細胞培養(yǎng)技術(shù)實用篇

1、第三章第三章 細胞培養(yǎng)基本技術(shù)細胞培養(yǎng)基本技術(shù) 王王 云云 動脈粥樣硬化研究所動脈粥樣硬化研究所活細胞：長時間、直接觀察、研究活細胞的形活細胞：長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動可可控制：控制：選擇特定的細胞種類、性質(zhì)、階段選擇特定的細胞種類、性質(zhì)、階段可可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學、生物等控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學、生物等可可采用各種研究技術(shù)、記錄方法采用各種研究技術(shù)、記錄方法樣品均一樣品均一性：來源于同一組織同一種細胞性：來源于同一組織同一種細胞經(jīng)濟、規(guī)模經(jīng)濟、規(guī)模人工模擬的條件和體內(nèi)實際情況仍不完全相同人工模擬的條件和體內(nèi)實際情況仍不完全相同缺乏體內(nèi)缺乏體內(nèi)

2、的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響細胞相互間的影響體外體外培養(yǎng)的細胞生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)培養(yǎng)的細胞生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)境中，必然發(fā)生變化。境中，必然發(fā)生變化。細胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)細胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primary culture)(primary culture)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)(subculture)(subculture)體外培養(yǎng)細胞的體外培養(yǎng)細胞的影響因素影響因素細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)污染及對策污染及對策培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)細胞的生長測定生長測定方法方法細胞細胞凍存和復蘇凍存和復蘇組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)(Tissue Cult

3、ure)(Tissue Culture)： 指的是從體內(nèi)取指的是從體內(nèi)取出組織出組織，模擬，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長并體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)（Organ CultureOrgan Culture）： 培養(yǎng)的是器官的培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。存、生長和保持一定功能的方法。細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(Cell Culture)(Cell Culture)： 培養(yǎng)物是單個細胞培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群。和細胞群。原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（

4、primary cultureprimary culture）：從體內(nèi)取出細：從體內(nèi)取出細胞或組織的第一次培養(yǎng)。胞或組織的第一次培養(yǎng)。傳代傳代（passagepassage）也稱再也稱再培養(yǎng)。無論培養(yǎng)。無論是否稀釋，是否稀釋，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。細胞系細胞系（cell linecell line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系成功后即為細胞系細胞株（細胞株（cell straincell strain）：通過選擇法或克隆形成法：通過選

5、擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標志的培養(yǎng)物稱細胞株。志的培養(yǎng)物稱細胞株。匯合（匯合（confluentconfluent）：細胞相互連接成片占據(jù)所有底：細胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。物面積。接觸抑制（接觸抑制（contact inhibitioncontact inhibition）：細胞匯合相互）：細胞匯合相互接觸后失去運動的現(xiàn)象接觸后失去運動的現(xiàn)象 由于由于體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)的的細胞沒有細胞沒有抗感染抗感染能力，能力，因此因此防污染防污染是決定是決定培培養(yǎng)成功養(yǎng)成功的首要條件的首要條件。一切一切操作需要操作需要保證保

6、證無菌無菌和和有條不紊。有條不紊。制定制定好好實驗計劃和操作實驗計劃和操作程序程序有關(guān)有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。數(shù)據(jù)的計算要事先做好。準備準備各種所需器材和各種所需器材和物品，清點物品，清點無誤后將其無誤后將其放置放置在操作在操作場所場所( (培養(yǎng)室、超凈臺培養(yǎng)室、超凈臺) )內(nèi)，然后開始消毒內(nèi)，然后開始消毒。避免避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。染機會。地面地面每天每天都要用都要用0.2%0.2%的新潔爾滅拖洗地面的新潔爾滅拖洗地面次次( (拖布拖布要專用要專用) )，紫外線照射消毒，紫外線照射消毒30-50min30-50min超超凈工

7、作臺臺面凈工作臺臺面每次實驗前要用每次實驗前要用7575酒精擦洗。然酒精擦洗。然后紫外線消毒后紫外線消毒30min30min。消毒消毒時工作臺面上時工作臺面上用品用品布局合理布局合理，不要，不要過多過多或重疊或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。一些一些操作用具操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用等用75%75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。 原則上和外科手術(shù)相同原則上和外科手術(shù)相同。僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射線

8、照射30min30min的清潔的清潔工作服工作服在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應著在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用7575酒精消酒精消毒手毒手。進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 專用鞋或?qū)Ｓ眯驇讕自跓o菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要要點燃酒精燈點燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。處并經(jīng)過燒灼進行。如

