基因編輯技術(shù)

1、基因編輯技術(shù)產(chǎn)生背景定義及原理分類及比較CRISPR的優(yōu)點(diǎn)及在植物育種上的應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)的一般操作程序全基因組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善大型基因組注釋項(xiàng)目的實(shí)現(xiàn)基因革命（基礎(chǔ)科學(xué)與個(gè)性化醫(yī)療之間進(jìn)行轉(zhuǎn)化）將大量數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為功能和臨床相關(guān)知識(shí)解決這個(gè)問題最核心的是需要有高效、可靠的方法使研究者能夠知道基因型如何影響表型利用同源重組機(jī)制對(duì)基因進(jìn)行定向失活是為基因功能評(píng)估提供信息的有力手段。但是這一技術(shù)的應(yīng)用有幾個(gè)限制因素，包括遺傳工程組件插入目標(biāo)位點(diǎn)的效率低、篩選過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力、有可能產(chǎn)生不利的突變效應(yīng)等。RNAi基因靶向敲除技術(shù)給研究者提供了快捷、廉價(jià)而且可以開展高通量研究的新方法，但是

2、， RNAi的基因敲除效果還不夠徹底，每次試驗(yàn)以及每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有差異，另外還存在不可預(yù)知的脫靶情況，所以只能夠用于需要暫時(shí)抑制基因功能的試驗(yàn)當(dāng)中?；蚓庉嫾夹g(shù)（近十年出現(xiàn)）:可以幫助科研人員對(duì)各種細(xì)胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進(jìn)行人工操作ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering一、基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生背景一、基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生背景2014年3月12日，賓夕法尼亞大學(xué)Pablo Tebas教授團(tuán)隊(duì)在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志撰文稱，他們利用Sangamo BioSciences開發(fā)的ZFNs基因編輯技術(shù)，顯著

3、提高了艾滋病患者對(duì)艾滋病毒的抵抗能力。1、在不同人種之間，自由在不同人種之間，自由“切換切換”基因編輯技術(shù)首次應(yīng)用于臨床。目前Sangamo BioSciences基于ZFNs技術(shù)治療艾滋病的方法已經(jīng)進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)。免疫細(xì)胞表面的CCR5蛋白是HIV進(jìn)入免疫細(xì)胞的“入口”。而少數(shù)北歐人由于CCR5基因“變異”（來源于原始高加索人），具備天然的HIV抵抗力?！耙话鸦颊叩腃CR5基因都改成高加索人種那種類型吧”！2、“關(guān)閉關(guān)閉”一個(gè)基因，打開生命之門一個(gè)基因，打開生命之門2015年11月5日，Waseem Qasim對(duì)外宣布，他們利用Cellectis公司經(jīng)TALENs基因編輯技術(shù)改造的UC

4、ART19細(xì)胞株，成功緩解了Layla的不治之癥-急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL），造就了世界首例嬰兒白血病治療奇跡，是基因編輯技術(shù)有史以來第二次被運(yùn)用在人體上技術(shù)。修改捐贈(zèng)細(xì)胞使其抗癌：修改捐贈(zèng)細(xì)胞使其抗癌：蕾拉的生命獲救得益于基因工程修改過的血液細(xì)胞。捐贈(zèng)的血液細(xì)胞來自美國(guó)，科學(xué)家總共對(duì)其進(jìn)行了三次修改。科學(xué)家們首先在捐贈(zèng)的血液細(xì)胞中添加抗白血病基因，這些基因可編碼靶向并殺死癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，其次科學(xué)家使用TALENs技術(shù)關(guān)閉兩個(gè)基因，關(guān)閉第一個(gè)基因是為了確保捐贈(zèng)的細(xì)胞不被蕾拉的身體排斥，關(guān)閉第二個(gè)基因是為了確保捐贈(zèng)細(xì)胞不被治療藥物殺死。http:/ Bosley在劍橋大學(xué)召開的EmTech大

