王鏡巖-生物化學(xué)I-第12章核酸通論—第13章核酸的結(jié)構(gòu)匯總

1、第12章 核酸通論 年Miescher博士論文工作中測(cè)定淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組成時(shí), 發(fā)現(xiàn)了不溶于稀酸和鹽溶液的沉淀物, 并在所有細(xì)胞的核里都找到了此物質(zhì), 故命名核質(zhì)核質(zhì)(Nuclein)。一、核酸研究簡(jiǎn)史一、核酸研究簡(jiǎn)史年Kossel經(jīng)過(guò)10年的努力, 搞清楚核質(zhì)中有四種不同的組成部分: A,T, C和G。年Altman建議將核質(zhì)改名為“核核酸酸”, 并且已經(jīng)認(rèn)識(shí)到“核質(zhì)” 乃“核酸” 與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。年Levene發(fā)現(xiàn)酵母的核酸含有核糖。 年Levene發(fā)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的核酸含有一種特殊的核糖即脫氧核糖, 得出了一個(gè)錯(cuò)誤概念: 植物核酸含核糖,動(dòng)物核酸含脫氧核糖。這個(gè)錯(cuò)誤概念一直延續(xù)到1938年

2、，這時(shí)方清楚RNA和DNA的區(qū)別。Levene還提出了核酸的“磷酸-核糖(堿基)-磷酸”的骨架結(jié)構(gòu), 解決了DNA分子的線性問(wèn)題, 還在1935年提出“四核苷酸”學(xué)說(shuō), 認(rèn)為這四種核苷酸的聚合體是構(gòu)成核酸的基本單位。 1944 1944年Avery重做1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，證明DNA是遺傳物質(zhì)。 1952 1952年Hershey & Chase的噬菌體感染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明DNA是遺傳物質(zhì)。年Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用紙層析法仔細(xì)分析了DNA的組成成分, 得知A=T, G=C, A+G=C+T年Watson, Crick根據(jù)DNA的X射線圖

3、譜的研究結(jié)果, 提出了DNA的雙螺旋模型(Double helix)。幾星期后提出了半保留式復(fù)制模型。 年Meselson Stahl用密度梯度超離心法, 證實(shí)半保留復(fù)制假說(shuō)。年Kornberg得到高純度的DNA polymerase, 這種酶需要一個(gè)模板DNA。年Cairns拍攝了復(fù)制中的細(xì)菌DNA的電鏡照片。年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)DNA限制性內(nèi)切酶。年建立DNA重組技術(shù)。年建立DNA的雙脫氧測(cè)序法。年開(kāi)始實(shí)施人類基因組計(jì)劃。 2003 2003年人類基因組計(jì)劃宣告完成測(cè)序任務(wù)。二、核酸的生物功能 (一) DNA是主要的遺傳物質(zhì) 1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1944 1944年Avery

4、重做1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，證明DNA是遺傳物質(zhì)。但人們對(duì)此持懷疑態(tài)度，理由是： （1）因認(rèn)為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二十種氨基酸的排列組合將是個(gè)天文數(shù)字，可作為一種遺傳信息。而DNA相對(duì)分子質(zhì)量小，只含4種不同的堿基，人們一度認(rèn)為不同種的有機(jī)體的核酸只有微小的差異。 （2）認(rèn)為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中DNA并未能提得很純，還附有其它物質(zhì)。 （3）即使轉(zhuǎn)化因子確實(shí)是DNA，但也可能DNA只是對(duì)莢膜形成起著直接的化學(xué)效應(yīng)，而不是充當(dāng)遺傳信息的載體。1952年Hershey and Chase的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明DNA是遺傳物質(zhì)物種基因組基因數(shù)目物種基因組基因數(shù)目MS2噬菌體 3.6 kb4

5、裂殖非洲粟酒酵20 Mbp6,000Q噬菌體 4.2 kb3盤基網(wǎng)柄菌47 Mbp7,000SV405.2 kbp8秀麗隱桿線蟲(chóng)100 Mbp19,100X1745.4 kbp9擬南芥70 Mbp25,500TMV 6.4 kb4水稻(秈稻)74. 8 Mbp46,02255,615HIV 9.3 kb10黑腹果蠅165 Mbp13,000腺病毒235.9 kbp11河豚魚(yú)400 Mbp70,000噬菌體48.5kbp50擔(dān)尼魚(yú)1.9 Gbp70,000T4噬菌體169 kbp300非洲爪蟾2.9 Gbp70,000大腸桿菌4.64 Mbp4,288小鼠3.3 Gbp70,000釀酒酵母13.

6、5 Mbp5,885人3.3 Gbp31,000(二) DNA和基因組1.DNA和基因組 DNA分子中最小的功能單位稱作基因，為RNA或蛋白質(zhì)編碼的基因稱結(jié)構(gòu)基因，只有調(diào)節(jié)功能，不轉(zhuǎn)錄生成RNA的稱調(diào)節(jié)基因，某生物體所含的全部基因稱該生物體的基因組。2.原核生物基因組的特點(diǎn) 通常只有一個(gè)DNA分子；無(wú)重復(fù)序列；功能相關(guān)的基因常構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位；有重疊基因。3.真核生物基因組的特點(diǎn) （1）有重復(fù)序列，中度重復(fù)序列可重復(fù)幾十次到幾千次，如rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白質(zhì)的基因；高度重復(fù)序列可重復(fù)數(shù)百萬(wàn)次，如衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。 （2）有斷裂基因，不少基因含有稱作內(nèi)含子的非編碼區(qū)，編碼區(qū)

7、稱作外顯子，有些基因可含有幾十個(gè)內(nèi)含子。雞卵清蛋白的基因人類基因組序列的類型長(zhǎng)分散元件（長(zhǎng)分散元件（6-8kb，約，約85萬(wàn)個(gè)）萬(wàn)個(gè)）短分散元件（短分散元件（0.1-0.3kb，約，約150萬(wàn)萬(wàn)個(gè)，其中個(gè)，其中Alu元件元件超過(guò)超過(guò)100萬(wàn)個(gè)）萬(wàn)個(gè)）簡(jiǎn)單序簡(jiǎn)單序列重復(fù)列重復(fù)大片段重復(fù)大片段重復(fù)(二) RNA功能的多樣性1.某些病毒的遺傳物質(zhì);2.控制蛋白質(zhì)的合成;3.遺傳信息的加工;4.基因表達(dá)和細(xì)胞功能的調(diào)控;5.催化功能;6.在細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育中發(fā)揮重要作用;7.在生命起源中可能有重要作用?；疽?.熟悉核酸的發(fā)現(xiàn)和研究簡(jiǎn)史。2.掌握核酸的種類、分布和生物功能。（重點(diǎn)）第13章 核酸的

