實驗四 感受態(tài)細胞的制備

1、分子生物學實驗分子生物學實驗實驗四大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備分子生物學實驗分子生物學實驗v1 1、掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備原理。掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備原理。v2 2、學習學習CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法和技術(shù)。的方法和技術(shù)。分子生物學實驗分子生物學實驗實驗原理實驗原理1、感受態(tài)細胞制備原理：、感受態(tài)細胞制備原理：受體細胞經(jīng)過一些特受體細胞經(jīng)過一些特殊方法殊方法(如電擊法、如電擊法、CaCl2、RbCl等化學試劑法等化學試劑法)處處理后，理后，細菌會膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生細菌會膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變了暫時性的改變，成為允許

2、外源成為允許外源DNA分子進入的分子進入的感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞(Compenent cells)。u（Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域）分子生物學實驗分子生物學實驗2、感受態(tài)轉(zhuǎn)化原理：、感受態(tài)轉(zhuǎn)化原理：細菌處于細菌處于0的的CaCl2低滲溶低滲溶液中，細胞膜的通透性發(fā)生變化，同時轉(zhuǎn)化混合液中，細胞膜的通透性發(fā)生變化，同時轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒物中的質(zhì)粒DNA會形成抗會形成抗DNase的羥基的羥基-鈣磷酸復鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經(jīng)過

3、合物黏附于細胞表面，經(jīng)過42短時間的熱激處短時間的熱激處理，促進感受態(tài)細胞吸收理，促進感受態(tài)細胞吸收DNA復合物，在培養(yǎng)液復合物，在培養(yǎng)液中生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在中生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。實驗儀器實驗儀器超凈工作臺超凈工作臺離心設(shè)備離心設(shè)備臺式高速冷凍離心機臺式高速冷凍離心機制冰機制冰機分子生物學實驗分子生物學實驗1、實驗材料：、實驗材料：E. coli JM109。2、實驗試劑：、實驗試劑：(1)LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物，酵母提取物 5 g，NaC

4、l 10 g，加雙蒸水至總體積，加雙蒸水至總體積1L，高壓下蒸氣滅菌。，高壓下蒸氣滅菌。(2) 0.1mol/L CaCl2溶液：稱取溶液：稱取1.1098g CaCl2(無水無水,分析純分析純)，溶于溶于90mL重蒸水中，定容至重蒸水中，定容至100mL，高壓滅菌。，高壓滅菌。(3) 30%甘油：量取甘油：量取30mL甘油，加入甘油，加入70 mL雙蒸水，雙蒸水， 混勻，混勻，定容至定容至100mL ，高壓滅菌。，高壓滅菌。分子生物學實驗分子生物學實驗1. 菌體的培養(yǎng)菌體的培養(yǎng)(事先已做事先已做) 受體菌的培養(yǎng)受體菌的培養(yǎng)從從 LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli JM10

5、9單菌落單菌落，接種于接種于35 mL LB液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)下振蕩培養(yǎng) 12 hr 左右左右，直至對數(shù)生長直至對數(shù)生長后后期。期。 將該菌懸液以將該菌懸液以 1: 1001: 50 的比例接種于的比例接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)23 hr，至至OD600為為0.30.4。分子生物學實驗分子生物學實驗 取取2個個1.5mL離心管離心管，分別，分別轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入1mL菌菌液液，4 12000 rpm，離心離心2 min。 棄去上清棄去上清，每管加入，每管加入1mL預冷的預冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶溶液液，懸浮細胞懸浮細胞，冰上放

6、置冰上放置 30 min。 4 ，12000 rpm，離心離心2 min。 棄去上清棄去上清，每管，每管加入加入50L預冷預冷的的0.1 mol/LCaCl2 溶溶液液，輕輕緩緩懸浮細胞懸浮細胞,50L預冷的預冷的30%甘油甘油，冰上放置冰上放置5 min，即即為為感受態(tài)細胞懸液。感受態(tài)細胞懸液。 將將感受態(tài)細胞懸液感受態(tài)細胞懸液，放置于，放置于-80，可保存半年?？杀４姘肽?。2. 感受態(tài)細胞的制備感受態(tài)細胞的制備 (CaCl2 法，超凈臺內(nèi)法，超凈臺內(nèi))分子生物學實驗分子生物學實驗第二天，第二天， CaCl2 法法前一天晚上，前一天晚上，第二天早上第二天早上分子生物學實驗分子生物學實驗結(jié)果分

7、子生物學實驗分子生物學實驗注意事項1.1.細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于的培養(yǎng)菌，最好從的培養(yǎng)菌，最好從-80-80甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。用于制備感受態(tài)細胞的菌液。2.2.細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為宜，可通過監(jiān)細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為宜，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的測培養(yǎng)液的ODOD600600來控制。來控制。JM109JM109菌株的菌株的ODOD600600為為0.30.30.40.4密度比較合適，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。密度比較合適，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。3.3.實驗操作時要格外小心，懸浮細胞時要輕柔，以免造實驗操作時要格外小心，懸浮細胞時要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。4.4.實驗過程中要注意無菌操作，