5、會(huì)上宣布，實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)表明，CRISPR基因編輯技術(shù)可以用于治療Leber congenital amaurosis（LCA；利伯先天性黑朦病，一種遺傳性視力衰退疾?。?，Editas將在2017年開展CRISPR基因編輯人體實(shí)驗(yàn)。Editas宣布的2017年人體實(shí)驗(yàn)激動(dòng)人心之處在于，這有可能是首次體內(nèi)（in vivo）基因編輯試驗(yàn)。這項(xiàng)研究成功的意義在于，將CRISPR基因編輯“工具”裝載到病毒體內(nèi)，再把病毒注射到患處，CRISPR可以自行對(duì)患病部位進(jìn)行基因改造。那么以后治療Layla那樣的白血病，不用分離T細(xì)胞了，直接將改造好的病毒注射到骨髓，就直接將基因異常的骨髓修復(fù)了，或者是直接整合目標(biāo)基

6、因加強(qiáng)其戰(zhàn)斗力。這樣一來，很多大手術(shù)就會(huì)變成微創(chuàng)手術(shù)，帶來的好處是難以估量的。Editas的CEO Katrine Bosley二、二、什么是基因組編輯技術(shù)什么是基因組編輯技術(shù) 所謂基因編輯技術(shù)，是指對(duì)DNA核苷酸序列進(jìn)行刪除和插入等操作，換句話說，基因編輯技術(shù)使得人們可以依靠自己的意愿改寫DNA這本由脫氧核苷酸書寫而成的生命之書。基因編輯技術(shù)的原理基因編輯技術(shù)的原理 構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系修復(fù)系統(tǒng)統(tǒng)修復(fù)過程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。 DNA修復(fù)系統(tǒng)主要通過兩種途徑修復(fù)DNA雙鏈斷裂（double-strand

7、break, DSB）,即非同源末端連接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和同源重組（homologous recombination, HR）。通過這兩種修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造的目的，即基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因1）基因敲除）基因敲除：如果想使某個(gè)基因的功能喪失，可以在這個(gè)基因上產(chǎn)生DSB，NHEJ修復(fù)的過程中往往會(huì)產(chǎn)生DNA的插入或刪除（indel），造成移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。2）特異突變引入：）特異突變引入：如果想把某個(gè)特異的突變引入到基因組上，需要通過同源重組來實(shí)現(xiàn)，這時(shí)候要提供一個(gè)含有特異突變同源模版。正常情況下

8、同源重組效率非常低，而在這個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生DSB會(huì)極大的提高重組效率，從而實(shí)現(xiàn)特異突變的引入。3）定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因）定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因：與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個(gè)轉(zhuǎn)基因，這個(gè)轉(zhuǎn)基因在DSB修復(fù)過程中會(huì)被拷貝到基因組中，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因。三、基因編輯技術(shù)的分類三、基因編輯技術(shù)的分類第一代人工核酸內(nèi)切酶：鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，鋅指是一類能夠結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)，人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子中大約有一半含有鋅指結(jié)構(gòu)，ZFN是將鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合形成的核酸內(nèi)切酶，利用它可以在各種復(fù)雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。第二代人工核酸內(nèi)

9、切酶：類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN)的出現(xiàn)在很大程度上替代了ZFN。 TALEN可以和ZFN一樣對(duì)復(fù)雜的基因組進(jìn)行精細(xì)的修飾，同時(shí)其構(gòu)建較為簡(jiǎn)單，特異性更高，因此受到了科研工作者的青睞。2012年，TALEN被科學(xué)雜志評(píng)為十大科學(xué)突破之一。第三代人工核酸內(nèi)切酶：規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列-Cas蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9)，主要是基