8、結(jié)構(gòu) 一、核苷酸 核酸可以水解成核苷酸，核苷酸可以水解成磷酸和核苷，核苷可以水解成戊糖和堿基，堿基可以分成多種類型。 (一) 堿基 與氨基酸一樣，堿基在細(xì)胞中也受到各種各樣的修飾，其產(chǎn)物常常扮演信號(hào)傳導(dǎo)信使分子、營(yíng)養(yǎng)因子、輔酶等角色，并對(duì)核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著重要作用.內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺內(nèi)酰亞胺內(nèi)酰亞胺(二) 核苷 (三) 核苷酸二、核酸的共價(jià)結(jié)構(gòu) (一)核酸中核苷酸的連接方式 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)：核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)：核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)：核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)：核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)：核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)：核酸的結(jié)構(gòu)層次核酸的結(jié)構(gòu)層次(二) DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)(三) RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)ACTG三、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) (一) DNA堿基組成的

9、Chargaff規(guī)則，見(jiàn)表13-5(二) DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 依據(jù)：Chargaff規(guī)則；X衍射圖；堿基不可滴定。 要點(diǎn)（1）兩條鏈反向平行，繞同一軸相互纏繞成右手螺旋；（2）磷酸和戊糖交替處于螺旋外圍，堿基處于內(nèi)部，形成堿基對(duì)；(3) 雙螺旋的直徑為2nm，堿基堆積距離為0.34nm；（4）一條鏈的核苷酸序列可以決定另一條互補(bǔ)鏈的核苷酸序列。* 雙螺旋分子中糖分子與縱軸平行，與堿基平面垂直。 穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力為氫鍵、堿基堆積力（即疏水作用）和環(huán)境中正離子的作用。 堿基的配對(duì)使得雙堿基的配對(duì)使得雙螺旋螺旋DNADNA分子在復(fù)制時(shí)分子在復(fù)制時(shí)以半保留的形式進(jìn)行。以半保留的形式進(jìn)行。5.DNA

10、雙螺旋分子結(jié)構(gòu)的不同類型： 主要有三種，分別命名為A、B和C型。其中B型與Watson-Crick提出的模型一致，A和C型在低相對(duì)濕度的條件下形成，它們的螺距都比B型要短，A型DNA的結(jié)構(gòu)與DNA和RNA的雜合鏈相似。Z型DNA首先在富含GC的DNA短片段中發(fā)現(xiàn)，后用抗體證明天然DNA中也有，它是一種左手螺旋，在細(xì)胞中可能與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。 螺距 殘基數(shù) 堿基傾斜 A型(75%,Na) 2.8 11 20B型(92%,Na) 3.4 10 0C型(66%,Li) 3.1 9.3 6D/R hybrid 2.8 11 20Z型 4.6 12 9Z-DNAZ-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： （

11、1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。 （2）左旋。 （3）G的糖苷鍵呈順式(Syn) ，使G殘基位于分子表面。 （4）大溝消失，小溝窄而深。 （5）每個(gè)螺旋有12bp。Z ZDNADNA存在的條件：存在的條件： （1） 高鹽：NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L （2） Pu,Py相間排列。 （3）在活細(xì)胞中如果有m5C,則無(wú)需嘌呤-嘧啶相間排列，在生理鹽水的濃度下可產(chǎn)生Z型將結(jié)構(gòu)。 （4） 在體內(nèi)多胺化合物，如精胺和亞胺及亞精胺等陽(yáng)離子，可和磷酸基因結(jié)合，使B-DNA轉(zhuǎn)變成Z-DNA。 （5）某些蛋白質(zhì)如Z-DNA結(jié)合蛋白帶有正電荷，可使DNA周圍形成局部的高鹽濃度

12、微環(huán)境。 （6）負(fù)超螺旋的存在。Z-DNAZ-DNA的生物學(xué)意義的生物學(xué)意義 (1) 可能提供某些調(diào)節(jié)蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。嚙齒類動(dòng)物病毒的復(fù)制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；在SV40的增強(qiáng)子中有三段8bp的Z-DNA存在。 (2)原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)，有大、小兩個(gè)核，大核大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核小核與繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標(biāo)記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說(shuō)明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。*6.DNA分子的三螺旋結(jié)構(gòu)和單鏈結(jié)構(gòu)： 在DNA分子中，鏡像重復(fù)序列可以回折，形成三螺旋結(jié)構(gòu)。 在某些病毒中，DNA分子以單鏈形式存在。 DNA雙螺旋為右手螺旋。

13、細(xì)胞中的環(huán)狀DNA一般呈負(fù)超螺旋，即右手螺旋不足導(dǎo)致部分堿基不能形成配對(duì)，分子通過(guò)整體拓?fù)鋵W(xué)上的右旋來(lái)補(bǔ)足右手螺旋的不足，在數(shù)學(xué)上呈1：1，即分子整體右旋一圈來(lái)補(bǔ)雙螺旋上的一圈不足。 正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過(guò)度，通過(guò)分子整體的左旋來(lái)解開(kāi)過(guò)度的螺旋。(三 ) DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) WhiteWhite方程：方程： L=T+WL=T+W L L（Linking nnmber）：連環(huán)數(shù)或稱拓?fù)洵h(huán)繞數(shù)，指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)L是整數(shù)；(2) 在 cccDNA中任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；（3）右手螺旋的L取正值。 W W（Writhing number）：扭曲數(shù)，即超螺

