RT-PCR_步驟(精)

1、、組織抽提:1.取組織塊 50-100 啞用液氮在研缽中研磨成粉末2.移入玻璃勻漿器加入 1ml Trizol抽打勻漿3.移入 1.5ml 新離心管用 5 ml 針頭抽打4.冰上 5 分鐘5.離心 12,000g 4C5 分鐘取上清液移入 1.5ml 新離心管6.加 0.2 ml 氯仿，震蕩，冰上 5 分鐘7.離心12,000g 4C10 分鐘取上層液相移入 1.5ml 新離心管8.加 0.5 ml 異丙醇，震蕩，冰上孵育 5 分鐘9.離心12,000g 4C5 分鐘棄去上清液10.加入 1 ml 75%乙醇，震蕩11.離心7,500g 4C5 分鐘 棄去上清液12.室溫下使之變透明13.加入

2、 DEP（處理水 10 卩 l -35 卩 l 溶解 RNA（可保存在液氮或低溫冰箱）14.走 RNA 變性電泳觀察 18s, 28s 條帶，分光光度計(jì)檢測(cè) 260/280 吸光度比值，計(jì)算 RNA 濃度、RT 反應(yīng)體系（第一步）：約 20 分鐘RNA 抽提物5 卩 lRadome 引物2 卩 lRNA sin0.5 卩 l1.65T15 分鐘 2.立即放入冰浴RT 反應(yīng)體系（第二步）：約 2 小時(shí)RNA sin0.5 i l10mM dNTP1 卩 l5XRT 緩沖液4 卩 l25mM MgC24 卩 lAMV 逆轉(zhuǎn)錄酶3 卩 l1.37T1.5 小時(shí) 2.94C5-10 分鐘 3.反應(yīng)物保

3、存于-20C或進(jìn)行 PCR三 1、PCF 反應(yīng)體系：約 4.5 小時(shí)25mM MgC22 卩 l10XPCR 緩沖液5 卩 l10mM dNTP1 卩 l上下游引物 10pmol/卩 l2.5 卩 lX2CDNA 模板2.5 卩 lddHO34 卩 lTaq 酶0.5 卩 l輕質(zhì)石蠟油50 卩 l100 卩 l1.94C2 分鐘，55C1 分鐘，72C2 分鐘 為第一個(gè)步 1 個(gè)循環(huán)2.94T45 秒，55E40 秒，72C1 分鐘 為第二步 30 個(gè)循環(huán)3.72C10 分鐘 4. 取出后 4C5 分鐘后-20C保存或走電泳2、PCF 反應(yīng)體系：約 5 小時(shí)25mM MgC23 卩 l10XP

4、CR 緩沖液5 卩 l10mM dNTP1 卩 l上下游引物 10pmol/卩 l2.5 卩 lX2CDNA 模板5 卩 lddHO30 卩 lTaq 酶1 卩 l輕質(zhì)石蠟油50 卩 l100 卩 l1.94T2 分鐘，55r1 分鐘，72r2 分鐘 為第一個(gè)步 1 個(gè)循環(huán)2.94r45 秒，50r40 秒，72E1 分鐘 為第二步 40 個(gè)循環(huán)3.72r10 分鐘 4. 取出后 4r5 分鐘后-20r保存或走電泳四、電泳：約 1.25 小時(shí)1. 配 0.5XTBE 電泳緩沖液 300 m2 膠濃度 1.7% （40ml 0.5XTBE 力卩 0.68g 膠）3.微波爐中火 2 分鐘溶解膠 4

5、.冷卻至 60r加入溴乙錠 2 卩 l （10mg/ml 的終濃度 0.5 卩 g/ml ）5.放入梳子，澆板，待凝固 6.加 8 卩 l PCR 反應(yīng)產(chǎn)物+2 卩 l 溴酚蘭 7.電泳 50-80V （每cm5V）一、實(shí)驗(yàn)器具與材料：1、移液槍：1ml、200 卩、20 小 10 卩、12 丨2、吸頭：1ml、200 卩、20 ii l 3、勻漿管：5ml 4、吸頭臺(tái)：放置 1ml 吸頭的一個(gè)，放置 20i吸頭的一個(gè)5、EP 管：1.5ml、0.2ml、100il 6 試劑瓶：2 個(gè) 60ml 的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）1 個(gè) 125ml 的白色試劑瓶（放無水乙醇）7、 量筒：50ml、25

