第六章 免疫標(biāo)記技術(shù)

1、免疫標(biāo)記技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 沉淀反應(yīng) 凝集反應(yīng) 補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng) 中和反應(yīng)沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)中和反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)的不足 靈敏度 周期長(zhǎng) 可重復(fù)性 無(wú)法定量 無(wú)法定位 特異性差關(guān)鍵問(wèn)題免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique） 用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)分類：免疫酶技術(shù)(ng)、放射免疫技術(shù)(pg)、免疫熒光技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)、發(fā)光免疫測(cè)定。特點(diǎn)：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位第八章 免疫標(biāo)記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三

2、節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標(biāo)記技術(shù)第八章 免疫標(biāo)記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標(biāo)記技術(shù)一、放射免疫技術(shù) 二、免疫放射技術(shù) 第一節(jié)放射免疫技術(shù) 一、放射免疫技術(shù) 二、免疫放射技術(shù) 第一節(jié)放射免疫技術(shù) （一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)（一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay，RIA）（1977年獲諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）放射免疫技術(shù)的原理 RIA是以放射性同位素標(biāo)記抗原的一種競(jìng)

3、爭(zhēng)性免疫抑制試驗(yàn)（一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)（二）放射免疫技術(shù)的基本條件 1抗原標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)抗原 2放射性同位素 3特異性抗體 4常用的同位素標(biāo)記方法5B與F的分離技術(shù)1抗原標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)抗原 標(biāo)準(zhǔn)品是放免技術(shù)的定量依據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)品：與待測(cè)樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同 替代品：與待測(cè)樣品的結(jié)構(gòu)相似，但要與抗體的親和力相近，應(yīng)列出與真標(biāo)準(zhǔn)品的換算系數(shù)。2. 放射性同位素3. 特異性抗體 放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)具備：特異性高、親和力高（平衡常數(shù)K值大）、效價(jià)高（即抗血清高度稀釋時(shí)仍能迅速與抗原結(jié)合，極少解離，保證檢測(cè)的靈敏度） 4. 常用的

4、同位素標(biāo)記方法 氯胺T氧化標(biāo)記法 乳過(guò)氧化物酶標(biāo)記法 半抗原標(biāo)記法5. B與F的分離技術(shù)（1）雙抗體沉淀分離法（2）化學(xué)試劑分段沉淀分離法（3）固相法（4）吸附法 結(jié)合態(tài)標(biāo)記抗原B與游離態(tài)標(biāo)記抗原F能否有效地分離是放射免疫技術(shù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。分離劑的要求 能使B和F完全分離 不受外界因素的干擾 與游離抗原的非特異性作用盡可能小 操作簡(jiǎn)便、分離迅速、重復(fù)性好 來(lái)源廣，經(jīng)濟(jì)，便于使用（1）雙抗體沉淀分離法 優(yōu)點(diǎn)： 本法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定缺點(diǎn)： 易受免疫反應(yīng)液中其他蛋白質(zhì)或鹽的干擾，使非特異性吸附有較大變異，且第二抗體消耗量大。 加入第二抗體使微量抗原抗體復(fù)合物的分子加大，從而使原來(lái)不能用普通離心法沉淀

5、的抗原抗體復(fù)合物易于沉淀而分離。 （2）化學(xué)試劑分段沉淀分離法利用鹽類或有機(jī)化合物使反應(yīng)液中的-球蛋白在等電點(diǎn)沉淀，從而達(dá)到分離的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸銨等優(yōu)點(diǎn)： 試劑來(lái)源廣泛、 價(jià)格便宜缺點(diǎn)： 影響因素多（溫度、pH值、濃度等）（3）固相法 將測(cè)定用的第一抗體（或第二抗體）牢固地結(jié)合于固相載體表面，相應(yīng)抗原（或第一抗體）經(jīng)溫育被吸附，只要將固相表面洗滌即將B和F分離。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速 新的固相分離方法： 纖維固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法 可磁化顆粒固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法 試管固相法（4）吸附法 本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。 如：活性炭、硅鎂吸附劑、滑石粉等性質(zhì)：對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、藥物等具

6、有非特異性 吸附的能力應(yīng)用：在其表面包被一層白蛋白或右旋糖苷等 物質(zhì)時(shí)，將會(huì)限制大分子物質(zhì)的吸附。 沉 淀 中：吸附有游離的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗體復(fù)合物優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、分離迅速缺點(diǎn)：專一性不強(qiáng) （一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)（三）放射免疫技術(shù)的基本類型1液相法（1）平衡法（又稱一步法）（2）順序加樣法2固相法（1）競(jìng)爭(zhēng)法 Ag+Ag*+Ab-（2）改良法 Ag+Ag*+Ab+AntiAb-一、放射免疫技術(shù) 二、免疫放射技術(shù) 第一節(jié)放射免疫技術(shù) （一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技

