ELISA檢測(cè)乙肝抗體

1、ELISA檢測(cè)乙肝抗體 專業(yè)：麻醉K-1 姓名：李凱鵬 學(xué)號(hào)：1420550146實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握ELISA的原理和操作方。2.熟悉酶標(biāo)準(zhǔn)儀的使用方法。實(shí)驗(yàn)原理 【基本原理】 1、抗原或抗體吸附到固相載體的表面，仍保持其免疫活性。 2、抗體或抗原與酶相結(jié)合所形成的免疫復(fù)合物既保持其免疫活性同時(shí)又保持酶的催化活性。 3、酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，可催化底物水解，氧化或還原，從而產(chǎn)生有色的物質(zhì)。 反應(yīng)顯色的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量呈比例關(guān)系，抗原或抗體吸附到固相載體表面后，以及抗原抗體與酶鏈接后，仞 保持免疫活性和酶活性，當(dāng)酶遇到相應(yīng)底物時(shí)，在酶的催化作用下底物水解顯色

2、。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢測(cè)物質(zhì)的量直接相關(guān)，故跟據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。(三)試劑器材 1.試劑 (1)包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液): NaCO1.59克 NaHCO 2.93克 加蒸餾水至1000ml (2)洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO12H2O2.9克 NaCl8.0克 KCl0.2克 Tween-200.050.5ml 加蒸餾水至1000ml (3)稀釋液： 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510使用。 (4)終止液(2MHSO）： 蒸餾水1

3、78.3ml，逐滴加入濃硫酸(98)21.7ml。 (5)底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸): 0.2M NaHPO(28.4克L) 25.7ml 0.1Ma 檸檬酸(19.2克L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。 方法一用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110gml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔

4、)。 3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育0.51小時(shí)，洗滌。 4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，371030分鐘。 5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。 方法二用于檢測(cè)未知抗

5、體的間接法： 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110gml， 每孔加0.1ml，4過夜。次日洗滌3次。 加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔 中,置37孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照) 于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml， 37孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。 其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6方法一用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110gml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次

6、3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育0.51小時(shí)，洗滌。 4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，371030分鐘。 5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢

7、測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。 注意事項(xiàng)1樣品稀釋 一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。2試劑盒平衡 Elisa中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25)，一般需在室溫放置2030分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37溫箱20分鐘。 3樣品和試劑的混勻 在稀釋前、后的樣品必須

8、充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。 4加樣 加樣是一項(xiàng)很重要的步驟。加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。5溫育 溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。6洗板 固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。 7顯色 顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說明操作即可