HPLC高效液相色譜培訓分析

1、HPLC高效液相色譜培訓分析 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）是）是20世紀世紀60年年代末代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。為廣泛的化學分離分析的重要手段。 它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更率高

2、、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：進行比較： HPLC優(yōu)點：高速、高效、高靈敏度、高自動化。優(yōu)點：高速、高效、高靈敏度、高自動化。 高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達 10cm3min-1. 如分離苯的羥基化合物，如分離苯的羥基化合物，7個組分只需個組分只需1min就可完成。就可完

3、成。 對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑，柱徑0.9cm，流動相速度為，流動相速度為30cm3h-1，需用，需用20多小時才能分離出多小時才能分離出20種氨基酸；而用種氨基酸；而用HPLC，只需，只需lh之內(nèi)即可完成。之內(nèi)即可完成。 又如用又如用25cm 0.46cm的的LichrosorbODS(5)的柱，采的柱，采用梯度洗脫，可在不到用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中內(nèi)分離出尿中104個組分個組分. (1)GC分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的們僅占有機物總數(shù)的2

4、0。對于占有機物總數(shù)近。對于占有機物總數(shù)近80的的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用要采用HPLC進行分離和分析。進行分離和分析。 (2)GC采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而HPLC中流動相中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起

5、很大作用，相當于增加了一個控制此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。極大方便。(3)GC一般都在較高溫度下進行的，而一般都在較高溫度下進行的，而HPLC法則經(jīng)常可法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。在室溫條件下工作。 總之，總之，HPLC是吸取了是吸取了GC與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展。目并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展。目前前HPLC已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子

6、物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。離和分析。 HPLC主要缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格。主要缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格。 和和GC一樣，一樣，LC分離系統(tǒng)也由固定相和流動相組成。分離系統(tǒng)也由固定相和流動相組成。其固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體其固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相

7、液體推動進入色譜相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。 色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。的大小，決定色譜過程的保留行為。 根據(jù)分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、根據(jù)分離機制不同，液相色譜可分為：液固

8、吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。阻色譜等類型。 首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。此得到液相色譜

9、圖。 此外還配有自動進樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。此外還配有自動進樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。液系統(tǒng)。 它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由、等組成。等組成。 核心部件。核心部件。壓力：壓力：150350 105 Pa。 應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。圍寬，便于迅速更換

10、溶劑及耐腐蝕等要求。 常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。 恒流泵特點：在一定操作條件下，輸出流量保持恒定恒流泵特點：在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)； 恒壓泵特點：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色恒壓泵特點：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。 它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復泵兩種，流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械

11、往復泵兩種，應(yīng)用最多的是機械往復泵。應(yīng)用最多的是機械往復泵。輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復泵、雙活塞往復泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復泵、雙活塞往復泵和往復式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能見下表。和往復式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能見下表。雙活塞往復泵：雙活塞往復泵： 如下圖如下圖a所示，雙活塞往復泵有一個精心設(shè)計的偏所示，雙活塞往復泵有一個精心設(shè)計的偏心凸輪，用同步電機或變速直流電機驅(qū)動偏心凸輪，心凸輪，用同步電機或變速直流電機驅(qū)動偏心凸輪，偏心凸輪再推動兩活塞作往復運動。偏心凸輪短半徑偏心凸

12、輪再推動兩活塞作往復運動。偏心凸輪短半徑端所對應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的下單向閥打開吸端所對應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的下單向閥打開吸入流動相，與此同時，偏心凸輪的長半徑端所對應(yīng)的入流動相，與此同時，偏心凸輪的長半徑端所對應(yīng)的另一活塞被推入，使其上單向閥打開，并將流動相送另一活塞被推入，使其上單向閥打開，并將流動相送至色譜柱。于是，兩活塞交替伸縮，往復運動，獲得至色譜柱。于是，兩活塞交替伸縮，往復運動，獲得的排液特性如圖的排液特性如圖b所示，即具有穩(wěn)定的輸出流量，這所示，即具有穩(wěn)定的輸出流量，這樣就能避免單活塞泵液流脈沖的問題。樣就能避免單活塞泵液流脈沖的問題。 雙活塞往復泵的輸液雙活塞往復泵的