7、術(shù)的基本類型二、免疫放射技術(shù)（一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技術(shù)的基本類型二、免疫放射技術(shù) 1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技術(shù)（immunoradiometric assay，IRMA） 標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過(guò)量的抗體，待測(cè)物（或標(biāo)準(zhǔn)品）和同位素標(biāo)記抗體全量反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高（可提高6-10倍）、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、檢樣量少缺點(diǎn)： 干擾因素較多、檢測(cè)儀器貴、有放射性污染免疫放射技術(shù)（immunoradiometric assay，IRMA）（一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技術(shù)的基本類

8、型二、免疫放射技術(shù)（二）免疫放射技術(shù)的基本條件 1標(biāo)記抗體的制備 2固相抗原免疫吸附劑（一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技術(shù)的基本類型二、免疫放射技術(shù)（三）放射免疫技術(shù)的基本類型1. 經(jīng)典IRMA法2. 雙抗體夾心法3. 二抗標(biāo)記法4. 雙標(biāo)記抗體法1. 經(jīng)典IRMA法2. 雙抗體夾心法標(biāo)記3. 二抗標(biāo)記法4. 雙標(biāo)記抗體法 雙標(biāo)記抗體是將兩種針對(duì)不同表位的抗體（Ab2、Ab3）標(biāo)記上不同的同位素，可以用不同的檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)定。放射分析技術(shù)方法學(xué)考核指標(biāo)第八章 免疫標(biāo)記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標(biāo)記技術(shù)一、免

9、疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) Albert Hewett Coons（19121978） 20世紀(jì)40年代Coons等首先用熒光素FITC標(biāo)記抗體，成功地檢測(cè)了小鼠肺臟組織內(nèi)存在的肺炎雙球菌多糖抗原，從而創(chuàng)建免疫熒光技術(shù)（ immuno-fluorescence technique ）。 一、免疫熒光技術(shù)的原理 三結(jié)合： 抗原抗體反應(yīng)的高度特異性 熒光的敏感可測(cè)性 顯微技術(shù)的高度精確性 優(yōu)點(diǎn)： 特異性強(qiáng)、敏感性高

10、、速度快，結(jié)果直觀，可以檢測(cè)和定位微量抗原 缺點(diǎn)： 熒光易發(fā)生淬滅，熒光染色標(biāo)本保存困難、易出現(xiàn)非特異性染色問(wèn)題，鏡檢結(jié)果判定客觀性不足一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 1. 熒光素 2. 熒光標(biāo)記物的制備 3. 熒光檢測(cè)儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件1. 熒光素 2. 熒光標(biāo)記物的制備 3. 熒光檢測(cè)儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件1熒光素 熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)熒光素的性質(zhì) 吸收光后電子躍遷 保持固有的熒光特性 熒 光 的 波 長(zhǎng) 總 是 大 于 激 發(fā) 光 波 長(zhǎng)（STOKES 法則） 熒光強(qiáng)度小于激發(fā)光的

11、強(qiáng)度熒光效率=發(fā)射光量子數(shù)/吸收光量子數(shù)100%熒光強(qiáng)度=吸收光量子數(shù)熒光效率熒光的種類自發(fā)熒光二次熒光非特異性熒光： 自發(fā)熒光 誘發(fā)熒光 酶誘發(fā)熒光熒光素選擇條件 熒光強(qiáng)度高且穩(wěn)定 能輕易與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價(jià)鍵 熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法應(yīng)簡(jiǎn)便、快速 產(chǎn)生的熒光顏色應(yīng)與自發(fā)熒光對(duì)比鮮明 結(jié)合物在一般貯存條件下性能穩(wěn)定，可保存較長(zhǎng)時(shí)間熒光素1. 熒光素 2. 熒光標(biāo)記物的制備 3. 熒光檢測(cè)儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件熒光標(biāo)記抗體的制備（1）攪拌標(biāo)記法（Marshall法）（2）半透膜透析標(biāo)記法（Clark法）熒光標(biāo)記抗體的純化（1）去除游離熒光素（2）去除未標(biāo)記和過(guò)度標(biāo)記的抗體熒光標(biāo)記抗體