14、旋數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手超螺旋的W取負(fù)值。 T T（Twisting number）：纏繞數(shù)，即雙螺旋的圈數(shù)。其特點(diǎn)是：(1) 可以是非整數(shù)；(2) 是變量；(3) 右手螺旋時(shí)T為正值。超螺旋的量度可以用超螺旋密度來(lái)表示： =（L-T）/T 在天然DNA中，約為-0.05，大約20個(gè)雙螺旋有1個(gè)超螺旋。促旋酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）的作用方式(四) DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu) 平均每200bp的DNA繞核小體左旋1.75轉(zhuǎn)，因此真核生物的DNA分子為正超螺旋核小體的電鏡照片核小體的電鏡照片組蛋白八聚體：（a)前面觀；(b)頂面觀；（c）沿著染色體纖維長(zhǎng)軸的透視圖；(d

15、)DNA與組蛋白空間結(jié)構(gòu)的模式圖。（a)核小體的結(jié)構(gòu)圖，左圖為沿核小體軸觀察的圖示； 右圖為沿核小體軸垂直方向觀察的圖示；(b) 一半核小體的結(jié)構(gòu)圖。四、RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) (一) tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) (二) rRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) 16S rRNA(三) 其他RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) 基本要求1.掌握核苷酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和重要核苷酸的生物學(xué)功用。（重點(diǎn)）2.掌握核酸的共價(jià)結(jié)構(gòu)。（重點(diǎn)）3.掌握DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，熟悉DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。（重點(diǎn)）4.掌握RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，熟悉RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 （重點(diǎn)）作業(yè)題作業(yè)題第500頁(yè)第3題；第500頁(yè)第4題；第500頁(yè)第5題；第500頁(yè)第6題；第500頁(yè)第7題；第500頁(yè)第

16、10題；第500頁(yè)第12題；第500頁(yè)第13題；第500頁(yè)第14題。 第14章 核酸的物理化學(xué)性質(zhì) 一、核酸的水解(一) 酸水解 糖苷鍵比磷酸酯鍵更易水解，特別是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵很容易水解。(二) 堿水解 通常用于RNA水解，DNA的堿水解比較困難。(三) 酶水解 雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性內(nèi)切酶（restriction enzyme）切斷, 又可以再連接起來(lái)。切斷的過(guò)程不需要能量，而連接的起來(lái)的過(guò)程卻需要2個(gè)分子的ATP。這就是分子克隆和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)。大部分限制性內(nèi)切酶識(shí)別的堿基序列為4 6 個(gè)堿基的palindrome 順序。它們?cè)谖⑸锛?xì)胞內(nèi)發(fā)

17、揮iu的是防御外來(lái)DNA入侵的國(guó)防軍的作用。堿基堿基adenine 4.15, 9.8cytosine 4.5, 12.2guanine 3.2, 9.6thymine 9.9, 13核苷核苷adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13核苷酸核苷酸AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4ADP 3.9, 6.3 : -CMP

18、 4.5, 6.3 : dCMP 4.6GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0二、核酸的酸堿性質(zhì)堿基配對(duì)時(shí)堿基一般以酮式存在，而不是醇烯式。 堿基中的H原子一般不移動(dòng)，因此很少有亞氨基團(tuán)。 在中性pH條件下，參與氫鍵的-NH2基均不帶電荷，這是雜環(huán)電子共軛以及氫鍵共同作用的結(jié)果，否則雙螺旋結(jié)構(gòu)不會(huì)穩(wěn)定。堿基、核堿基、核苷、核苷苷、核苷酸的酸的pK值值三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g四、核酸的變性，復(fù)性及雜交變性和復(fù)性的含義Tm的定義影響Tm的因素 1.

19、DNA 的均一性越高,Tm的溫度范圍越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，當(dāng)GC的含量上升1%，則Tm上升0.4。馬默多蒂（Marmur-Doty）關(guān)系式：Tm = 69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）2.44 3.介質(zhì)的離子強(qiáng)度較高時(shí), Tm的值較大。 4.酸性條件下,核酸容易脫嘌呤,堿性條件下,核酸容易變性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化學(xué)試劑可以降低Tm的值,稱作變性劑。SSC溶液，常用于溶液，常用于DNA的溶解。的溶解。(二) 復(fù)性 T1/2 C constDNADNA濃度與復(fù)性時(shí)間的關(guān)系濃度與復(fù)性時(shí)間的關(guān)系影響復(fù)性速度的因素1.DN

20、A的片段越大,復(fù)性的速度越慢;2.DNA的濃度越高,復(fù)性的速度越快;3.DNA的重復(fù)序列越多,復(fù)性的速度越快;4.溶液的pH過(guò)高或過(guò)低,復(fù)性的速度均會(huì)降低;5.適當(dāng)增高溶液的離子強(qiáng)度,復(fù)性的速度會(huì)增高。當(dāng) C/C0=1/2時(shí)， k=1/C0t1/2 哺乳動(dòng)物的DNA 一般均呈右圖的曲線，這是因?yàn)樗鼈兊幕蚪MDNA 中插入了大量的重復(fù)序列，如人的DNA中就插入了長(zhǎng)度為350bp的Alu序列達(dá)50萬(wàn)份拷貝之多。 分子雜交分子雜交是將不同來(lái)源的核酸分子分別變性，再混合后復(fù)性，使不同來(lái)源的單鏈的互補(bǔ)區(qū)形成雙鏈的技術(shù)。 通常將其中的一方用放射性同位素放射性同位素或特定的基團(tuán)(如生物素生物素, ,地高辛地

21、高辛)標(biāo)記，稱作探針，探針，現(xiàn)時(shí)的探針多為人工合成的短片段。 若將雜交的另一方直接點(diǎn)到膜上進(jìn)行雜交，稱作點(diǎn)雜交。點(diǎn)雜交。對(duì)組織切片或菌落進(jìn)行處理后再雜交稱作原位雜交。原位雜交。 分子雜交的廣泛應(yīng)用是將樣品DNADNA用限制性內(nèi)切酶切割限制性內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，進(jìn)行變性凝膠電泳，變性凝膠電泳，將凝膠電泳形成的DNADNA區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上轉(zhuǎn)移到膜上再進(jìn)行雜交，這種技術(shù)稱作SouthernSouthern雜交。雜交。將RNARNA凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再進(jìn)行雜交稱作NorthernNorthern雜交。雜交。將蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再與酶標(biāo)抗體進(jìn)行特異反應(yīng)稱作Weste