10、于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單、成本低、作用高效。圖B：鋅指核酸酶二聚體與 DNA結(jié)合示意圖。鋅指核酸酶的靶序列含有兩個(gè)鋅指蛋白結(jié)合位點(diǎn)，不過這兩個(gè)位點(diǎn)之間還有一段57bp的間隔序列，鋅指核酸酶里的Fok I酶切結(jié)構(gòu)域就能夠切割這段間隔序列。當(dāng)然，我們也可以設(shè)計(jì)出只能夠識(shí)別左側(cè)或者右側(cè)結(jié)合位點(diǎn)的鋅指蛋白。ZFN： Cys2His2鋅指蛋白 圖A：一個(gè)鋅指大約由30個(gè)氨基酸組成，形成了一種保守的結(jié)構(gòu)。在鋅指螺旋結(jié)構(gòu)表面的那幾個(gè)氨基酸能夠與DNA大溝上的3個(gè)堿基結(jié)合，不過這種結(jié)合的選擇性會(huì)有所差異。 因?yàn)橛辛烁叨缺Ｊ氐逆溄有蛄?，我們就可以設(shè)計(jì)出能夠識(shí)別918個(gè)堿基長(zhǎng)度的DNA

11、序列。在一段 680億個(gè)堿基組成的DNA序列里，18個(gè)堿基組成的序列就足以成為一段特異性的序列，所以如果能夠設(shè)計(jì)出含有3種以上的鋅指蛋白DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域的蛋白，那么就意味著科學(xué)家們能夠利用鋅指蛋白識(shí)別出人類基因組里的任意一段DNA序列。 TALE蛋白中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由一連串3335個(gè)氨基酸組成的重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成的，其中每一個(gè)結(jié)構(gòu)域都能夠識(shí)別一對(duì)堿基。TALE核酸酶的DNA結(jié)合特異性主要由兩個(gè)高度可變的氨基酸決定，科學(xué)家們將這兩個(gè)關(guān)鍵的氨基酸稱作重復(fù)可變雙氨基酸殘基位點(diǎn)（repeat-variable di-residues, RVD）。 與鋅指結(jié)構(gòu)域一樣，這種TALE重復(fù)模塊也能夠串聯(lián)起來

12、，識(shí)別一長(zhǎng)串的DNA序列。 TALEN分子比ZFN大得多，因此很難高效導(dǎo)入，科學(xué)家們也想出了不少的辦法，如金門分子克隆技術(shù)（Golden Gatemolecular cloning） 。 TALENCRISPR/Cas系統(tǒng)系統(tǒng)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對(duì)序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與Cas 蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別靶序列上的PAM 以及protospacer 根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)這一特性，將其用于設(shè)計(jì)人工的核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease，EEN)，用來對(duì)我們感興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾 三類CRISPR/Ca

13、s 系統(tǒng)中Type型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對(duì)簡(jiǎn)單，除crRNA 和tracrRNA 外，只有Cas9 一個(gè)蛋白目前，產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的Type型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶。其基因座結(jié)構(gòu)可分為三部分三部分：5 端為tracrRNA 基因，中間為一系列Cas蛋白編碼基因，包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3 端為CRISPR 基因座，由啟動(dòng)子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復(fù)序列(direct repeats)順序排列組成。CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)的基因座結(jié)構(gòu)CRISPR/Cas的作用機(jī)理的作用機(jī)理（分

14、為三個(gè)階段來理解）：PhasePhasePhase噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer，通常protospacer 的5 或是3 端延伸幾個(gè)堿基序列很保守，被稱為PAM(protospacer adjacent motifs)，它的長(zhǎng)度一般為25堿基，一般與protospacer 相隔14 堿基新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA 潛在的PAM，將臨近PAM 的序列作為候選protospacer；然后在CRISPR 基因座的5端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間(圖2)。目前只有第一個(gè)步驟被證實(shí)。第一，CRISPR的高度

15、可變間隔區(qū)的獲得第二，CRIPSR 基因座的表達(dá)（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工）：多個(gè)研究表明CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 單元，這些小RNA 即為成熟crRNA，由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成， Type型CRISPR/Cas系統(tǒng)crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNase參與以外，還需要tracrRNA的指導(dǎo) ；第三，是CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干擾：成熟的crRNA 與特異的Cas 蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物，再與外源DNA結(jié)合并掃描到外源DNA