12、的鑒定（1）抗體與熒光的活性鑒定（2）熒光素與蛋白質(zhì)的摩爾比值（F/P） 采用紫外分光比色法測(cè)定FITC（F）OD值和 蛋白質(zhì)（P）OD值以后，用以下公式計(jì)算F/P比值： F/P比值=（2.87OD495）/（OD2800.35OD495）（3）熒光抗體濃度的測(cè)定（4）熒光抗體特異性的鑒定：特異性吸收試驗(yàn)， 競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)1. 熒光素 2. 熒光標(biāo)記物的制備 3. 熒光檢測(cè)儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件3. 熒光檢測(cè)儀（1） 熒光顯微鏡 （2） 熒光分光光度計(jì)（1）熒光顯微鏡透射式落射式透射熒光顯微鏡原理低倍鏡較明亮，高倍鏡較暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的

13、視野背景。透射式不適用于非透明的被檢物體。落射式熒光顯微鏡激發(fā)濾光板 位于聚光鏡和光源之間，可濾過(guò)由熒光燈源發(fā)射出的其他光，只允許波長(zhǎng)為275480nm的紫外光（MG）和藍(lán)紫光（BG）通過(guò)，以激發(fā)熒光結(jié)合物發(fā)射熒光。汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G) 激發(fā)濾色鏡: 波長(zhǎng)選擇分色鏡:反射激發(fā)光,透過(guò)熒光 吸收濾色鏡:透過(guò)熒光,阻擋雜光落射熒光顯微鏡原理對(duì)透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明。（2）熒光分光光度計(jì) 用于掃描熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光

14、壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補(bǔ)體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補(bǔ)體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法1. 直接熒光抗體染色法優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單、快速、特異性高缺點(diǎn)： 檢測(cè)每種抗原需制備相應(yīng)抗體、敏感性差將熒光素標(biāo)記在特異性抗體上，直接檢測(cè)抗原1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補(bǔ)體熒光

15、染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法2. 間接熒光抗體染色法優(yōu)點(diǎn)： 敏感性高、一種二抗可檢測(cè)多種抗原抗體系統(tǒng)缺點(diǎn)： 干擾因素多、操作流程長(zhǎng)將熒光素標(biāo)記在第二抗體（抗抗體）上或標(biāo)記在SPA上，檢測(cè)與抗原結(jié)合的特異性抗體腫瘤組織中M2型巨噬細(xì)胞1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補(bǔ)體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法3. 補(bǔ)體熒光染色法優(yōu)點(diǎn)： 可檢測(cè)所有抗原抗體系統(tǒng)，具有通用性；敏感性高缺點(diǎn)： 操作過(guò)程較復(fù)雜，干擾因素多，易出現(xiàn)非特異性染色，補(bǔ)體易失活將熒光素標(biāo)記在補(bǔ)體的抗體上（抗C3抗體），檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗

16、體染色法 3. 補(bǔ)體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法4特殊染色法 （1 1）雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)（2 2）雙色免疫熒光技術(shù)（3 3）反襯染色法 （1）雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)在同一標(biāo)本中，可用兩種不同顏色的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，同時(shí)顯示兩種不同的細(xì)胞或同一細(xì)胞上不同的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）標(biāo)記Ab1 RB200或TRITC9（桔紅色熒光）標(biāo)記Ab2細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記熒光染色（2）雙色免疫熒光技術(shù) 如FITC標(biāo)記抗體和細(xì)胞核染色劑PI（紅色）DAPI（藍(lán)色） （3）反襯染色法 是用一種非特異染色來(lái)反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標(biāo)記BSA作為非特異性反襯標(biāo)記，用FI

17、TC標(biāo)記特異性抗體。一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 1. 流式細(xì)胞術(shù) 2. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)1. 流式細(xì)胞術(shù) 2. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)1. 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）又稱熒光激活細(xì)胞分類器 （fluorescing activating cell sorter，F(xiàn)ACS）流式細(xì)胞儀原理物理參數(shù)分析FSCSSC細(xì)胞分類單參數(shù)數(shù)據(jù)分析細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定三參數(shù)數(shù)據(jù)分析1. 流式細(xì)胞術(shù) 2