9、實驗用品需火焰滅菌，如實驗用品需火焰滅菌，冷卻冷卻后接觸培養(yǎng)細胞，后接觸培養(yǎng)細胞，以防燒死細胞。以防燒死細胞。 進行培養(yǎng)時，動作要進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷準確敏捷不能不能太快，太快，否則否則空氣流動增加污染機會?？諝饬鲃釉黾游廴緳C會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。用火焰燒灼消毒或取備品更換。 l取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，44運送，運送，24h24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。內(nèi)盡快培養(yǎng)。l取材取材時應嚴格時應嚴格無菌無菌操作，避免對組織的機械損傷，盡量操作，避免對組織的機械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污

10、染組織可用青鏈去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。霉素和制霉菌素漂洗。l原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)，特別是正常細胞的培養(yǎng)，應采用，特別是正常細胞的培養(yǎng)，應采用營養(yǎng)豐富營養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液。l一般來講一般來講, ,胚胎組織較成熟個體的組織容易培養(yǎng)胚胎組織較成熟個體的組織容易培養(yǎng); ;分化低分化低的較分化高的組織容易生長的較分化高的組織容易生長; ;腫瘤組織較正常組織容易腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應盡量選用培養(yǎng)。取材時應盡量選用易培養(yǎng)易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)。的組織進行培養(yǎng)。l為了為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細胞體外培養(yǎng)便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細胞體

11、外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時保留組織學和電鏡標與原組織的差異性，原代取材同時保留組織學和電鏡標本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。機械機械法法：適于較：適于較柔軟柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺等。剪切組織為胸腺等。剪切組織為1mm1mm3 3碎塊后，置于組織勻漿碎塊后，置于組織勻漿器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)?；瘜W化學法法：胰蛋白酶、膠原酶、：胰蛋白酶、膠原酶、EDTAEDTA法法細胞懸液細胞懸液的分離方法：低速離心法、密度梯度離的分離方法：低速離心法、密度梯度離心法心

12、法低速離心低速離心法法： 血液和體液等細胞懸液血液和體液等細胞懸液500-500-1000rpm1000rpm離心離心5-10min5-10min。離心速度過大、時間過。離心速度過大、時間過長，會造成細胞損傷和死亡。長，會造成細胞損傷和死亡。密度梯度離心密度梯度離心法法： 用離心法將細胞分到不同用離心法將細胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細胞。適密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細胞。適于分離密度不等的細胞。常用介質(zhì)有于分離密度不等的細胞。常用介質(zhì)有FicollFicoll 400400，PercollPercoll，泛影葡胺等。，泛影葡胺等。對細胞間的蛋白質(zhì)水解，使細胞離散。對細胞間

13、的蛋白質(zhì)水解，使細胞離散。消化效果與消化效果與PHPH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)。硬度有關(guān)。適于消化細胞間質(zhì)較少的適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，軟組織，能有效地分離能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、而對含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效但若與膠原子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效但若與膠原酶合用能增加其對組織的分離作用酶合用能增加其對組織的分離作用 。鈣鎂離子和血清抑制其活性鈣鎂離子和血清抑制其活性。常用劑量為常用劑

14、量為0.25%0.25%，PH8PH8，溫度，溫度3737水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對上皮細胞影水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對上皮細胞影響不大。響不大。產(chǎn)品有產(chǎn)品有 等型，分別適用于分離肝細胞、等型，分別適用于分離肝細胞、胰島、脂肪細胞及纖維組織。胰島、脂肪細胞及纖維組織。鈣鎂離子和血清不影響活性鈣鎂離子和血清不影響活性，PH6.5-7PH6.5-7常用劑量為常用劑量為200U/ml200U/mlEDTAEDTA能與細胞上的能與細胞上的鈣、鎂離子鈣、鎂離子結(jié)合形成整合結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機械力使細胞變圓而分散細物，利用結(jié)合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。胞或使

15、貼壁細胞從瓶壁上脫離。缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，可與呈片狀，有團塊，常不單獨使用，可與胰蛋白胰蛋白酶混合使用酶混合使用(1 (1：1 1或或2 2：1) 1)，既利于細胞脫壁又，既利于細胞脫壁又利于細胞分散?？山档鸵让傅挠昧亢投拘宰饔?。利于細胞分散?？山档鸵让傅挠昧亢投拘宰饔谩DTAEDTA工作液的濃度為工作液的濃度為0.020.02，用用不含鈣、鎂不含鈣、鎂PBSPBS配制。配制。從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，即將動物機體的各種組織從機體中取出，養(yǎng)，即將

