DB53∕T 1064.3-2021 綠孔雀檢疫技術(shù) 第3部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范

1、ICS 11.22053CCS B 41云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 1064.32021綠孔雀檢疫技術(shù) 第 3 部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范Quarantine technique for Pavo muticusPart 3:Technical specifications for laboratory examination of chewing lice2021 - 09 - 30 發(fā)布2021 - 10 - 14 實(shí)施云南省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布學(xué)兔兔 標(biāo)準(zhǔn)下載DB53/T 1064.32021目次前言III引言1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 縮略語15 原理16 試驗(yàn)

2、條件26.1 實(shí)驗(yàn)室通用要求26.2 人員要求27 儀器設(shè)備和試劑27.1 儀器設(shè)備27.2 試劑28 樣品28.1 樣品采集28.2 樣本保存38.3 樣品運(yùn)輸38.4 生物安全要求39 試驗(yàn)步驟39.1 形態(tài)學(xué)檢查39.2 PCR 檢測310 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理410.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果判定410.2 PCR 結(jié)果判定4附錄 A（規(guī)范性） 羽虱形態(tài)5附錄 B（規(guī)范性） PCR 反應(yīng)6IDB53/T 1064.32021前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件是DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術(shù)的第3部分。DB53/T 1064已經(jīng)

3、發(fā)布了以下部分：第 1 部分：禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范；第 2 部分：禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范；第 3 部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范；第 4 部分：消化道線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。 本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（YNTC02）歸口。本文件主要起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院、云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所、昆明動物園。 本文件主要起草人：鄒豐才、黃艷梅、宋海洋、朱勛程、楊建發(fā)、李杰、陳培富、蒙英雯、衡昭君、張譽(yù)方、朱尤帥、李云喬。IIIDB53/T 1

4、064.32021引言綠孔雀（Pavo muticus）在我國僅分布于云南，是國家級重點(diǎn)保護(hù)野生動物，也是全球?yàn)l危物種， 并已列入瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)和世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄。為切實(shí)貫徹中華人民共和國野生動物保護(hù)法和中華人民共和國動物防疫法，編制并發(fā)布DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術(shù)地方標(biāo)準(zhǔn)，可讓從事綠孔雀保護(hù)的相關(guān)人員按標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化程序開展綠孔雀病原學(xué)診斷，從而采取必要的防治措施，以提高染疫綠孔雀的成活率，維護(hù)綠孔雀種群健康和地區(qū)生態(tài)平衡， 提升生物多樣性保護(hù)成效。本文件已發(fā)布4個部分：第 1 部分：禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室

5、檢測技術(shù)的總則、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 2 部分：禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的總則、禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方 面制定了規(guī)范；第 3 部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測的原理、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 4 部分：消化道線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從消化道線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的試驗(yàn)原理、常見線蟲形態(tài)特征、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范。DB53/T 106

6、4.32021綠孔雀檢疫技術(shù)第 3 部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范1 范圍本文件規(guī)定了綠孔雀（Pavomuticus）檢疫技術(shù)中羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的原理、試驗(yàn)條件、儀器設(shè) 備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。本文件適用于綠孔雀檢疫技術(shù)中羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求GB/T 27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 動物檢疫3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羽虱c

7、hewing lice羽虱是主要寄生在鳥類體表和少數(shù)寄生于哺乳動物的永久性體表寄生蟲，隸屬于昆蟲綱（Insecta）、 有翅亞綱（Pterygota）、虱目（Phthiraptera）、長角羽虱科（Philopteridae）。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。BLAST：基于局部序列比對算法的搜索工具 Basic Local Alignment Search Tool bp：堿基對 Base PairddH2O： 雙 蒸 水 Double Distilled Water DNA：脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic AcidNCBI：美國國家生物技術(shù)信息中心 National Ce

8、nter for Biotechnology Information PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain ReactionTAE：Tris-乙酸電泳緩沖液 Tris Acetate-EDTA Buffer5 原理根據(jù)羽虱的形態(tài)特征，采用顯微鏡鏡檢方法，判定是否有羽虱感染，對于蟲卵、若蟲、存疑蟲體及 殘破蟲體無法確定其種類，可進(jìn)行PCR鑒定。1DB53/T 1064.320216 試驗(yàn)條件6.1 實(shí)驗(yàn)室通用要求實(shí)驗(yàn)室滿足GB 19489中生物安全實(shí)驗(yàn)室的要求。6.2 人員要求采樣和試驗(yàn)人員應(yīng)具有相應(yīng)的專業(yè)知識。7 儀器設(shè)備和試劑7.1 儀器設(shè)備7.1.1 體視顯微鏡。7.2

9、.2 載玻片、培養(yǎng)皿、離心管、樣品管。7.2.3 PCR儀。7.2.4 微量移液器：單道可調(diào)，量程0.5 µL10 µL、2 µL20 µL、10 µL100 µL和100 µL 1 000 µL。7.2.5 電子天平：量程0.01 mg10 000 mg。7.2.6恒溫水浴鍋：36 ±1 ，65 ±1 。7.2.7 高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)12 000 r/min。7.2.8 電泳系統(tǒng)。7.2.9 微波爐。7.2.10 凝膠成像系統(tǒng)。7.2 試劑7.2.1 50×TAE緩沖液：Tris堿

