選擇性。N-丁基聚丙烯酰胺涂層硅膠填料 以及通過戊二醛作交聯(lián)劑制成的殼聚糖涂層硅膠填料,在分離生物大分子中各具特色。由于這些填料的硅膠表面上的硅羥基被高分子聚合物涂層掩蓋,從而消除了分離過程中溶質(zhì)的不可逆吸附及硅羥基的解離現(xiàn)象,并擴(kuò)大了流動(dòng)相使用的pH值范圍。另外,高分子功能基多種多樣,可制成多種疏水性不同的HPHIC填料。另一種

5、無機(jī)基質(zhì)是可控孔玻球,在其表面鍵合不同分子量的聚乙二醇制成醚型疏水固定相,對6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)有良好的分離效果。在大孔玻球上涂上N-丁基聚丙烯酰胺制成的疏水色譜填料對細(xì)菌外源凝集素也有較好的分離效果。添加文本以硬質(zhì)高聚物微球?yàn)榛|(zhì)的填料是HPHIC固定相中另一研究熱點(diǎn)。這種基質(zhì)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性, pH值應(yīng)用范圍寬,不容易產(chǎn)生不可逆吸附作用,特別是它與生物大分子有良好的生物相容性, 分離過程中能保持樣品的生物活性,另外,在聚合物的表面容易進(jìn)行化學(xué)改性,可形成多種固定相。對高聚物微球的合成主要采用“二步溶脹法”,最近Ogino等作了一些改進(jìn),使其成為一步溶脹法。利用二步溶脹法相繼合成出的填料有交聯(lián)

6、聚苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油脂-二甲基丙烯酸乙二醇脂共聚物、乙烯苯酚-二乙烯共聚物以及甲基丙烯酸甘油脂-二甲基丙烯酸甘油酯等。這些填料表面經(jīng)過一定的親水改性,都有可能制成HPHIC填料,只是難易程度有所不同。用戊二醛對聚氨基葡糖表面進(jìn)行化學(xué)改性制成的HPHIC固定相對6種蛋白質(zhì)分離,效果良好。2.有機(jī)填料有機(jī)填料K leinmann等用2-羥乙基異丁烯與乙烯基二異丁烯共聚物直接制成疏水色譜填料,其分離效果不太滿意,但用苯甲酰氯和1, 2-環(huán)氧-3-苯氧基丙烷對該填料進(jìn)行修飾后,其分離效果大大改善。Sing等采用聚氧乙烯型非離子表面活性劑包覆RP-HPLC填料的方法,使其轉(zhuǎn)變?yōu)镠PHIC填料,也

7、取得較好的效果。關(guān)于有機(jī)基質(zhì)的HPHIC填料,Rassi和衛(wèi)引茂等最近分別作了評述。一種用“孔徑比”衍生法制成的新型填料縮水甘油甲基丙烯酸脂-乙烯-二甲基丙烯酸酯共聚物poly (glycidyl methacrylate-co-ethylene )dime-thacrylate單分散顆粒,使一根色譜柱具有HPHIC和RP-HPLC兩種性能。這種填料中大孔徑表面的苯基密度小,并分散有親水官能團(tuán),而小孔徑表面的苯基密度高,因此用這種填料裝填的色譜柱既可在HPHIC體系中分離蛋白質(zhì),又可在RP-HPLC體系中分離糖和藥物。上述多孔填料雖然柱容較高,但柱效和分離速度相對較低。為了提高生物大分子的分析

8、速度,出現(xiàn)了非多孔填料以及大孔膜、連續(xù)床柱等新型載體。添加文本這種填料粒度一般為13m,在分離過程中可有效地避免溶質(zhì)在固定相顆粒內(nèi)部的吸附和擴(kuò)散,使溶質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間能進(jìn)行迅速的質(zhì)量遷移,而且由于粒度小、剛性好,對改善柱效、提高樣品回收率、保持溶質(zhì)分子的生物活性都十分有利,特別適合于生物大分子的高分辨分離與快速分析。目前,以硅膠和聚合物為基質(zhì)的非多孔型HPHIC固定相均有報(bào)道,比如在硅膠表面鍵合聚醚制成的非多孔硅膠填料能在2m in內(nèi)對4種蛋白混合物進(jìn)行快速分離。將大孔瓊脂糖凝膠經(jīng)收縮、交聯(lián)和非極性配基衍生制成的非多孔樹脂以及在親水高聚物表面鍵合丁基制成的非多孔樹脂也很有特色。在含有環(huán)氧

9、基的交聯(lián)共聚物微球上鍵合PEG制成非多孔樹脂亦取得較好的效果。3.非多孔填料非多孔填料添加文本高效膜色譜法是一種新型色譜方法,它采用容量大、滲透性好的膜作為載體,最大特點(diǎn)是不用復(fù)雜的儀器,并且能將膜分離過程中分離速度快、處理量大等優(yōu)點(diǎn)與柱色譜法中選擇性好、分離效率高、負(fù)載量大等優(yōu)點(diǎn)有效的結(jié)合起來,分離速率比HPLC柱高23個(gè)數(shù)量級。關(guān)于大孔膜的研究主要集中于親和膜和離子交換膜,Kubota等利用輻射誘導(dǎo)接枝法制成的疏水大孔膜在分離和制備生物大分子方面頗具特色。Tennikova等用甲基丙烯酸縮水甘油酯-辛基甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙烯交聯(lián)得到的三元聚合物膜為基體,分別制成了離子交換、疏水、反相

