慢性粒細胞白血病發(fā)病機制

1、慢性粒細胞白血病發(fā)病機制干細胞的定義和性質 如造血干細胞，干細胞特性是慢性粒細胞白血病干細胞的基本屬性。CML干細胞來源于獲得BCR-ABL突變的造血干細胞，能夠自我更新和保持惰性的CP。在這個階段，CML干細胞和分化的CML細胞功能、形態(tài)和表型幾乎沒有區(qū)別。 雖然自我更新的能力被認為是慢性粒細胞白血病干細胞的維持至關重要的，相關的機制和信號轉導途徑仍然不好定義。最近的研究表明，Wnt /-連環(huán)蛋白信號是維持正常和CML干細胞必不可少的。Hedgehog（Hh）信號已被證明為CML干細胞的擴增和維持是必要的；早幼粒細胞白血病蛋白（PML）在HSC維持中被證明起到關鍵作用。 CML患者干細胞和祖

2、細胞的表型與正常個體不同。例如，與正常祖細胞不同，血液循環(huán)大部分白血病的粒單核細胞集落形成單位（CFU-GMS）表達高水平的黏附受體CD44和低水平L-選擇素。白血病CD34 +細胞過度表達多藥耐藥表型的P糖蛋白。 許多抗凋亡蛋白是在CML中高表達，促進細胞耐藥。靜止期CD34+細胞表達過多Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1和XIAP。 造血干細胞的細胞的特點是細胞表面表達ABC轉運蛋白，特別是ABCB1（P-糖蛋白）和BCG2(BCR-P)，能泵出特異性藥物。上面2種轉運蛋白均在CP CML患者的原始細胞被發(fā)現(xiàn)與正常細胞相比過表達。在CP CML患者原始細胞和正常細胞相比Oct-1的表達減

3、少，其是一種負責特定藥物吸收的轉運蛋白，包括伊馬替尼。ABCB1、ABCG2的表達增加和Oct-1表達下降的組合可能造成CML祖細胞對治療的反應差。 花生四烯酸5-脂氧合酶基因（Alox15/15-LO）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個由BCR-ABL誘導的調節(jié)器，對伊馬替尼無反應，其對CML干細胞功能很重要。在缺乏 Alox15情況下，BCR-ABL不能誘導小鼠形成CML。此外，Alox15的缺失通過影響細胞分裂和細胞凋損傷LSC的功能，導致LSCs最終耗盡。在人類慢性粒細胞白血病細胞和CD34+細胞，Alox15的敲除或抑制15-LO均能顯著減少生存。Alox15的缺乏改變PTEN，PI3K/Akt和轉

4、錄因子ICSBP這些已知的癌癥發(fā)病介質的表達。 最近的研究表明，F(xiàn)oxO因子是維持CML啟動細胞的關鍵; FOXO的活性被BCR-ABL1-AKT信號負調控，被TKI治療和Pten正調控。但是，通過該FOXO3A介導自我更新和CML起始細胞的維持機制，目前仍不清楚。最近有研究確定了BCL6原癌基因作為在CML-起始細胞自我更新信號的FOXO下游的關鍵效應物。 BCL6抑制 CML細胞中Arf和p53，并且其是白血病起始和集落形成必需的。 Notch信號是造血干細胞的自我更新和生存的關鍵。有研究對BCR-ABL和Notch信號的關系及Notch的表達模式及其下游靶基因Hes1在慢性期CML患者以

5、及和正常人的骨髓中（NBM）CD34+干細胞和祖細胞進行了評估。發(fā)現(xiàn)在原始的CD34 +Thy+亞型CML CD34 +細胞Notch1、Notch2和Hes1顯著升高，提示Notch信號在慢性粒細胞白血病原始細胞的活性。數(shù)據(jù)表明，伊馬替尼誘導的BCR-ABL的抑制導致了顯著Notch活性上調。同樣，Notch的抑制導致BCR-ABL過度活化。因此，確定了CML Notch和BCR-ABL之間的對立關系。 TKI治療CML干細胞能有效地抑制BCR-ABL激酶活性，這表明額外的激酶依賴的機制有助于LSC存活。人骨髓間充質干細胞（MSCs）的共培養(yǎng)顯著抑制TKI暴露下的CML干/祖細胞的細胞凋亡并