18、. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)2. 熒光偏振免疫分析技術(shù)（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA） 利用熒光素經(jīng)單一波長(zhǎng)的偏振光照射后，吸收光能并發(fā)射出相應(yīng)的偏振熒光，其強(qiáng)弱程度與熒光分子的顆粒大小呈正相關(guān)。 反應(yīng)系統(tǒng)中同時(shí)加入待測(cè)藥物、一定量的熒光素標(biāo)記的相應(yīng)藥物（小分子）和抗藥物抗體，使待測(cè)藥物和熒光素標(biāo)記藥物與有限量的特異性抗體（大分子）進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。熒光偏振光分析儀Transcreener UDP2 FP AssayFPIA技術(shù)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)本可直接用于測(cè)定樣品用量少測(cè)定時(shí)間短精密度高缺點(diǎn)：儀器價(jià)格昂

19、貴藥品試劑盒專用性強(qiáng)不易普及應(yīng)用1. 流式細(xì)胞術(shù) 2. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)3. 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TrFIA） 是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)（強(qiáng)度高、衰變時(shí)間長(zhǎng)），用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。實(shí)驗(yàn)原理類線光譜： 有利于降低本底熒光強(qiáng)度，提高分辨率較大的Stokes位移： 有利于排除非特異熒光的干擾，增強(qiáng)測(cè)量的特異性螯合物： 熒光強(qiáng)度高，壽命長(zhǎng)，有利于消除樣品及環(huán)境中熒光物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 分析速

20、度快、標(biāo)記物制備較簡(jiǎn)便、標(biāo)記物有效使用期長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)第八章 免疫標(biāo)記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標(biāo)記技術(shù)一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 酶催化反應(yīng)原理酶催化反應(yīng)的兩種基本形式： E+S（ES） E+P E+S（ES） + D1 E + P + D2E：酶 S：酶作用的底物P：底物分解后的產(chǎn)物（有色化合物）D1：供氫體 D2：為D1的氧化型

21、（有色化合物）酶免疫技術(shù)（enzyme immunoassay，EIA）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，易掌握和推廣；試劑易制備，且穩(wěn)定保存期長(zhǎng)；結(jié)果可肉眼觀察，也可用儀器定量檢測(cè)，且儀器價(jià)格較低廉。缺點(diǎn)：檢測(cè)可溶性樣品，靈敏度和重復(fù)性不及放免疫測(cè)定法；免疫組化中，易受細(xì)胞內(nèi)源性酶的干擾，直觀性比熒光免疫染色法差。一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標(biāo)記酶2酶標(biāo)記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標(biāo)檢測(cè)儀二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標(biāo)記酶2酶標(biāo)記物的制備3酶底物的選擇4 .

22、 固相載體的選擇5 . 酶標(biāo)檢測(cè)儀1. 標(biāo)記酶 辣根過(guò)氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP）堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP）葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu）-D-半乳糖苷酶 （-D-galactosidase，-D-Gal）二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標(biāo)記酶2酶標(biāo)記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標(biāo)檢測(cè)儀酶標(biāo)記物的制備 免疫酶結(jié)合物： 酶標(biāo)記抗原的制備酶標(biāo)記抗體的制備戊二醛交聯(lián)法即將標(biāo)記酶通過(guò)具有雙功能或多功能化學(xué)基團(tuán)的交聯(lián)劑連接到抗原或抗體分子上。過(guò)碘酸氧化交聯(lián)法 將酶分子氧化產(chǎn)生活性基團(tuán)，再與抗

23、原或抗體分子結(jié)合，使之成為與相應(yīng)靶分子具有特異性結(jié)合活性的酶標(biāo)抗原或抗體。 二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標(biāo)記酶2酶標(biāo)記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標(biāo)檢測(cè)儀3. 酶底物的選擇二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標(biāo)記酶2酶標(biāo)記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標(biāo)檢測(cè)儀4. 固相載體的選擇 ELISA法最常用的固相載體： 要求：蛋白質(zhì)吸附性能強(qiáng)、吸附后不影響抗原抗體的活性、價(jià)格低廉、形狀可塑 聚苯乙烯吸附性能好、透明度好 聚氯乙烯質(zhì)軟板薄，容易剪割，價(jià)廉，吸附性能高于聚苯乙烯，但光潔度稍差、空白值也略高 硝酸纖維素膜及微孔濾膜用于快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)酶標(biāo)板種類 高結(jié)

24、合力酶標(biāo)板（表面處理）400-500ng IgG/cm2 MW10kD 中結(jié)合力酶標(biāo)板（疏水鍵結(jié)合）200-300ng IgG/cm2 MW20kD 氨基化酶標(biāo)板（表面正電荷氨基）100ng/cm2 小分子蛋白蛋白的包被（coating） pH9.6的碳酸鹽緩沖液 4度 過(guò)夜 1%-5% BSA blocking 低溫保存二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標(biāo)記酶2酶標(biāo)記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標(biāo)檢測(cè)儀一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 三、免疫酶技術(shù)的類型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked

25、 immunosorbent，ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）1. 直接法2. 間接法3. 夾心法4. 競(jìng)爭(zhēng)法5. 抗酶抗體法ELISA的檢測(cè)類型1. 直接法2. 間接法3. 夾心法Additional Materials RequiredTypical Standard Curve4. 競(jìng)爭(zhēng)法5. 抗酶抗體法ELISA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 蛋白的包被：載體、蛋白濃度、溫度、時(shí)間 封阻：BSA、血清、脫脂奶粉 洗滌：生理鹽水、PBS、Tris-HCl 酶結(jié)合物的濃度：標(biāo)準(zhǔn)為OD值1.0 標(biāo)本的選擇 結(jié)果判斷一、酶免疫技術(shù)的原

26、理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 1. 酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定法 2. IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 3. 斑點(diǎn)ELISA4. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法四、ELISAELISA方法的發(fā)展1. 酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定法（enzyme linked fluorescence immunoassay，ELFIA） 熒光底物使ELISA的檢測(cè)極限提高了幾十倍，達(dá)到渺克（ag=10-18g）水平2. IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)3. 斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA） 采用硝酸纖維素膜（NC膜）作為固相載體，將抗原點(diǎn)加于膜上，干燥后以BSA-PBS封閉，然后

27、滴加待檢血清和酶標(biāo)抗體，反應(yīng)后，滴加底物溶液，當(dāng)膜上呈現(xiàn)肉眼可見的著色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性反應(yīng)，本法常作為定性檢測(cè)。4. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme linked immunospot，ELISPOT）第八章 免疫標(biāo)記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標(biāo)記技術(shù)一、生物素-親和素放大系統(tǒng)二、免疫分析技術(shù)中的通用系統(tǒng) SPA通用系統(tǒng)三、免疫金溶膠技術(shù)第四節(jié)其他免疫標(biāo)記技術(shù) 一、生物素-親和素放大系統(tǒng)二、免疫分析技術(shù)中的通用系統(tǒng) SPA通用系統(tǒng)三、免疫金溶膠技術(shù)第四節(jié)其他免疫標(biāo)記技術(shù) 生物素-親合素系統(tǒng)（Biotin-avidin system，BAS） 198

28、0年，Hsu首先用生物素親合素化酶進(jìn)行組織化學(xué)研究 1983年，Yolken和Kendall首次用BAS與ELISA相結(jié)合檢測(cè)特異性抗原和抗體，并獲得成功 BSA與酶、同位素、熒光素等標(biāo)記技術(shù)有機(jī)結(jié)合，可使各種示蹤免疫分析的靈敏度進(jìn)一步提高，可用于微量蛋白分子的定量檢測(cè)。生物素（biotin，B）生物素分子式為C10H16O3N2S，分子量為244.31，pI為3.5。可從含量較高的卵黃（型）和肝組織（型）中提取，也可合成。親合素（avidin，A） A是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白 pI 1010.5 MW68,000 由4個(gè)亞單位組成Ka = 1015mol/L1個(gè)A與4個(gè)B結(jié)合又稱卵白

29、蛋白、抗生物素鏈霉親和素（streptavidin，SA） 在結(jié)構(gòu)上因不含有任何糖基，因此在測(cè)定中的非特異性遠(yuǎn)低于親合素。 SA是由Streptomyces avidin菌分泌的一種略偏酸性蛋白質(zhì) MW 65,000 pI 6.0 SA不含任何糖基Ka = 1015mol/L1個(gè)A與4個(gè)B結(jié)合生物素-親合素標(biāo)記技術(shù) 生物素的活化 生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯（BNHS）羧基與蛋白質(zhì)賴氨酸上的氨基以酰胺鍵偶聯(lián)、常用于標(biāo)記抗體及中性偏堿的抗原長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）更易與抗體、酶等生物大分子結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)生物素酰肼（BHZ）主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白 生物素標(biāo)記物 活化生物素可偶聯(lián)抗體、酶、蛋白

30、質(zhì)、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用直接法間接法親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合體法一、生物素-親和素放大系統(tǒng)二、免疫分析技術(shù)中的通用系統(tǒng) SPA通用系統(tǒng)三、免疫金溶膠技術(shù)第四節(jié)其他免疫標(biāo)記技術(shù) SPA的發(fā)現(xiàn) 1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)中出現(xiàn)沉淀線1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細(xì)菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A，SPA)Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為假免疫反應(yīng)生產(chǎn)SPA的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株:Cow