10、大孔膜,并利用混合蛋白質(zhì)研究了置換劑濃度、流速、梯度斜率等對分離結(jié)果的影響。4、大孔膜、大孔膜三三、疏水色譜法的應(yīng)用、疏水色譜法的應(yīng)用大分子的大分子的分離和純化分離和純化蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化變性蛋白質(zhì)的復(fù)性變性蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)折疊機(jī)理蛋白質(zhì)折疊機(jī)理添加文本能夠用HPHIC分離、純化的蛋白質(zhì)種類很多,其分子量從6 000左右的胰島素到10萬以上的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。這里不可能一一詳述,僅舉出一些實(shí)例來說明近年來HPHIC在生物大分子分離、純化中所占的重要地位。1、HPH IC在生物大分子分離和純化方面的應(yīng)用添加文本添加文本應(yīng)特別指出,純化重組人干擾素-V(rIFN-V)的方法通常

11、是通過提取包含體,然后進(jìn)行分離、純化,再經(jīng)透析或稀釋使之恢復(fù)生物學(xué)活性。但這種方法活性回收率低,操作時(shí)間長,而且純化效率也較低。利用HPHIC法可直接將rIFN-V的鹽酸胍破碎菌體提取液進(jìn)行HPHIC分離。一步純化就使rIFN-V的純度達(dá)到85%以上,比活達(dá)5. 71010IU /g,其活性回收率是通常方法的23倍。以往從血清中分離、純化鐵傳遞蛋白的方法包括多步色譜分離,并需數(shù)日才能完成。V ieira等利用HPHIC對雞血清進(jìn)行一步純化獲得鐵傳遞蛋白(transferrin)取得較好的結(jié)果,一次可以從3mL血清中純化得到12mg(80% )的鐵傳遞蛋白,而這一工作僅需幾小時(shí)就可完成。由此看來

12、,用HPHIC進(jìn)行生化分離、純化,不僅活性回收率高,而且操作步驟也簡化了許多。添加文本將HPHIC作為一個(gè)有效的工具用于脲或胍等變性蛋白質(zhì)的復(fù)性取得了成功。將鹽酸胍變性的牛血清蛋白(BSA )、溶菌酶(Lys)、核糖核酸酶(RNase)混合蛋白質(zhì)通過HPHIC柱,能在30m in內(nèi)獲得除去變性劑、分離和完全復(fù)性三重功效。鹽酸胍變性的T淀粉酶(Amy)也能得到部分復(fù)性。在上述的rIFN-V的制備中,HPHIC也能使鹽酸胍變性的rIFN-V完全復(fù)性。2、HPH IC用于變性蛋白質(zhì)的復(fù)性用于變性蛋白質(zhì)的復(fù)性添加文本HPHIC對變性蛋白可以起到分離和復(fù)性雙重作用,但對于那些不能用HPHIC完全復(fù)性的變

13、性蛋白,如脲變T-Amy,用HPHIC則可進(jìn)行變性T-Amy的折疊中間體分離及蛋白質(zhì)變性機(jī)理的研究。Bai等對此做了大量的工作,結(jié)果表明,鹽酸胍和脲使T-Amy的變性機(jī)理及在疏水界面上折疊形成的中間體數(shù)目均不相同,脲變T-Amy折疊中間體的疏水性大小接近于連續(xù),中間體的數(shù)目隨色譜條件的不同可能是變化的。3、HPH IC用于蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究用于蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究添加文本4、HPH IC用于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的研究用于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的研究根據(jù)HPHIC中的SDM -R, lgk對lgH2O作圖得到的斜率Z表示1mol溶質(zhì)被固定相吸附時(shí)從溶質(zhì)與固定相間被置換的水的摩爾數(shù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)構(gòu)象一定時(shí)

14、,同一溶質(zhì)的Z值通常為一常數(shù)。但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí),從溶質(zhì)與固定相間被置換的水的摩爾數(shù)就會(huì)發(fā)生變化,即Z值改變。因此Z值可作為表征蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的參數(shù)。目前在HP-HPLC中利用Z值來研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化已引起國際上的普遍關(guān)注12, 5456。在HPHIC中,由于蛋白分子不像在RP-HPLC中那樣幾乎完全處于變性狀態(tài),而是疏水區(qū)域不斷的收縮與擴(kuò)張引起某些局部構(gòu)象的變化,其Z值變化情況就要復(fù)雜得多,因此研究HPHIC中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化所引起的Z值變化對于捕捉蛋白分子構(gòu)象變化的中間過程信息有著深遠(yuǎn)的意義。添加文本展望展望HPHIC的出現(xiàn)和發(fā)展雖然只經(jīng)過了一個(gè)較短的時(shí)間,但它在生物大分子分離、純化方面的優(yōu)越性已十分