6、且使其保存下來，維持其克隆形成能力和植入免疫缺陷小鼠的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，N-鈣粘蛋白受體在充間質干細胞介導的TKI治療CML祖細胞保護中起著重要的作用。N-鈣粘蛋白介導的對間充質干細胞粘附和增加的細胞質N-鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復合物的形成以及增強的-連環(huán)蛋白的核轉位和轉錄活性相關。增加的外源性Wnt信號介導的-連環(huán)蛋白信號通路在MSC介導的TKI治療CML祖細胞的保護中發(fā)揮了重要作用。 其他最近的研究表明，腫瘤抑制基因PTEN在CML干細胞被bcr-abl表達下調，PTEN缺失加速小鼠CML白血病發(fā)展，證明了PTEN在白血病中調節(jié)干細胞的關鍵作用。CD34 +原始CML細胞的系統(tǒng)基因分析顯示多個信

7、號通路的激活，伴隨DNA修復的減少，異常的黏附和歸巢，以及激活的蛋白酶體蛋白信號通路。BCR-ABL 融合基因 CML原始細胞黏附（接觸和錨定）缺陷使其擺脫了在正常情況下通過細胞因子信使從微環(huán)境細胞中接收的控制信號的控制。這些信號維持細胞的存活、死亡、細胞增殖和細胞分化的平衡?？赡懿灰蕾嚴野彼峒っ傅募毎羌艿鞍椎漠惓Ａ姿峄徽J為是引起CML細胞的整合功能紊亂的關鍵因素。 正常的9號染色體中ABL基因位于q34和qter之間，22號染色體的BCR和SIS的基因位于q11和qter之間。圖右為t（9; 22）。9號染色體的ABL被換位到22號染色體的M-BCR序列，22號染色體的末端部分被轉換到

8、9號染色體長臂上。22q-就是Ph染色體。 BCR，斷裂點集群區(qū)域; C-SIS，細胞病毒猿猴肉瘤病毒轉化基因; IGL，免疫球蛋白輕鏈基因。 9號染色體上ABL基因和22號染色體上的BCR基因突變是為慢性粒細胞白血病的發(fā)病關鍵 V-ABL是正常細胞ABL基因的同源病毒癌基因。該基因（v-abl）可在體外培養(yǎng)中誘導細胞惡性轉化，并在易感小鼠體內誘發(fā)白血病。 上圖顯示的是正常的ABL和BCR基因BCR-ABL融合基因。圖中上半部分垂直箭頭表明在ABL可能斷點位置。注意上游緊隨的ABL 8604 met基因位。BCR基因含有25個外顯子，包括第一（e1）和第二（e2）外顯子。三個斷點簇區(qū)域的位置顯

9、示為，m-BCR，M-BCR，-bcr。該圖的下部顯示BCR-ABL信使RNA融合轉錄的結構。-bcr斷點導致BCR-ABL轉錄帶有e19a2連接點。在每一個發(fā)生斷裂的基因處有相關的數(shù)字代表外顯子位置。 CML患者的細胞株的ABL的基因被重排并有擴增。細胞株和新鮮分離的慢性粒細胞白血病細胞均含有延長的8-kb的異常RNA轉錄單位，它由留在22號染色體的BCR基因的5部分與從9號染色體易位來的基因ABL的3部分融合產生的新的嵌合基因轉錄而來。這一融合mRNA翻譯成一種獨特的210 kDa酪氨酸磷酸蛋白激酶（p210BCR-ABL），與v-abl蛋白產物作用相似，它可以對細胞蛋白酪氨酸殘基產生磷酸