22、rnWestern印印跡技術(shù)。跡技術(shù)。將蛋白質(zhì)等點(diǎn)聚焦蛋白質(zhì)等點(diǎn)聚焦形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再與酶標(biāo)抗體進(jìn)行特異反應(yīng)稱作EasternEastern印跡技術(shù)。印跡技術(shù)。 分子雜交技術(shù)在現(xiàn)代生命科學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。 將人工合成的探針探針用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)到玻璃或塑料基片上形成高密度的陣列，陣列，將樣品樣品DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，變性后用熒光基團(tuán)標(biāo)記，熒光基團(tuán)標(biāo)記，再進(jìn)行分子雜分子雜交操作，交操作，這就是DNADNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)的基本原理。用類似的技術(shù)可以制成蛋白質(zhì)芯片。蛋白質(zhì)芯片。按指令在基片上合成探針，可以制成密度特別高的芯片。 生物芯片技術(shù)有非常廣闊的應(yīng)用前景?；疽?.熟悉核

23、酸的水解方法及水解產(chǎn)物。2.掌握核酸的酸堿性質(zhì)。（重點(diǎn)）3.掌握核酸的紫外吸收。（重點(diǎn)）4.掌握核酸變性、復(fù)性及雜交的有關(guān)知識(shí)及應(yīng)用。（重點(diǎn)、難點(diǎn)） 第15章 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提純和定量測(cè)定 (一) DNA的分離 用1mol/L的NaCl制備組織勻漿,離心除去組織殘?jiān)?多次用苯酚處理使蛋白質(zhì)變性,每次處理后離心取上層水相,最后加2倍體積的乙醇沉淀出DNA。(二 ) RNA的分離 由于RNA酶存在廣泛,且十分穩(wěn)定,破碎細(xì)胞時(shí)要加入胍鹽破壞RNA酶,試劑要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高壓滅菌或用0.1%的DEPC處理,多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性,每次處理后

24、離心取上層水相,mRNA可用寡聚dT-纖維素親和層析從總RNA中分離。(三) 核酸含量的測(cè)定法 常用的方法是測(cè)定260nm的消光度,用公式計(jì)算核酸的含量。 核酸的含量也可以用定磷法測(cè)定。 DNA的含量可以用二苯胺顯色法測(cè)定。 RNA的含量可以用地衣酚顯色法測(cè)定。（四）核酸的超速離心 (圖15-2) 超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大） ,線性DNA（密度?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。（五）核酸的凝膠電泳 (圖15-3)松弛型，松弛型，OC, Open circular DNA超螺旋超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNA從細(xì)菌抽從細(xì)菌

25、抽提得到的提得到的質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 樣品中不樣品中不含線狀含線狀DNA二、核酸的核苷酸序列測(cè)定和化學(xué)合成 (一) DNA的酶法（末端終止法）測(cè)序 (二) DNA的化學(xué)法測(cè)序DNA酶法測(cè)序自動(dòng)化 使用4種熒光素標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，毛細(xì)管電泳和激光掃描技術(shù)使測(cè)序自動(dòng)化，一個(gè)泳道一次可測(cè)大約1000個(gè)核苷酸，測(cè)序已成為可以快速完成的常規(guī)技術(shù)。人類基因組測(cè)序已經(jīng)完成，多態(tài)性的研究和功能基因組學(xué)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。由于測(cè)序儀在一個(gè)泳道只能準(zhǔn)確測(cè)出幾百個(gè)核苷酸，對(duì)于長(zhǎng)DNA, 只能將其切成小段再測(cè)序，為了組裝，需要確定足夠多的標(biāo)記位點(diǎn)。常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST

26、)等方法確定標(biāo)記位點(diǎn)。限制性酶切位點(diǎn)分析是繪制物理圖的常用方法(三) RNA的測(cè)序 1.RNA的測(cè)序可以用4種特異性的酶切割（從胰臟提取的RNase A水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的RNase T1水解鳥(niǎo)苷酸的磷酸二酯鍵，黑粉曲霉中提取的RNase U2水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的RNase Phy 水解A、U、G三種核苷酸的磷酸二酯鍵）,凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。 2.也可以用化學(xué)試劑斷裂RNA鏈，用類似DNA化學(xué)測(cè)序的方法推斷核苷酸序列。 3.最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DNA測(cè)序的方法推斷核苷酸序列。 PCR (polymera

27、se PCR (polymerase chain reaction)chain reaction)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板DNA的含量依指數(shù)方式增加，可用來(lái)快速在體外擴(kuò)增DNA, PCRDNA, PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。PCR技術(shù)的擴(kuò)展技術(shù)的擴(kuò)展 典型的PCR經(jīng)過(guò)一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴(kuò)展到分子生物學(xué)的各個(gè)方面，較常用的技術(shù)擴(kuò)展有：1. “巢式巢式”PCR(nested PCR) 先用一對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對(duì)引物擴(kuò)增第一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，這一PCR 技術(shù)即巢式PCR。第一次

28、擴(kuò)增所用引物稱外引物(outer-primer)，第二次擴(kuò)增作用的引物稱內(nèi)引物(inter-primer)。 進(jìn)行“巢式”PCR可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)一些，且用量較少，用外引物進(jìn)行時(shí)，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進(jìn)行內(nèi)引物的PCR擴(kuò)增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進(jìn)退式”PCR(drop-in-drop-out PCR)。 “巢式”及“中途進(jìn)退式”PCR主要用于極少量模板的擴(kuò)增。 2. 復(fù)合復(fù)合PCR(multiplex PCR) 在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PC

29、R主要用于同一病原體分型及同時(shí)檢測(cè)多種病原體。此外也常用于多點(diǎn)突變性分子病的診斷。3. 不對(duì)稱不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR) 兩種引物比例相差較大的PCR稱不對(duì)稱PCR。不對(duì)稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交的探針等。4. 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR) 由于Taq酶只能以DNA為模板，當(dāng)待擴(kuò)增模板為RNA時(shí)，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，在分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。5. 涂片涂片PCR(slide-PCR) 直接對(duì)載玻片上細(xì)胞涂片或組織切片進(jìn)行PCR擴(kuò)增的