6、0ml、500ml8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、 試管架：5ml、1.5ml、20il10、 鹽水瓶：250ml、500ml 各 2 個(gè)備用，一個(gè)裝無水乙醇，另一個(gè)裝DEPC 水11、 鋁制飯盒：4 個(gè)12、 塑料小飯盒：1 個(gè)13、 大瓷缸：2 個(gè)14、 錫泊紙：一卷15、 卷紙：2 卷16、 三角燒瓶：帶蓋，稍大二、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備1、 塑料制品：（包括槍頭、EP 管、勻漿管等）先將 DEPC 水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC 水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次（EP 管）2、 玻璃

7、制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC 水泡）（洗凈后先泡1%o DEPC 過夜，再烤干）3、 勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC ）三、試劑配制：1、 DEPC 水：吸岀 1ml 放在 1000ml 雙蒸水中配成 1%o DEPC 水，放在 1000ml 容量瓶中靜置 4 小時(shí)備用。2、 75%乙醇：用無水乙醇 DEPC 水配，然后放-20C保存（其中 DEPC 水需先高壓）3、 異丙醇：放入棕色瓶中4、 氯仿：放入棕色瓶中5、 瓊脂糖四、幾種緩沖液的配制：1、電泳緩沖液：Tris 54g 硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml ?pH8.0蒸溜水

8、 1000ml5XTBE （貯存液）再將 5XTBE 稀釋 10 倍成 0.5TBE 就可以在電泳時(shí)使用（即工作液濃度），如取 50ml 貯存液 450ml 水-500ml 工作緩沖液2、上樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)0.25%二甲苯青 FF30%甘油6 瀕沖液，4C保存五、瓊脂糖凝膠的配制：1、1.0% :1.0g 瓊脂糖 100ml 電泳緩沖液，微波爐中火 30 秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60C時(shí)加入 10mg/ml 溴化乙錠 2.5 卩,1 充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min 后現(xiàn)進(jìn)行電泳。2、1.5%:同上，將瓊脂糖的量改為1.5g六、需購置的

9、Rt-PCRRt-PCR 材料：(生工.Tel. 2236106.)Taq 酶(含 MgCl2 Buffer )200u 70.00dNTP: 1 支oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promegaM-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer)RNasi n: 1 支 110-20 CDEPC 5g 110.00Trizol 100ml/1 瓶 In vitroge n Life tech no logies-4CMarker: 10 卩 g 0.2 卩 g/ml 150 科威(1543. 994. 697. 515. 377. 231 )七、引物合成正義：

10、5 -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3反義：5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-32、 par-4:正義：5-GGGACCTCGGAACTCAAC- 3反義：5-TGTATCTGCCTGGGACTG- 33、 退火溫度計(jì)算2 (A T )4 ( G C)2、上樣緩沖液:正反義平均數(shù)，再上下波動(dòng)度(蟲C，或5C)4、引物各合成 5 OD，每 0D 瓶分裝好5、引物稀釋：加 DEPC 水量為（卩=? nmol / OD管上所標(biāo) 0D 數(shù) X100是為 10p mol /卩濃度的引物溶液八、PCRPCR 產(chǎn)物電泳先將 1-10 卩左右 PCR 產(chǎn)物，加已點(diǎn)在紙上