10、化。 ABL的位點含有至少兩個等位基因，在正常細胞中，ABL原癌基因編碼一分子量145000的酪氨酸激酶，其僅僅被痕量翻譯，且在體外缺乏任何激酶活性。推測BCR-ABL基因表達的融合產物通過嵌合酪氨酸蛋白激酶的酶活性調節(jié)異常而導致惡性轉化。BCR-ABL融合基因構建表明，BCR序列還可以激活微絲結合功能，酪氨酸激酶對肌動蛋白絲功能的修飾已經被認為是白血病發(fā)生過程中的一個步驟。 22號染色體上的斷點區(qū)DNA延伸段很短，約5至6kb，延伸的DNA的被稱為斷裂簇區(qū)（M-BCR），這是個較長的斷裂點簇基因BCR。三個主要的斷點簇區(qū)在22號染色體上各有特征：主要（M-BCR），次要（m-BCR），以及微

11、（-bcr）。三種不同的斷點分別產生P210，P190，P230融合蛋白。絕大多數(shù)CML患者BCR-ABL融合基因編碼p210 kDa（p210BCR-ABL）的融合蛋白，其mRNA轉錄物有e14a2或e13a2融合連接方式。涉及易位時，“e”表示BCR的外顯子的和“a”表示ABL外顯子位點。 在大約50的Ph染色體陽性的急性淋巴細胞白血病病例中，其BCR-ABL轉錄為e1a2融合鏈接，它產生190 kDa的（p190BCR-ABL）BCR-ABL蛋白。幾乎所有的CML病例確診時編碼p210BCR-ABL，但也表達p190BCR-ABL轉錄。這些雙轉錄物的生物學和臨床意義尚不明確。 在未發(fā)現(xiàn)P

12、h染色體的病例中，BCR-ABL可能仍然位于染色體9（隱匿的Ph染色體）。BCR基因可以與富含Alu重復序列區(qū)域中復雜易位的11q13區(qū)帶里的不同基因位點再結合。ETV6 / ABL融合基因也已在BCR-ABL陰性CML中發(fā)現(xiàn)。BCR-ABL和信號轉導和信號轉導 現(xiàn)在已經認為p210BCR-ABL酪氨酸磷酸化激酶活性是人類費城染色體陽性白血病發(fā)生的起因。與主要定位于細胞核中的ABL蛋白不同， p210BCR-ABL定位于細胞質中，因而更容易與各種分子發(fā)生相互作用，尤其是信號轉導通路中的分子。作為癌蛋白，P210BCR-ACL可結合20多個細胞蛋白和（或）使其磷酸化。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）

13、的一個亞單位結合p210BCR-ABL;而BCR-ACL依賴性細胞株和原代CML細胞的增殖需要這種相互作用。 BCR-ABL作用于促絲裂素原活化蛋白激酶（MAPK）引發(fā)的信號通路和相互作用是多重和復雜的。 一種RAF編碼的絲氨酸 - 蘇氨酸激酶活性被p210BCR-ABL調節(jié)。RAF表達下調既抑制CML細胞的BCR-ABL依賴性生長，又抑制正常造血祖細胞的生長因子依賴性增殖。 BCR-ABL轉化細胞的效率受一種銜接蛋白的影響，這種蛋白可將酪氨酸激酶信號傳導至RAS。這一過程涉及生長因子受體結合蛋白2（GRB2）。p210BCR-ABL也激活RAS多重替代途徑。BCR-ABL可持續(xù)激活PI3K并

14、生成肌醇脂，且通過下調諸如PTEN和SHIP1等多聚磷酸肌醇抑癌基因而使PI3K失調。 在p190BCR-ABL轉基因小鼠的白血病組織中，Hef2也結合CRKL。Hef2基因編碼的蛋白可加速RAS編碼的蛋白和神經纖維瘤蛋白的GTP水解，并參與整合素的信號通路。在造血細胞中，神經纖維瘤蛋白通過RAS負向調控粒細胞- 單核細胞集落刺激因子（GM-CSF）的信號轉導。P62DOK，其酪氨酸處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)，并與p120RAS GAP蛋白相聯(lián)結，在c-kit受體激活時發(fā)生快速酪氨酸磷酸化，也與ABL相關聯(lián)。 p210BCR-ABL介導的轉化也需要核因子（NF）-B的激活。p210BCR-ABL的表達