13、輸液流量比單活塞泵小得多。流量比單活塞泵小得多。 優(yōu)點：優(yōu)點： 不必使用消除脈沖的不必使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗。的壓力消耗。 缺點：缺點： 設(shè)備成本較高，流量設(shè)備成本較高，流量調(diào)節(jié)也比單活塞泵復雜。調(diào)節(jié)也比單活塞泵復雜。雙活塞往復泵的構(gòu)造和排液特性雙活塞往復泵的構(gòu)造和排液特性單流路真空脫氣裝置的原理單流路真空脫氣裝置的原理高壓梯度裝置結(jié)構(gòu)四元低壓梯度系統(tǒng)結(jié)構(gòu) 利用兩臺高壓輸液泵，利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱?；旌虾筮M入色譜柱。 一臺高壓泵一臺高壓泵,

14、通過比例通過比例調(diào)節(jié)閥調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。入高壓泵中混合。 HPLC柱比柱比GC柱短得多（約柱短得多（約530cm），所以柱外），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。 柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。 柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起柱前柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此展寬的主要因素，因此HPL

15、C法中對進樣技術(shù)要求較嚴。法中對進樣技術(shù)要求較嚴。 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置。進樣裝置。 結(jié)構(gòu)如圖所示：結(jié)構(gòu)如圖所示： 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。兩部分。 柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。 一般色譜柱長一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜，凝膠色譜柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑312mm

16、，制備柱內(nèi)徑較大，可達，制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm 以上。以上。 一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。保證分離柱的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，

17、然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。 一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。其特點：有響應(yīng)。其特點： 靈敏度高；靈敏度高； 線形范圍高；線形范圍高； 流通池可做的很?。魍ǔ乜勺龅暮苄。?mm 10mm ，容積，容積 8L）；）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感；對流動相的流速和

18、溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作；波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。 紫外檢測器的重要進展；紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。二極管陣列檢測器（二極管陣列檢測器（優(yōu)點：優(yōu)點： 高靈敏度、高選擇性；高靈敏度、高選擇性； 對多環(huán)芳烴，維生素對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；測量溶

19、劑電導率，特別適合于離子溶液。測量溶劑電導率，特別適合于離子溶液。 由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。 色譜柱流出液導入霧化器，被載氣（壓縮空氣或色譜柱流出液導入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮氣）霧化成微細液滴，液滴通過加熱漂移管時，流氮氣）霧化成微細液滴，液滴通過加熱漂移管時，流動相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶動相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)

20、變成電信號。因為散射光強只與溶質(zhì)顆粒電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號。因為散射光強只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學性質(zhì)無大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學性質(zhì)無關(guān)，所以關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測器。屬通用型和質(zhì)量型檢測器。 適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光的檢測。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測器相比，它的基源強度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用

21、于梯度洗脫。 。 檢測器檢測下限/(g/ml)線性范圍選擇性梯度淋洗主要特點UV-Vis10-10103104有有可可對流速和溫度變化敏感；池體對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很??；對溶質(zhì)的響積可制作得很?。粚θ苜|(zhì)的響應(yīng)變化大。應(yīng)變化大。熒光熒光10-1210-11103有有可可選擇性和靈敏度高；易受背景選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、熒光、消光、溫度、pH和溶和溶劑的影響劑的影響電化學電化學10-10103有有困難困難選擇性高；易受流動相選擇性高；易受流動相pH值值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差。和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差。蒸發(fā)光散射蒸發(fā)光散射10-9無無可可可檢測所有物質(zhì)?？蓹z測所

22、有物質(zhì)。示差折光示差折光10-1104無無不可不可可檢測所有物質(zhì)；不適合微量可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感。分析；對溫度變化敏感。質(zhì)譜質(zhì)譜10-10無無可可主要用于定性和半定量。主要用于定性和半定量。 液液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相。固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相。 吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。表面存在吸附中心。 液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。不同來進行分離的。固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使固體吸附劑為，如硅膠、