11、的溴酸蘭，反復(fù)吸打混勻后進(jìn)行電泳，一般電流為10mA，電源 100V，電泳 30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結(jié)果掃描打印。九、幾個(gè)注意點(diǎn)：1、 逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴？2、 Rt 時(shí)，先打開 PCR 預(yù)熱 30 分鐘。3、 RNA 抽提前，打開離心機(jī)預(yù)冷。TRIzolTRIzol 法抽提總 RNARNA細(xì)胞 1X107組織 100mg加 1mlTRIzol細(xì)胞用 1ml 加樣器吹至液體澄清且無細(xì)胞團(tuán)塊勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至 EP 管）（組織勻漿量100mg 時(shí)分裝 1ml/每 EP 管）顛倒混勻 10 下，室溫 5 分鐘加氯仿 1/5 體積（0.2ml）（必須按總體積的 1/5）顛倒混勻 1

12、0 下，室溫 5 分鐘4C,離心 12000g，15 分鐘轉(zhuǎn)上層水相（約 400 門 于另一 1.5mlEP 管中加等體積異丙醇（約400 卩l(xiāng),混勻室溫 10 分鐘4C,離心 12000g, 10 分鐘J棄上清J加冰預(yù)冷的 75%乙醇（用 DEPC 水配）1mlJ4C離心 7500g , 5 分鐘J棄上清，空氣干燥 5-10 分鐘（不能完全干燥）J溶于 DEPC 水中至 20 卩 1（ 10 卩-20 卩）（可在 55-60C水中，10 分鐘助溶）注：1、 RNA 若用于核酸轉(zhuǎn)移應(yīng)溶解于樣本緩沖液中，否則DEPC 溶解2、細(xì)胞組織加 TRIzol 勻漿后，可在-60C放置至少一個(gè)月（甚至可一

13、年以上）3、 RNA 在 75%乙醇中，2-8C至少可保存一周，-20C至少可保存一年兩步法 RT-PCR（第一步：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）試劑濃度體積終濃度RNA 23 卩 l（11.5 卩 l）Oligo（dT）15 0.05 卩 g/ 卩 l 4 卩 l（2 卩 l） 0.005 卩 g/ 卩 l（稀釋 10 倍后用）J混勻，離心，70C5minJ立即冰水浴，稍離心J試劑濃度體積終濃度M-MLV Buffer 5X8 卩 l （4 卩 l） 1XdNTP 10mM 2 卩 l （1 卩 l） 0.5mMRNasin 40U/ 卩 l 1 卩 l （0.5 卩 l） 20 卩M- MLV 200U/

14、卩 l 2 卩 l （1 卩 I） 200U總體積 40 卩 1（ 20 卩）J混勻，離心，42C60minJ95C10min （破壞 MLV ）J4C保存兩步法 RT-PCR（第二步：PCR 反應(yīng)）總體積 20 卩 1（50 卩 I）試劑濃度體積終濃度Taq Buffer 10 x2卩I （5卩l(xiāng)_） 1xMgCI2 25mM 1.2卩l(xiāng) （3卩l(xiāng)） 1.5mMdNTP 10mM 0.2卩l(xiāng) （0.5卩l(xiāng)） g，4C離心，15min。5.吸上層無色水相，移入另一EP 管中（約 0.5ml ）。6.加等體積異丙醇，-20C，30min。7.12000 ，4C離心，10min。在管底部可見微量

15、RNA 沉淀8.棄上清，加 75 %乙醇 1ml，振蕩。9.7500 g，4C離心，10min。10. 棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5- 10min。11. 沉淀溶于 20 卩 l DEPC 水，取 1 卩加入 79 卩 l DEPC 水測(cè) 0D260/0D28012. 計(jì)算濃度與純度，70C保存。OD26 40X 稀釋倍數(shù)RNA 濃度（11 g/kl-1000逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA反應(yīng)體系如下MgCl22110XRT Buffer1 卩1RNase Free dH2O3.75卩1dNTP Mixture(各 10mM)1 卩1RNase Inhibitor0.25卩1AMV Reverse Transcriptase0.5 卩1Random 9 mers0.5 卩1Positive Control RNA (11g)111混勻快速離心一次反應(yīng)條件如下30C10min42C30min99C5min5C5min-20 C 冰箱凍存PCR 反應(yīng)摸板 cDNA2.5 口15PCR Buffer