16、，尋找其上的靶序列，crRNA 的間隔序列與靶序列互補(bǔ)配對(duì)，外源DNA 在配對(duì)的特定位置被核糖核蛋白復(fù)合物切割早期研究認(rèn)為crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA 的靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)配對(duì)對(duì)于切割是必需的，但是后來的研究證明spacer 與protospacer 部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)切割也可以發(fā)生。2013年Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, Carlos F. Barbas. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 09 Ma

17、y 2013; DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比較功能結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)： ZFNs、TALENs人工核酸酶的原理是一樣的，都是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合而成，以二聚體形式發(fā)揮功能且只需要蛋白質(zhì)元件。序列特異性由每條多肽的DNA結(jié)合域決定，剪切由FokI酶結(jié)構(gòu)域決定。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一個(gè)單體蛋白和一個(gè)嵌合的RNA構(gòu)成，序列特異性由gRNA中20個(gè)堿基序列決定，剪切由Cas9蛋白執(zhí)行。設(shè)計(jì)難度：設(shè)計(jì)難度：由于鋅指蛋白與DNA互作的復(fù)雜性以及序列特異性的進(jìn)一步限制，一般認(rèn)為ZFNs的設(shè)計(jì)比

18、較困難， 成本昂貴，而且其專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。商業(yè)化的ZFNs較使用公共資源設(shè)計(jì)的ZFNs效果好，但是貴得多(比如美國(guó)的Sangamo Biosciences（Richmond, CA, USA）公司和美國(guó)SigmaAldrich（St. Louis, MO, USA）公司合作，開發(fā)出的一套名為CompoZr的鋅指蛋白構(gòu)建系統(tǒng)）。 TALENs要更容易設(shè)計(jì)一些，因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)重復(fù)與DNA序列間有一對(duì)一的識(shí)別規(guī)則，而且高效的DNA組裝技術(shù)，如Golden Gate克隆，簡(jiǎn)化了TALENs元件的組裝，然而TALENs基于的高度重復(fù)序列會(huì)促使體內(nèi)發(fā)生同源重組。目前也出現(xiàn)了商業(yè)化的人工TALEN

19、文庫(kù)，比如法國(guó)巴黎的Cellectis Bioresearch公司（一個(gè)未經(jīng)驗(yàn)證的定制TALEN的價(jià)格是3360美元，驗(yàn)證過的是5000美元）、美國(guó)的Transposagen Biopharmaceuticals公司（Lexington, KY, USA）和生命科技公司（Life Technologies, Grand Island,NY, USA）都提供這類服務(wù)。相較而言， gRNA引導(dǎo)的剪切只依賴于與目標(biāo)DNA序列進(jìn)行簡(jiǎn)單的Watson-Crick堿基配對(duì)，因此不需要對(duì)每個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程改造，而僅需修改gRNA中20個(gè)堿基序列來識(shí)別不同的目標(biāo)位點(diǎn)。靶標(biāo)：靶標(biāo)： ZFNs理論上

20、可以靶定任何序列，但實(shí)際上，目標(biāo)的選擇受限于模塊的可行性（基于序列依賴的組裝平臺(tái)合成）。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)，基因組DNA序列上平均每100bp就可制備1個(gè)功能性ZFNs。 TALENs靶標(biāo)受限于需要第一個(gè)堿基是胸腺嘧啶，另外，不是所有的TALENs都能在體外有效工作，而且一些還不能產(chǎn)生預(yù)期的突變，這就意味著每個(gè)TALEN對(duì)都需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。比較而言， CRISPR/Cas9系統(tǒng)理論上僅需在目標(biāo)位點(diǎn)上游含有NGG（或NAG）PAM模體，但是，不能完好匹配的間隔序列可能會(huì)引起脫靶剪切，因此gRNA的序列必須仔細(xì)設(shè)計(jì)，以避免脫靶發(fā)生，因此實(shí)際上能剪切的目標(biāo)位點(diǎn)會(huì)有所減少。 Xie et al.利用哺乳