23、氧化鋁等，較常使用的是用的是510m的硅膠吸附劑；的硅膠吸附劑； 各種不同極性的一元或多元溶劑。各種不同極性的一元或多元溶劑。 當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇?，于是在留就要取代?shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇谑窃诠潭ㄏ啾砻姘l(fā)生競爭吸附固定相表面發(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS達平衡時達

24、平衡時,有有 nadnadadSXSXK 其中其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。上保留強，難于洗脫。Kad值小值小,則保留值弱，易于洗脫。則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。數(shù)據(jù)求出。 適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾； 在液在液-液色譜

25、中液色譜中,流動相和固定相都是液體（互不相流動相和固定相都是液體（互不相溶）。它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極溶）。它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。型的化合物。 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。同的分配系數(shù)。 liquid- liquid partition chromatography

26、所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。 由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液，氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷等。氧二丙睛，中等極性的聚

27、乙二醇，非極性的角鯊烷等。 chemical bonded partition chromatography,它是最先用于液它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)： SiOHROHSiORH20由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。 制備反應(yīng)如下制備反應(yīng)如下 共價鍵健合固定相不易水解，且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。

28、共價鍵健合固定相不易水解，且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。 缺點是格氏反應(yīng)不方便；當使用水溶液時，必須限制缺點是格氏反應(yīng)不方便；當使用水溶液時，必須限制pH在在48范圍內(nèi)范圍內(nèi).OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2制備反應(yīng)如下：制備反應(yīng)如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl 這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在機溶劑的優(yōu)點。能在70以下，以下，pH=28范圍內(nèi)正常工范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛作，應(yīng)用較廣泛. 此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅此法的

29、固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠膠C18H37、硅膠苯基等；、硅膠苯基等； 流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙腈、水和流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙腈、水和無機鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化無機鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；合物； 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；也可用于分離極性化合物； 若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類

30、等。 反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。的優(yōu)點。 關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機理，可用所謂疏溶劑作關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，這種，這種“分子毛分子毛”有較強有較強的疏水特性。的疏水特性。當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上化合物時，一方

31、面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用，見下圖。顯然，兩種它離開固定相，并減小其保留作用，見下圖。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。 此法是以極性的有機基團，此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑

32、（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙臘等）為流動相，分離極性化合物。臘等）為流動相，分離極性化合物。 此時，組分的分配比此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。但隨流動相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。 當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學鍵當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學鍵合各種離子交換基團，如一合各種離子交換基團，如

33、一SO3H 一一CH2NH2、COOH、一、一CH2N（CH3）等時，就形成了離子性鍵合相色）等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；譜的固定相； 流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。換色譜類同。 鍵合相色譜的最大優(yōu)點：鍵合相色譜的最大優(yōu)點：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色

34、譜法中，約有統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有80的分離問題是用的分離問題是用鍵合相色譜法解決。鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點：不能用于酸、堿度過大或存在氧此法的最大缺點：不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系?；瘎┑木彌_溶液作流動相的體系。如何根據(jù)樣品極性種類來選擇化學鍵合的固定相，如何根據(jù)樣品極性種類來選擇化學鍵合的固定相，見下表。見下表。 ion-exchange chromatography 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。 凡

35、在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離。亦可用于有機物的分離。 例如氨基酸、核酸、蛋例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。應(yīng)用范圍較廣。 離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分上分布有固定

36、的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下： 陽離子交換：陽離子交換： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+ 陰離子交換：陰離子交換： RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+ Cl-一般形式：一般形式： RAB RBA 達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：的選擇系數(shù)）： 式中式中Ar，Br 分別代表樹脂相中洗脫劑離子（分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（和試樣離子

37、（B）的濃度，）的濃度，A、B則代表它們在溶液中則代表它們在溶液中的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子B對于對于A型樹脂親和力的大?。盒蜆渲H和力的大?。篕B/A越大，說明越大，說明B離子交離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子離子電荷越大，水合離子半徑越小，電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。值就越大。rrABABABK/ 對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：值按以下順序： Cs+Rb+K+NH4