15、通過核轉移引起NF-B依賴性轉錄的激活。 表達p210BCR-ABL的細胞株也具有JAKS激酶、信號轉導和轉錄激活因子（STATs）（通常是STAT5）的持續(xù)活化。由BCR-ABL急性轉化的原代小鼠髓細胞中STAT5也被激活；p210BCR-ABL使IL-3的亞基、GM-CSF受體和JAK2磷酸化，并與其免疫共沉淀。ABL和BCR都是GTP結合蛋白家族Rho228,229和生長因子結合蛋白GRB2的多功能調節(jié)蛋白，GRB2將酪氨酸激酶與RAS聯(lián)系起來，并與BCR-ABL和核苷酸交換因子Sos形成復合物，導致RAS激活。加速期、急變期的發(fā)病機制 雖然酪氨酸激酶抑制劑治療顯著延長了慢性期向加速期和

16、原始細胞危象的發(fā)展，但這種轉變的風險仍然存在，因為經BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑處理的CML干細胞未發(fā)生凋亡。 CML加速期的開始被認為出現(xiàn)在一個攜帶有BCR-ABL融合基因的粒 - 單核祖細胞。由慢性期CML轉變?yōu)榧铀倨诓⑦M而轉變?yōu)樵技毎Ｏ?，或直接由慢性期轉變?yōu)樵技毎Ｏ蟊徽J為至少經過以下7個分子過程：（1）成熟停滯，（2）基因組監(jiān)視失敗，（3）不能進行充足的DNA修復，（4）突變子表型出現(xiàn)，（5）端粒縮短，（6）腫瘤抑制因子功能缺失，（7）未知因素。 由慢性期轉變?yōu)榧铀倨谶^程的顯著特點是BCR-ABL表達的增加。而在mRNA BCR-ABL轉錄上調的基礎上，出現(xiàn)其他細胞遺傳學異常，

17、這種情況大約出現(xiàn)在50%-65%持續(xù)Ph染色體陽性的患者中。在原始細胞有淋巴細胞表型的CML急淋變中，約有50%的患者出現(xiàn)P16 / ARF基因突變，約有20%的患者發(fā)生Rb基因的突變。在原始細胞具有粒細胞表型的CML急粒變中，大約25的病例含有p53突變的細胞。通過敲除p53功能的轉基因小鼠實驗證實，p53功能的缺失具有促進人慢性期CML克隆轉化的作用。作為p53基因家族的一員，p51 / p63在CML慢性期并沒有突變，但在急變期，約有8的患者出現(xiàn)P51/P63的突變。 大約65的病人，除了有Ph染色體，還有其他細胞遺傳學的異常。雙Ph染色體，8號染色體三體和等臂染色體17p是最常見的繼發(fā)

18、性改變。異常的mRNA和蛋白質產物p210BCR-ABL見于轉化為急性白血病病人的骨髓和血細胞中。 極少數(shù)的病例在轉化后出現(xiàn)BCR-ABL融合基因的缺失，mRNA的缺失以及具有酪氨酸激酶活性的P210表達的缺失，這些發(fā)現(xiàn)提示異常的蛋白激酶并不總在維持急性期階段狀態(tài)中發(fā)揮獨特的作用。相反，患者對于伊馬替尼的高反應率，盡管只是臨時的，提示突變的BCR-ABL產物通常在疾病的這一階段發(fā)揮重要的作用。 很多在急性轉化患者細胞內檢測出的分子改變可能有助于CML克隆惡性行為能力的增加，包括N-RAS基因活化， p53基因重排，降鈣素基因的高甲基化，以及ABL1基因的甲基化。一項研究報道了17%的原始細胞危象患者有p53基因突變。還有報道視網(wǎng)膜母細胞瘤1基因產物在CML細胞的表達缺失和有巨核細胞表型的急變相關。P16抑癌基因純合子缺失與CML的淋系轉化有關。11p13染色體的WT基因編碼一個含鋅指模塊的轉錄因子，它只在轉化為急變期的CML病人中出現(xiàn)。CML急變期中還出現(xiàn)EVI-1基因的過度表達。BCL-2，c-Myc和其它