21、動(dòng)物的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分析表明，在8個(gè)代表性植物（擬南芥、蒺藜狀苜蓿、大豆、番茄、短柄草、水稻、高粱、玉米）的基因組中，每100bp可鑒定到5-12個(gè)NGG-PAM，PAMs的數(shù)量與基因組大小相關(guān)，相同基因組大小的單子葉植物較雙子葉植物含有更多的特異gRNA。除玉米外，可以設(shè)計(jì)特異gRNA編輯85%-99%的已注釋轉(zhuǎn)錄單元，其中68%-96%的轉(zhuǎn)錄單元含有至少10個(gè)不同的可定位NGG-PAM位點(diǎn)；玉米是8個(gè)物種中基因組最大、被注釋的基因數(shù)最多的物種，僅30%的轉(zhuǎn)錄單元可以設(shè)計(jì)特異的gRNA進(jìn)行編輯，這與基因組的復(fù)雜性和序列結(jié)構(gòu)相關(guān)?？梢灶A(yù)測(cè)，小麥、大麥等基因組比玉米更

22、大的物種可能會(huì)面臨相同的問題。但是，將來通過使用與有不同PAM要求的Cas9同源蛋白，可以拓展CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因組中的應(yīng)用范圍。CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比較 剪切特點(diǎn)剪切特點(diǎn)： ZFNs和TALENs均攜帶限制性內(nèi)切酶FokI的活性域，能夠產(chǎn)生帶有粘性末端的一個(gè)DSB，其依據(jù)連接子和間隔子的差異而有不同的長(zhǎng)度。Cas9有兩個(gè)剪切域RuvC和HNH，在目標(biāo)DNA序列PAM上游3個(gè)堿基處進(jìn)行剪切，產(chǎn)生平齊末端（在體外， Cas9偶爾也能產(chǎn)生1-2個(gè)堿基的粘性末端）。特定的粘性末端對(duì)于DNA分子的精細(xì)插入十分有益，它由NHEJ介導(dǎo)相容末端連接完成。利用好雙切口

23、酶方法， CRISPR/Cas9系統(tǒng)也能產(chǎn)生這樣的結(jié)構(gòu)。 效率效率： CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中可實(shí)現(xiàn)高突變率，效率與ZFNs和TALENs相當(dāng)或更高。突變的效率受目標(biāo)序列差異、gRNA的序列或結(jié)構(gòu)、Cas9的版本（不同物種的密碼子優(yōu)化）和gRNA的表達(dá)策略等影響。而且報(bào)道的突變率與分析方法的靈敏性有關(guān)，所以并不奇怪對(duì)于相同物種不同人報(bào)道的突變率差異較大。CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比較四、四、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì) 簡(jiǎn)單（Simplicity）、易獲取Accessibility 低成本（Cost）、用途廣（versatility）區(qū)別于ZFNs

24、和TALENs，不需要蛋白質(zhì)工程，因此針對(duì)每個(gè)目標(biāo)基因可檢測(cè)多個(gè)gRNA，更加直接；不需要克隆，針對(duì)不同的目標(biāo)特異性僅需改變gRNA的20個(gè)堿基；任意數(shù)量的gRNA都可以通過體外轉(zhuǎn)錄法，利用兩條互補(bǔ)的退火寡核苷酸鏈制備而成；大型gRNA庫(kù)的組裝因此并不昂貴，從而使CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應(yīng)用于高通量功能基因組學(xué)研究，而且任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都承擔(dān)得起基因組編輯的預(yù)算費(fèi)用。區(qū)別于ZFNs和TALENs， CRISPR/Cas9系統(tǒng)能剪切人類細(xì)胞中的甲基化DNA，從而進(jìn)行遺傳修飾，這是其它核酸酶無法實(shí)現(xiàn)的。 植物中，這一方面還沒有進(jìn)行專門研究，但是有理由相信剪切甲基化DNA是 CRISPR/