30、方法稱涂片PCR。涂片PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測(cè)。 6. 反向反向PCR(inverse PCR) 擴(kuò)增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進(jìn)行酶切和環(huán)化，然后直接進(jìn)行PCR，也可將已知序列酶切后再進(jìn)行PCR。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴(kuò)增。7. 錨定錨定PCR(anchored PCR) 用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA 3端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫(kù)

31、的構(gòu)建。8. 修飾引物修飾引物PCR 為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5-末端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析物結(jié)合位點(diǎn)等，這種PCR技術(shù)稱為修飾引物PCR。此外，還可將一些信號(hào)分子如熒光素、生物素等連接于引物的5末端，當(dāng)PCR完成后可對(duì)產(chǎn)物直接進(jìn)行檢測(cè)。 PCR在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。 （五） DNA的化學(xué)合成 固相磷酰亞胺法合成時(shí)，末端核苷酸的3-OH與固相載體成共價(jià)鍵，5-OH被4，4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護(hù)，下一個(gè)核苷酸的5-OH亦被DMTr保護(hù)，3-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和

32、-OCH3兩個(gè)基團(tuán)， 3-OH因此被活化。每延伸一個(gè)核苷酸需四步化學(xué)反應(yīng)：(1) 脫三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脫去，游離出5-OH 。(2) 縮合：新生成的5-OH 在四唑催化下與下一個(gè)核苷3-磷酰亞胺單體縮合使鏈增長(zhǎng)。(3) 蓋帽：有少量(小于0.5%)未縮合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙?；忾]，以防進(jìn)一步縮合造成錯(cuò)誤延伸。(4) 氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價(jià)亞磷，需用碘氧化成五價(jià)磷。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向5方向延伸一個(gè)核苷酸?；疽?.掌握核酸的分離、提純、定量測(cè)定、超速離心和凝膠電泳等基本方法。（重點(diǎn)）2.熟悉核苷酸序列測(cè)定

33、的原理。（難點(diǎn)）3.熟悉DNA聚合酶鏈反應(yīng)的原理及應(yīng)用。（難點(diǎn)）4.熟悉DNA化學(xué)合成的原理及應(yīng)用。（難點(diǎn)）第第1313章章 核酸的結(jié)構(gòu)核酸的結(jié)構(gòu)NNNHNNH2一、核酸的組成一、核酸的組成p223核核 酸酸核苷酸核苷酸磷磷 酸酸核核 苷苷戊戊 糖糖含氮堿含氮堿核糖核糖脫氧核糖脫氧核糖嘌呤堿嘌呤堿嘧啶堿嘧啶堿（一一）核酸的元素組成核酸的元素組成 基本元素：基本元素：C H O N C H O N P P 核酸的元素組成有兩個(gè)特點(diǎn)：核酸的元素組成有兩個(gè)特點(diǎn)： 1. 1. 一般不含一般不含S S。 2. P 2. P含量較多，并且恒定（含量較多，并且恒定（9%-10%9%-10%）。）。 因此，實(shí)

34、驗(yàn)室中用因此，實(shí)驗(yàn)室中用定磷法定磷法進(jìn)行核酸的進(jìn)行核酸的定量分析。（定量分析。（DNA9.9% DNA9.9% 、RNA9.5%RNA9.5%）（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸n核酸（核酸（DNADNA和和RNARNA）是一種線性多聚核苷酸，它）是一種線性多聚核苷酸，它的基本結(jié)構(gòu)單元是的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸核苷酸。n核苷酸本身由核苷和磷酸組成核苷酸本身由核苷和磷酸組成, , n而核苷則由戊糖和堿基形成而核苷則由戊糖和堿基形成nDNADNA與與RNARNA結(jié)構(gòu)相似，但在組成成份上略有不同。結(jié)構(gòu)相似，但在組成成份上略有不同。一、核酸的組成一、核酸的組成OOHH(O)H1

35、 2 NOHHH4 3 CH25 PO-OOO-磷酸磷酸 (phosphoric acid)(phosphoric acid)核苷核苷(nucleoside)(nucleoside)戊糖戊糖(pentose)(pentose)堿基堿基(base)(base)核苷酸核苷酸 核酸中堿基有兩類：核酸中堿基有兩類： 嘌呤堿嘌呤堿 嘧啶堿嘧啶堿 它們是含氮的雜環(huán)化合物，它們是含氮的雜環(huán)化合物，具有弱堿性具有弱堿性一、核酸的組成一、核酸的組成（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸（1 1）組成核酸的堿基）組成核酸的堿基腺嘌呤腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤鳥(niǎo)嘌呤尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶6

36、-氨基嘌呤氨基嘌呤2-氨基氨基-6-氧嘌呤氧嘌呤2，4-二氧嘧啶二氧嘧啶5-甲基甲基-2，4-二氧嘧啶二氧嘧啶2-氧氧-4-氨基嘧啶氨基嘧啶基 本 堿 基RNA： A、G、C、U堿基堿基DNA： A、G、C、T堿基堿基 稀有堿基（稀有堿基（tRNAtRNA中最多中最多） 核酸中除了核酸中除了5 5類基本的堿基外，還有一些含量甚少的類基本的堿基外，還有一些含量甚少的堿基，稱為稀有堿基，大多數(shù)為甲基化堿基。堿基，稱為稀有堿基，大多數(shù)為甲基化堿基。DHUm5Chm5C7-甲基鳥(niǎo)嘌呤甲基鳥(niǎo)嘌呤ImG次黃嘌呤次黃嘌呤n堿基都具有芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特征。嘌呤環(huán)和嘧堿基都具有芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特征。嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)均呈平

37、面或接近于平面的結(jié)構(gòu)。啶環(huán)均呈平面或接近于平面的結(jié)構(gòu)。n堿基的芳香環(huán)與環(huán)外基團(tuán)可以發(fā)生堿基的芳香環(huán)與環(huán)外基團(tuán)可以發(fā)生酮式酮式烯烯醇式醇式或或胺式胺式亞胺式亞胺式互變異構(gòu)?；プ儺悩?gòu)。n嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵共軛雙鍵體系，體系，在紫外區(qū)有吸收（在紫外區(qū)有吸收（260 nm260 nm左右）左右） 組成核酸的堿基的結(jié)構(gòu)特征組成核酸的堿基的結(jié)構(gòu)特征一、核酸的組成一、核酸的組成（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸 五種堿基都能形成五種堿基都能形成酮式酮式- -烯醇式烯醇式或或氨基氨基- -亞氨基亞氨基的互的互變異構(gòu)。這兩種異構(gòu)體的平衡關(guān)系受介