38、+Na+H+Li+ 二價離子的順序為：二價離子的順序為： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+ 對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：順序為： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有有陽離

39、子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分。強弱之分。 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為徑約為520m，有微孔型和大孔型之分。，有微孔型和大孔型之分。 它是在直徑約對它是在直徑約對30m的固體情性核上，凝聚的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層。厚的樹脂層。 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。上面涂一層很薄的離子交換樹脂。 它是用化學反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體

40、它是用化學反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。表面。它也分為兩種類型。 一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，其載體是多孔微粒硅膠。是鍵合微粒載體型，其載體是多孔微粒硅膠。 后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。快速分離。 離子交換色譜法所用流動相大都是一定離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子度（或離子

41、強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和的種類、濃度和pH值可控制值可控制k值，改變選擇性。值，改變選擇性。 如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子滯留次序為：對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子滯留次序為：檸檬酸離子檸檬酸離子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F- 所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。 陽離子的滯留次序大為

42、：陽離子的滯留次序大為：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十十 但差別不如陰離子明顯。關(guān)于但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不值的影響，要視不同情況而定。同情況而定。 例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的可通過改變流動相的pH值來控制。值來控制。 增大增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少； 降低降低pH值，其結(jié)果相反。值，其結(jié)果相反。 但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品但

43、無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。的保留增大。 ion pair chromatography 離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。它是離子對革取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。極好方法。它是離子對革取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在在20世紀世紀70年代中期，年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。 離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加

44、到流動相或固定相中，相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。行為的一種色譜法。 關(guān)于離子對色譜機理，至今仍不十分明確，已提出三關(guān)于離子對色譜機理，至今仍不十分明確，已提出三種機理：種機理： 離子對形成機理；離子對形成機理； 離子交換機理；離子交換機理； 離子相互作用機理。離子相互作用機理。 現(xiàn)以離子對形成機理說明之。假如有一離子對色譜現(xiàn)以離子對形成機理說明之。假如有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，并在其體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶

45、液，并在其中加入一種電荷與組分離子中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子相反的離子B+，B+離子由于離子由于靜電引力與帶負電的人組分離子生成離子對化合物靜電引力與帶負電的人組分離子生成離子對化合物A-B+。離子對生成反應(yīng)式離子對生成反應(yīng)式 由于離子對化合物由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。固定相（有機相）提取。 組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導致各組分離大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰

46、先后不同。子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。 這就是離子對色譜法分離的基本原理。這就是離子對色譜法分離的基本原理。KABA-水相 +A-B+有機相B+有機相 離子對色譜法類型很多，根據(jù)流動相和固定相的極性離子對色譜法類型很多，根據(jù)流動相和固定相的極性可分為反相離子對和正相離于對色譜法?？煞譃榉聪嚯x子對和正相離于對色譜法。 其中以鍵合相離子對色譜法最重要。這種色譜法的固其中以鍵合相離子對色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相如十八烷基鍵合相（定相采用非極性的疏水鍵合相如十八烷基鍵合相（ODS）等，流動相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如等，流動相為加有平衡離子（反離

47、子）的極性溶液（如甲醇甲醇-水或乙睛水或乙睛-水）。水）。 根據(jù)離子對生成反應(yīng)式，平衡常數(shù)根據(jù)離子對生成反應(yīng)式，平衡常數(shù) KAB可表示為可表示為水相水相有機相BABAKAB根據(jù)上兩式，有根據(jù)上兩式，有 式中式中為相比率。容量因子為相比率。容量因子k隨隨KAB和和B+水相水相的增大的增大而增大。而增大。 鍵合相反相離子對色譜法操作簡便，只要改變流動鍵合相反相離子對色譜法操作簡便，只要改變流動相的相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問題。此法發(fā)展迅速

48、，應(yīng)用較廣泛題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛.1水相BKVVKkABMS 根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù)根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù) 水相水相有機相BKABAKAB 常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；烷基三甲銨作為對離子； 常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；size- exclusion chromatography 尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、的分離。與其他液相色譜方法

49、原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。狀不同來實現(xiàn)分離的。 尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。的某些信息。（2）保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低）保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱

50、子不）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于別必須大于10才能得以分離。才能得以分離。 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學情性多孔物質(zhì)方法。其固定相為化學情性多孔物質(zhì)凝膠，它類似于凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。 體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地體積

51、大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；被淋洗出來； 中等體積的分子部分滲透；中等體積的分子部分滲透； 小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。 這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖。中流出。其滲透過程模型見圖。 分類：分類：凝膠過濾色譜（凝膠過濾色譜（ gel filtration chromatography , GFC ） ： 以水或緩沖溶液作流動相的凝膠色譜以水或緩沖溶液作流動相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。法。主要適合于水溶性高分子的分離。

52、凝膠滲透色譜（凝膠滲透色譜（ gel permeation chromatography , GPC ）：）： 以有機溶劑作流動相的凝膠色譜法。以有機溶劑作流動相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用主要用于合成高分子的分子量（分布）的測定。于合成高分子的分子量（分布）的測定。 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。性和剛性凝膠三類。 凝膠：指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于凝膠：指含有大

53、量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。聚體。 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐）比軟性凝

54、膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。效液相色譜時，流速不宜大。 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于作。一般控制壓強小于7MPa，流速，流速1cm3s-1；否則將影；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。響凝膠孔徑，造成不良分離。 排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非

55、常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。這對于具有低擴散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。這對于具有低擴散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。 選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，

56、以以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。 Affinity chromatograph 定義：利用蛋白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生定義：利用蛋白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生物活性配位體之間的特異親和力進行分離的液相色譜方法。物活性配位體之間的特異親和力進行分離的液相色譜方法。 固定相：將具有生物活性的配位體以共價鍵結(jié)合到不固定相：將具有生物活性的配位體以共價鍵結(jié)合到不溶性固體基質(zhì)上制得。溶性固體基質(zhì)上制得。 生物活性配位體：常用的有酶（如底物及其類似物）、生物活性配位體：常用的有酶（如底

57、物及其類似物）、輔酶（如類固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多輔酶（如類固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。糖）、抗生素（核苷酸）等。 基質(zhì)：通常為凝膠，許多無機和有機聚合物都可形成基質(zhì)：通常為凝膠，許多無機和有機聚合物都可形成凝膠，如瓊脂糖衍生物、多孔玻璃。凝膠，如瓊脂糖衍生物、多孔玻璃。 分離過程：親和色譜是吸附色譜的發(fā)展，在分離分離過程：親和色譜是吸附色譜的發(fā)展，在分離過程中涉及疏水相互作用、靜電力、范德華力和立體過程中涉及疏水相互作用、靜電力、范德華力和立體相互作用。在鍵合了某類配體的親和色譜柱上加入含相互作用。在鍵合了某類配體的親和色譜柱上加入含生物

58、活性大分子的樣品，只有那些與該柱中配位體表生物活性大分子的樣品，只有那些與該柱中配位體表現(xiàn)出明顯親和性的生物大分子才會被吸附，這些被吸現(xiàn)出明顯親和性的生物大分子才會被吸附，這些被吸附的生物分子只有在改變流動相（緩沖溶液）的組成附的生物分子只有在改變流動相（緩沖溶液）的組成時才會被洗脫。時才會被洗脫。 應(yīng)用：親和色譜主要用于蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)應(yīng)用：親和色譜主要用于蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)的分離與制備。的分離與制備。 HPLC固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。體和硬膠兩大類。 剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承

59、受7.0 1081.0 109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應(yīng)二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。 硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。承受壓力上限為乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。承受壓力上限為3.5 108Pa。 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和

60、全多孔型固定相兩類。型固定相兩類。 （一）液液- -液分配及離子對分離固定相液分配及離子對分離固定相 它由直徑為它由直徑為10 m的氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體微粒凝聚而成。早期采用的多孔球體微粒凝聚而成。早期采用100m的大顆粒，表的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；面涂漬固定液，性能不佳已不多見； 現(xiàn)采用現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料；以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料； 硅膠微粒如國外的硅膠微粒如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的，上海試劑一廠的堆積硅珠，青