25、Cas9系統(tǒng)所特有的，并且與目標(biāo)基因組無關(guān)。 植物中大約70%的CpG/CpNpG都是甲基化的，尤其是在啟動(dòng)子區(qū)及第一個(gè)外顯子區(qū)的CpG島。因此，總體來說， CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)于植物的基因組編輯更具通用性，尤其適合于GC含量高的單子葉植物基因組，如水稻。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)較ZFNs和TALENs，最主要的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)是易于多位點(diǎn)編輯，即同時(shí)在多個(gè)位點(diǎn)引入DSBs，從而同時(shí)編輯多個(gè)基因。尤其有利于對(duì)冗余基因或代謝路徑進(jìn)行敲除。 相同的策略還可用于在同一染色體的兩個(gè)相距較遠(yuǎn)的剪切位點(diǎn)間引入大片段缺失或遺傳轉(zhuǎn)換。 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行多位點(diǎn)

26、編輯僅需要單個(gè)Cas9蛋白和多個(gè)不同序列特異性的gRNA，相反，使用ZFNs或TALENs進(jìn)行多位點(diǎn)編輯需要針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)特異性的不同二聚體蛋白。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)CRISPR研究界實(shí)施的開放獲取政策也促進(jìn)了這一技術(shù)的快速傳播和應(yīng)用。與ZFN平臺(tái)的所有權(quán)性質(zhì)不同， CRISPR研究界提供開放性的質(zhì)粒、網(wǎng)絡(luò)工具（用于篩選gRNA序列以及預(yù)測(cè)特異性），同時(shí)主持活躍的討論組。這些設(shè)施機(jī)構(gòu)鼓勵(lì)更多人利用這一技術(shù)，進(jìn)而促進(jìn)了對(duì)其更深的了解與應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)CRISPR/Cas9的特異性（relaxed specificity） CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的一個(gè)爭(zhēng)議是

27、早期報(bào)道的相對(duì)較高的脫靶突變，隨后研發(fā)出了一些策略來減少脫靶編輯發(fā)生 最重要的是謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)gRNA（gRNA的脫靶效應(yīng)可以快速、便宜的檢測(cè)出來） 優(yōu)化核酸酶的表達(dá)（高濃度的Cas9和gRNA可以提高脫靶效應(yīng)） 采用突變的Cas9蛋白版本，將其轉(zhuǎn)化為切口酶，使用兩個(gè)Cas9切口酶可以引入偏移的單鏈缺口，產(chǎn)生一個(gè)交錯(cuò)的DSB，這個(gè)策略提高了識(shí)別堿基的特異性 失活的Cas9與FOKI融合 改變gRNA的長(zhǎng)度 脫靶效應(yīng)在相同物種的不同細(xì)胞類型中差異較大CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的研究及應(yīng)用歷史基因編輯技術(shù)的研究及應(yīng)用歷史1987年，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列（CRISPR）2005年，推測(cè)CRISPR

28、的生物功能（與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵的免疫系統(tǒng)有關(guān)）2007年，證實(shí)CRISPR序列與Cas基因結(jié)合抵抗病毒入侵，由此揭開了研究CRISPR作用機(jī)制的序幕（2008-2011年）2012年， CRISPR/Cas系統(tǒng)開始由生物現(xiàn)象發(fā)展為基因組編輯工具-只要改變crRNA的20個(gè)核苷酸就可以簡(jiǎn)單地對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行重新編程，而且crRNA的定位特異性與tracrRNA的結(jié)構(gòu)性能可以相結(jié)合組成一個(gè)嵌合的單條引導(dǎo)RNA（gRNA），從而將三元系統(tǒng)三元系統(tǒng)簡(jiǎn)化為二元系統(tǒng)二元系統(tǒng)。五、五、CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用基因編輯技術(shù)的應(yīng)用2013年至今， CRISPR/Cas系統(tǒng)逐漸被廣泛應(yīng)

29、用：（ CRISPR/Cas熱潮）在植物中，2013年，5個(gè)獨(dú)立的研究小組證實(shí)二元件系統(tǒng)在真核生物（人、鼠、斑馬魚）中具備功能性，而且攜帶不同序列的多個(gè)gRNA能夠同時(shí)在不同位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效的多重基因組編輯-說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個(gè)簡(jiǎn)單、成本低、作用廣的基因編輯工具。2013年8月，5篇報(bào)道首次討論了CRISPR/Cas9基因編輯在擬南芥、煙草、水稻中的應(yīng)用，隨后的研究（2013-2014年）也報(bào)道了其在大豆、小麥、玉米、西紅柿等植物中的應(yīng)用。其中，4個(gè)獨(dú)立的小組發(fā)現(xiàn)， CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在水稻和西紅柿轉(zhuǎn)化體的第一代就直接引入等位或同源突變，說明其在這兩個(gè)物種中尤其高效。此外