38、質(zhì)酸堿環(huán)境的影變異構(gòu)。這兩種異構(gòu)體的平衡關(guān)系受介質(zhì)酸堿環(huán)境的影響。響。 HNHNCNH2+O+HNNH2NNH2亞亞氨氨基基氨氨基基+ H+NCOHNCO-+ H+酮酮式式烯烯醇醇式式（2 2）一、核酸的組成一、核酸的組成（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脫氧核糖DNADNARNARNARNARNA中修飾戊糖中修飾戊糖D-2-O-甲基核糖甲基核糖D-2-O-甲基核糖甲基核糖（3 3）胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鳥(niǎo)嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHH

39、OHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2一、核酸的組成一、核酸的組成（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸堿基和核糖（或脫氧核糖）通過(guò)堿基和核糖（或脫氧核糖）通過(guò)糖苷鍵糖苷鍵連接形成連接形成核苷核苷(nucleoside)(nucleoside) （或脫氧核苷）。（或脫氧核苷）。腺嘌呤核苷NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷鍵胞嘧啶脫氧核苷1NNONH212OHOHHHHCH2OHH糖苷鍵n糖與堿基之間的糖與堿基之間的C-NC-N鍵，稱為鍵，稱為C-NC-N糖苷鍵糖苷鍵。n戊糖與堿基之間脫水縮合以

40、戊糖與堿基之間脫水縮合以型的型的C-NC-N糖苷糖苷鍵鍵連接形成核苷連接形成核苷。n其中其中戊糖與嘌呤之間戊糖與嘌呤之間是戊糖的是戊糖的C C1 1 與嘌呤的與嘌呤的NN9 9脫水縮合成脫水縮合成C C1 1 -N-N9 9糖苷鍵。糖苷鍵。n戊糖與嘧啶之間戊糖與嘧啶之間是戊糖的是戊糖的C C 1 1與嘧啶的與嘧啶的NN1 1脫脫水縮合成水縮合成C C1 1 -N-N1 1糖苷鍵。糖苷鍵。修飾核苷修飾核苷 核酸中還存在少量修飾核酸中還存在少量修飾核苷，有三種：核苷，有三種： 由由稀有堿基稀有堿基參與，如：參與，如： 5-5-甲基脫氧胞苷，甲基脫氧胞苷， 次黃嘌呤核苷次黃嘌呤核苷 由由稀有戊糖稀有

41、戊糖參與，如：參與，如： 2 2 -O-O-甲基胞苷甲基胞苷 堿基與戊糖連接方式特堿基與戊糖連接方式特殊殊，如：，如： 假尿苷（假尿苷（）C C 1 1-C-C5 5 5-5-甲基脫氧胞苷甲基脫氧胞苷2-O-2-O-甲基胞苷甲基胞苷次黃嘌呤核苷次黃嘌呤核苷假尿苷（假尿苷（） DNADNA的甲基化導(dǎo)致基因沉默的甲基化導(dǎo)致基因沉默 DNA,RNA中主要的堿基、核苷 戊糖 堿基 核苷 RNA RNA D-D-核糖核糖 A A 腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷 G G 鳥(niǎo)嘌呤核苷鳥(niǎo)嘌呤核苷 C C 胞嘧啶核苷胞嘧啶核苷 U U 尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷DNA DNA D-2-D-2-脫氧核糖脫氧核糖 A A 脫氧腺嘌

42、呤核苷脫氧腺嘌呤核苷 G G 脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷 C C 脫氧胞嘧啶核苷脫氧胞嘧啶核苷 T T 脫氧胸腺嘧啶核苷脫氧胸腺嘧啶核苷核糖核苷脫氧核糖核苷（4 4）一、核酸的組成一、核酸的組成（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位（二）核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸n核苷中的戊糖羥基被磷酸核苷中的戊糖羥基被磷酸酯化酯化，就形成核苷酸。，就形成核苷酸。n核糖有核糖有3 3個(gè)自由羥基，可個(gè)自由羥基，可分別被酯化生成分別被酯化生成2 2 - -，3 3 - -和和5 5 - -核糖核苷酸。核糖核苷酸。n脫氧核糖有脫氧核糖有2 2個(gè)自由羥基，個(gè)自由羥基，可生成可生成3 3 - -，5 5 - -脫氧核糖脫氧核糖

43、核苷酸。核苷酸。OBOH OHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脫氧核糖核苷酸n作為作為DNADNA或或RNARNA結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是5-5-磷磷酸酸- -脫氧核糖核苷脫氧核糖核苷和和5-5-磷酸磷酸- -核糖核苷。核糖核苷。核苷酸：核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP 核苷（脫氧核苷）和磷酸以核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵酯鍵連接形成連接形成核苷酸核苷酸（脫氧核苷酸）。（脫氧核苷酸）。 糖苷鍵酯鍵腺苷酸NNNN9NH2OOH

44、OHHHHCH2H12OPO- -HOO5l 多磷酸核苷酸：多磷酸核苷酸： NMP，NDP，NTPNNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO- -OOPOO- -OPO- - -OO一磷酸腺苷（AMP）二磷酸腺苷（ADP）三磷酸腺苷（ATP）ATP ATP 分子的最顯著特點(diǎn)分子的最顯著特點(diǎn)是含有兩個(gè)是含有兩個(gè)高能磷酸鍵高能磷酸鍵。ATPATP水解時(shí)水解時(shí), , 可以釋放出可以釋放出大量自由能。大量自由能。ATP ATP 是生物體內(nèi)最重要是生物體內(nèi)最重要的的能量轉(zhuǎn)換中間體能量轉(zhuǎn)換中間體。ATP ATP 水解釋放出來(lái)的能量用水解釋放出來(lái)的能量用于推動(dòng)生物體內(nèi)各種需于推動(dòng)生物體內(nèi)各種需能的生