10、242 g和57.1 mL冰醋酸，用雙蒸水定容到1 L。7.2.2 核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。7.2.3 2×Taq PCR Mix。7.2.4 引物（基于COI基因設(shè)計引物）。7.2.5 霍氏液。7.2.6 乙酸乙酯。7.2.7 70%乙醇。7.2.8 商品化DNA提取試劑盒。7.2.9 DL 2000 DNA Marker。7.2.10 瓊脂糖。1.5%瓊脂糖凝膠：1.5 g瓊脂糖與100 mL 1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，加入10 µL 核酸染料，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。8 樣品8.1 樣品采集2

11、DB53/T 1064.32021在體表皮膚、毛根、羽毛處找到淡黃色或暗灰色的虱體或蟲卵，收集放入樣品管中，做好記錄。剛 死亡綠孔雀可將其放入有乙酸乙酯的密閉容器中，熏蒸5min后，用手逆向撥動羽毛，羽虱掉落,將羽虱收集放入樣品管。8.2 樣本保存將羽虱樣本保存于70%乙醇內(nèi)，擰緊蓋子后上下?lián)u晃使虱體充分浸泡在70%乙醇中，并檢查是否有液 體滲漏。低溫或置于4 冰箱儲存。8.3 樣品運(yùn)輸樣品采集完成后運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。70%的乙醇屬于危險化學(xué)品，運(yùn)輸過程中要確保容器不泄漏、不損壞。不應(yīng)與酸類、易燃物、自燃物品等并車混運(yùn)。8.4 生物安全要求樣品采集及試驗(yàn)過程中做好自身防護(hù)，同時注意對綠孔雀

12、的生活環(huán)境進(jìn)行清掃、環(huán)境消毒。生物安 全要求按照GB/T 27401的規(guī)定進(jìn)行。9 試驗(yàn)步驟9.1 形態(tài)學(xué)檢查9.1.1 直接觀察法按下列區(qū)域順序?qū)G孔雀進(jìn)行檢查：翅(下側(cè))、腹側(cè)、腹部、臀部(下側(cè))、胸部、翅(上側(cè))、背部、 臀部(上側(cè))、頸部、頭部。觀察是否有羽虱。9.1.2 顯微鏡檢查將樣品管內(nèi)保存的羽虱放在透明培養(yǎng)皿或載玻片上，用清水清洗干凈蟲體，滴加霍氏液固定，蓋上 蓋玻片。對比附錄A中的圖A.1，用體視顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。9.2 PCR 檢測9.2.1 樣品 DNA 提取與保存將8.1收集的羽虱樣品用商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)。DNA提取具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，將提

13、好的DNA保存于4 冰箱中。9.2.2 PCR 擴(kuò)增9.2.2.1 PCR 擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增引物見附錄B中的B.1。9.2.2.2 PCR 擴(kuò)增體系PCR擴(kuò)增體系見附錄B中的B.2。9.2.2.3 PCR 擴(kuò)增程序3DB53/T 1064.32021樣品DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5 預(yù)變性3min，95 變性1min，50 退火45s，72 延伸1.5min，30個循環(huán)后，72 延伸10min。9.2.3 PCR 產(chǎn)物檢測PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5 µL，加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳孔中，以DL 2000 DNA Marker作為參照，110 V電壓電泳30

14、min后，將凝膠置于紫外凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行觀察拍照，若出現(xiàn)預(yù)期的475 bp 左右的條帶，擴(kuò)增條帶進(jìn)行測序后驗(yàn)證。10 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理10.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果判定羽虱體型較小，長 0.5 mm10 mm，頭部形狀多變，類似于三角形或卵圓形，頭端的寬度大于胸部， 觸角一對，口器位于頭腹面，咀嚼式。胸部三節(jié)，無翅，三對足分別位于前、中、后胸。腹部圓形至長卵圓形，體型寬短或細(xì)長，呈淡黃色或灰色。用顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)形態(tài)符合附錄 A 中圖 A.1 羽虱形態(tài)特征，則鑒定為綠孔雀羽虱。10.2 PCR 結(jié)果判定將 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果與 NCBI GenBank 中的序列進(jìn)行 BLAST 在線比對，與羽虱相應(yīng)序列匹配率不小于 90%時即可判定綠孔雀羽虱感染陽性。4DB53/T 1064.32021附錄A（規(guī)范性） 羽虱形態(tài)體視顯微鏡下羽虱形態(tài)如圖A.1所示。圖 A.1 羽虱鏡檢圖（×40）5DB53/T 1064.32021附錄B（規(guī)范性） PCR 反應(yīng)B.1 PCR擴(kuò)增引物序列根據(jù)COI基因設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，引物序列如下表B.1所示。表 B.1PCR 擴(kuò)增引物序列引物名稱序