30、，在擬南芥、水稻、西紅柿中， Cas9/ gRNA系統(tǒng)誘導(dǎo)的遺傳變化出現(xiàn)在生殖細(xì)胞系，在隨后的世代中會(huì)正常分離而不會(huì)進(jìn)一步被修飾。植物育種中的應(yīng)用和建議 傳統(tǒng)的育種依賴于既有的自然遺傳變異，而且需要進(jìn)一步的回交才能將選擇的目標(biāo)性狀導(dǎo)入優(yōu)良背景里。因此，自然界中可用的有利變異限制了育種能達(dá)到的效果。新的變異可以通過隨機(jī)突變獲得，但是需要對(duì)大量群體，花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行篩選才能鑒定出具有期望表型的突變。 基因編輯可以對(duì)優(yōu)良遺傳背景直接進(jìn)行精準(zhǔn)、可預(yù)期的修飾，從而加快育種程序，由于可以同時(shí)對(duì)多性狀進(jìn)行修飾， CRISPR/Cas9系統(tǒng)尤其有效。NHEJ介導(dǎo)的基因敲除是定點(diǎn)修飾最簡(jiǎn)單的應(yīng)用。如用于剔除降低

31、糧食品質(zhì)的基因、給予致病菌敏感性、轉(zhuǎn)換代謝流以獲得有價(jià)值的眾產(chǎn)品等.利用寡核苷酸供體序列進(jìn)行特定核苷酸的精準(zhǔn)替換能用于修飾調(diào)控農(nóng)藝性狀基因的DNA序列，進(jìn)而提高作物產(chǎn)量有NHEJ或HR介導(dǎo)的大片段插入，能夠在特定位點(diǎn)引入提高轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)基因，而不影響內(nèi)源基因的活性。植物育種中的應(yīng)用和建議位點(diǎn)特異的核酸酶還可進(jìn)行定向分子性狀疊加。實(shí)現(xiàn)將多個(gè)目標(biāo)性狀導(dǎo)入作物中，同時(shí)分離的風(fēng)險(xiǎn)較低，這是傳統(tǒng)育種，甚至是轉(zhuǎn)基因育種都難以做到的。一旦疊加完成，整個(gè)的分子序列能通過雜交的方式轉(zhuǎn)移到其它種質(zhì)中，因?yàn)樗且詥挝稽c(diǎn)方式遺傳的。雖然使用位點(diǎn)特異性重組（ site specific recombination ）也能達(dá)到這一目的，但是使用可編程的核酸酶結(jié)合精準(zhǔn)的NHEJ或HR進(jìn)行定向整合不會(huì)留下與整合方式相關(guān)的任何痕跡，如loxP或attB序列。植物育種中的應(yīng)用和建議 雖然歐洲管理機(jī)構(gòu)判定轉(zhuǎn)基因作物的焦點(diǎn)是產(chǎn)生過程而非產(chǎn)品本身，由基因編輯技術(shù)如 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，切除幾個(gè)核苷酸而產(chǎn)生變化的植物仍有希望和信心不被劃定為轉(zhuǎn)基因作物使用可編程的核酸酶有幾種方法可以產(chǎn)生不含轉(zhuǎn)基因成分的突變植物。包括使用農(nóng)桿菌滲入法或病毒載體瞬時(shí)表達(dá)核酸酶組件以功能性gRNA和Cas9蛋白形式，或者將在不同染色體上的gRNA和Cas9基因合并在一起的形式，直接運(yùn)送到目標(biāo)位點(diǎn)，這樣就可以通過遺傳分離被移除。雖然如