45、化反應(yīng)。能的生化反應(yīng)。NOCH2OO HO HNNNNH2POO HOP OO HOP OO HOHNOCH2OOHOHNNNNH2POOHOP OOHOHnGTPGTP是生物體內(nèi)游離存在的另一種重要的核苷是生物體內(nèi)游離存在的另一種重要的核苷酸衍生物。它具有酸衍生物。它具有ATP ATP 類似的結(jié)構(gòu)類似的結(jié)構(gòu), , 也是一種也是一種高能化合物高能化合物。nGTPGTP主要是作為主要是作為蛋白質(zhì)合成中磷?；w蛋白質(zhì)合成中磷?；w。在。在許多情況下許多情況下, ATP , ATP 和和 GTP GTP 可以相互轉(zhuǎn)換?？梢韵嗷マD(zhuǎn)換。 3、環(huán)化核苷酸、環(huán)化核苷酸: cAMP，cGMPNOCH2OO

46、HOHNNNNH2POOHOHNOCH2OOHONNNNH2POOHcAMP cAMP 和和 cGMPcGMPncAMP(3cAMP(3,5,5- - 環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸) )和和 cGMP( 3cGMP( 3,5,5- -環(huán)鳥(niǎo)嘌呤核苷一磷酸環(huán)鳥(niǎo)嘌呤核苷一磷酸) )的的主要功能是作為主要功能是作為細(xì)胞之間傳遞信息的細(xì)胞之間傳遞信息的信使信使。ncAMP cAMP 和和 cGMP cGMP 的環(huán)狀磷酯鍵是一個(gè)的環(huán)狀磷酯鍵是一個(gè)高能鍵。在高能鍵。在 pH 7.4 pH 7.4 條件下條件下, cAMP , cAMP 和和 cGMP cGMP 的水解能約為的水解能約為43.9 kj

47、 /mol43.9 kj /mol，比比 ATP ATP 水解能高得多。水解能高得多。n含核苷酸的生物活性物質(zhì)：含核苷酸的生物活性物質(zhì)： NADNAD+ +、NADPNADP+ +、CoA-SHCoA-SH、FAD FAD 等都含有等都含有 AMPAMPNADP+NAD+ 修飾核苷修飾核苷酸酸 核酸中還含有少量的由核酸中還含有少量的由修飾核苷修飾核苷與磷酸形成的與磷酸形成的核苷酸稱為修飾核苷酸。核苷酸稱為修飾核苷酸。（1 1）參與）參與DNADNA、RNARNA的合成、蛋白質(zhì)的合成、糖與的合成、蛋白質(zhì)的合成、糖與磷脂的合成。磷脂的合成。(5(5 -NTP -NTP 和和 5 5 -dNTP -

48、dNTP 分別為分別為RNA, DNARNA, DNA合成的前體。合成的前體。 UTP, CTP, GTPUTP, CTP, GTP分別分別參與糖原、磷脂和蛋白質(zhì)的合成參與糖原、磷脂和蛋白質(zhì)的合成) )（2 2）在能量轉(zhuǎn)化中起重要作用，）在能量轉(zhuǎn)化中起重要作用，ATPATP是生物體內(nèi)是生物體內(nèi)能量的通用貨幣能量的通用貨幣。（3 3）是構(gòu)成多種輔酶的成分：）是構(gòu)成多種輔酶的成分：NADNAD、NADPNADP、FADFAD、FMNFMN和和CoACoA。（4 4）參與細(xì)胞中的代謝與調(diào)節(jié)，）參與細(xì)胞中的代謝與調(diào)節(jié)，作為細(xì)胞之間傳作為細(xì)胞之間傳遞信息的信使。遞信息的信使。 （cAMPcAMP、cGM

49、PcGMP）。）。 核苷酸的生物學(xué)作核苷酸的生物學(xué)作用用多聚核苷酸多聚核苷酸核酸核酸p227n多聚核苷酸是通過(guò)核苷酸的多聚核苷酸是通過(guò)核苷酸的5 5- -磷酸基與另一磷酸基與另一分子核苷酸的分子核苷酸的C C3 3-OH-OH形成磷酸二酯鍵相連而成形成磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。的鏈狀聚合物。n由脫氧核糖核苷酸聚合而成的稱為由脫氧核糖核苷酸聚合而成的稱為DNADNA鏈；鏈；n由核糖核苷酸聚合而成的則稱為由核糖核苷酸聚合而成的則稱為RNARNA鏈。鏈。多聚核苷酸的特點(diǎn)多聚核苷酸的特點(diǎn)核苷酸之間以核苷酸之間以3 , 5 -磷酸磷酸二酯鍵二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，連接形成多核苷酸鏈，即核酸。即核

50、酸。5 端端3 端端有方向性有方向性 多聚核苷酸的特點(diǎn)多聚核苷酸的特點(diǎn)在多聚核苷酸中，兩個(gè)核苷酸之間形成的磷酸二酯鍵通在多聚核苷酸中，兩個(gè)核苷酸之間形成的磷酸二酯鍵通常稱為常稱為3355磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵。多聚核苷酸鏈一端的多聚核苷酸鏈一端的C C5 5帶有一個(gè)自由磷酸基，稱為帶有一個(gè)自由磷酸基，稱為5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 -P5 -P表示）；另一端表示）；另一端C C3 3帶有自由帶有自由的羥基，稱為的羥基，稱為3-3-羥基端（常用羥基端（常用3 -OH3 -OH表示）。表示）。多聚核苷酸鏈具有方向性多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，

51、必須注明它的方向是必須注明它的方向是5353或是或是3535。 二、核酸的結(jié)構(gòu)二、核酸的結(jié)構(gòu) DNADNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu) DNADNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) DNADNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu) DNADNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) RNARNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu) RNARNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) RNARNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的高級(jí)結(jié)構(gòu) （一）核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)（一）核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)n多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順序組合而成多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順序組合而成的線性結(jié)構(gòu)聚合物，因此，它具有一定的核苷酸順序，即堿基的線性結(jié)構(gòu)聚合物，因此，它具有一定的核苷酸順序，即堿基順序。順序

52、。n核酸的堿基順序是核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸的堿基順序是核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。nDNADNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于的多樣性即寓于DNADNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。之中。n而而mRNA(mRNA(信息信息RNA)RNA)的堿基順序，則直接為蛋白質(zhì)的氨基酸編碼，的堿基順序，則直接為蛋白質(zhì)的氨基酸編碼，并決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序并決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)：的一級(jí)結(jié)構(gòu)： 5 -AGTCCATG-3 AGTCCATG 3 -TCAGGTAC-5

53、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)：的一級(jí)結(jié)構(gòu)： 5 -AGUCCAUG-3 AGUCCAUG 1.1.DNADNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（1 1）定義：指）定義：指DNADNA分子中多個(gè)脫氧核苷酸的排列順序。即數(shù)目龐大分子中多個(gè)脫氧核苷酸的排列順序。即數(shù)目龐大的四種堿基的排列順序。的四種堿基的排列順序。 DNADNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的物種的多樣性多樣性即寓于即寓于DNADNA分子中四種脫氧核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合分子中四種脫氧核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。之中。（2 2）DNADNA的堿基組成（的堿基組成（Chargaf

54、fChargaff定則）：定則）：在所有的在所有的DNADNA中，中，A=TA=T，G=C G=C 即即A+G=T+CA+G=T+C；DNADNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物物種的的堿基組成具有種的特異性，即不同生物物種的DNADNA具有自己具有自己獨(dú)特的堿基組成獨(dú)特的堿基組成( (以以不對(duì)稱比率不對(duì)稱比率A+T/G+CA+T/G+C表示表示) )，但同一生，但同一生物體內(nèi)沒(méi)有組織和器官的特異性。物體內(nèi)沒(méi)有組織和器官的特異性。 A=T,G=CA=T,G=C這一規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，提示了這一規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，提示了A A與與T T，G G與與C C之間堿基互補(bǔ)之間堿基互補(bǔ)的可能性。的可能性。(3)(3

55、)DNADNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的書(shū)寫(xiě)方法一級(jí)結(jié)構(gòu)的書(shū)寫(xiě)方法PPAPCPCPTPGOHCPTPAPA53pApCpTpGpCpTpApApC-OH 35 ACTGCTAAC35文字表示法文字表示法文字表示法文字表示法線條式表示法線條式表示法 蛇毒磷酸二酯酶是從多核苷酸鏈的游離蛇毒磷酸二酯酶是從多核苷酸鏈的游離3羥基端開(kāi)始、逐個(gè)羥基端開(kāi)始、逐個(gè)水解下水解下5核苷酸。核苷酸。 牛脾磷酸二酯酶則相反，從游離牛脾磷酸二酯酶則相反，從游離5羧基端開(kāi)始、逐個(gè)水解下羧基端開(kāi)始、逐個(gè)水解下3核苷酸。核苷酸。 由于水解的位置不同，因而所得到的核苷酸可以是由于水解的位置不同，因而所得到的核苷酸可以是3核苷酸，核苷酸，或是或

56、是5核苷酸。核苷酸。 核酸外切酶核酸外切酶2.DNA2.DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)n1953年，年，Watson和和Crick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上，在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)根據(jù)DNA結(jié)晶的結(jié)晶的X-X-衍射圖衍射圖譜和分子模型，提出了著名譜和分子模型，提出了著名的的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。(25y)(35y)(35y)(1)DNA(1)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景 堿基組成分析堿基組成分析Chargaff 規(guī)則規(guī)則：A = T G = C 堿基的理化數(shù)據(jù)分析堿基的理化數(shù)

57、據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對(duì)較合理以氫鍵配對(duì)較合理 DNA纖維的纖維的X-線衍射圖譜分析線衍射圖譜分析 (2)DNA(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)點(diǎn)兩條反向平行的兩條反向平行的多脫氧核苷酸鏈圍多脫氧核苷酸鏈圍繞同一中心軸以繞同一中心軸以右右手手盤繞成雙螺旋結(jié)盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋表面構(gòu)，螺旋表面 具具大溝大溝和和小溝小溝。n嘌呤堿和嘧啶堿基嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸和脫氧核糖基位于酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)，彼此以螺旋外側(cè)，彼此以3 3 -5 -5 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接，形成連接，形成DNADNA分分子的骨架。堿基環(huán)平子的骨架。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂

58、直，糖面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成面成9090角。角。螺旋橫截面的螺旋橫截面的直徑直徑約為約為2 nm2 nm，每條鏈，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平面相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為之間的距離為0.34 0.34 nmnm，每，每1010個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其形成一個(gè)螺旋，其螺矩螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）一圈）高度為高度為3.4 3.4 nmnm。2.0 nm小小溝溝大大溝溝雙螺旋內(nèi)部的堿基按雙螺旋內(nèi)部的堿基按規(guī)則配對(duì)，規(guī)則配對(duì)，堿基堿基的相的相互結(jié)合具有嚴(yán)格的互結(jié)合具有嚴(yán)格的配配對(duì)對(duì)規(guī)律，即腺嘌呤（規(guī)律，即腺嘌呤（A A）與胸腺嘧啶（與胸腺嘧啶（T T）結(jié)

59、合，）結(jié)合，鳥(niǎo)嘌呤（鳥(niǎo)嘌呤（G G）與胞嘧啶）與胞嘧啶（C C）結(jié)合，這種配對(duì)）結(jié)合，這種配對(duì)關(guān)系，稱為關(guān)系，稱為堿基互補(bǔ)。堿基互補(bǔ)。A A和和T T之間形成之間形成兩個(gè)氫兩個(gè)氫鍵鍵，G G與與C C之間形成之間形成三三個(gè)氫鍵個(gè)氫鍵。 雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)關(guān)系。關(guān)系。 ( () )DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提出的生物學(xué)意雙螺旋結(jié)構(gòu)提出的生物學(xué)意義義 該模型揭示了該模型揭示了DNADNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)堿基配對(duì)原則，原則，這這是是DNADNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦

60、是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ), ,它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。推動(dòng)了分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，被譽(yù)展的基石。推動(dòng)了分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，被譽(yù)為為2020世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)之一。世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)之一。n19621962年，沃森和克里克與莫里斯年，沃森和克里克與莫里斯威爾金斯一起因發(fā)現(xiàn)威爾金斯一起因發(fā)現(xiàn)DNADNA雙螺旋雙螺旋結(jié)構(gòu)贏得了諾貝爾獎(jiǎng)。結(jié)構(gòu)贏得了諾貝爾獎(jiǎng)。 ( () )雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素 DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下是很穩(wěn)定的，維持這雙螺旋結(jié)