16、動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTAEDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖的過程。和繁殖的過程。組織和細胞剛剛離體，生物學特性未發(fā)生很大組織和細胞剛剛離體，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內(nèi)生長特性，是藥物測試、細胞分化等實驗的內(nèi)生長特性，是藥物測試、細胞分化等實驗的很好對象很好對象；原代細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)也是建立各種細胞系

17、（也是建立各種細胞系（cell line)cell line)或或細胞株（細胞株（cell straincell strain）必須經(jīng)過的階段。）必須經(jīng)過的階段。原代細胞培養(yǎng)多由各種細胞成分組成，比較復原代細胞培養(yǎng)多由各種細胞成分組成，比較復雜，即使是經(jīng)過處理后的細胞，也仍具有雜，即使是經(jīng)過處理后的細胞，也仍具有異質(zhì)異質(zhì)性（性（heterogeneous),heterogeneous),主要表現(xiàn)在細胞形態(tài)和大小主要表現(xiàn)在細胞形態(tài)和大小不一不一懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)法法器官培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法組織組織塊培養(yǎng)塊培養(yǎng)法法細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)法法對于懸浮生長的細胞如白血病細胞、淋巴細對于懸浮生長的細胞如白血

18、病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無須消化，可采用低速離心分離細胞無須消化，可采用低速離心分離, ,直接培直接培養(yǎng)。養(yǎng)。指組織、器官原基，以至整個器官或其指組織、器官原基，以至整個器官或其一部分在體外的維持或生長，它們可以一部分在體外的維持或生長，它們可以分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。1) 1) 動物動物處死處死：將出生：將出生2 23d3d乳鼠乳鼠， 用用脫頸方法處死。用酒精脫頸方法處死。用酒精棉球棉球 擦拭擦拭解剖部位解剖部位。2) 2) 取材取材及剪切及剪切：在無菌條件下：在無菌條件下將將 組織組織

19、取出，置于無菌培養(yǎng)皿中取出，置于無菌培養(yǎng)皿中， 剪剪去多余的組織（脂肪等去多余的組織（脂肪等），）， 用用PBSPBS液洗滌液洗滌1-21-2次；放入另一次；放入另一 培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿中，將組織剪成中，將組織剪成1mm1mm3 3大大 小小的塊。的塊。3) 3) 消化消化及分散組織塊及分散組織塊：將上述清洗過的組織放將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入入無菌試管內(nèi)，加入5 56 6倍量的倍量的0.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶液（液（pH7.4 pH7.4 7.67.6），置），置3737水浴中消化水浴中消化20 20 40min40min，每隔，每隔10min10min搖動一次，直到組織塊變得搖

20、動一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，加入管，加?ml5ml培養(yǎng)液，用吸管反復吹打組織塊，培養(yǎng)液，用吸管反復吹打組織塊，使其分散成細胞懸液，將細胞懸液用兩層滅菌使其分散成細胞懸液，將細胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。紗布過濾至另一燒杯中。 4)計數(shù)與稀釋計數(shù)與稀釋: :從過濾的細胞懸液中取出適量滴于從過濾的細胞懸液中取出適量滴于血細胞計數(shù)板上，按白細胞計數(shù)法進行計數(shù)；計數(shù)血細胞計數(shù)板上，按白細胞計數(shù)法進行計數(shù)；計數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3 3 5 51051

21、05個細胞為宜。個細胞為宜。5) 5)分裝與培養(yǎng)分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細胞懸液分裝于細胞培：將稀釋好的細胞懸液分裝于細胞培養(yǎng)瓶養(yǎng)瓶 or or 培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標記，置于培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標記，置于37 37 CO2CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6) 6)觀察觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細胞生長：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細胞生長情況。待細胞已基本長成致密單層時，即可進行傳情況。待細胞已基本長成致密單層時，即可進行傳代培養(yǎng)。代培養(yǎng)。取材取材的組織最好盡快培養(yǎng)的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時培養(yǎng)，可將組織浸泡于，若不能及時培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴

22、或4 40 0C C冰箱。若組織塊很大，應先將其切成冰箱。若組織塊很大，應先將其切成1cm21cm2以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過2424小時，因放置時間小時，因放置時間長或組織塊太大都易造成細胞的死亡；長或組織塊太大都易造成細胞的死亡；取材取材時嚴格無菌操作時嚴格無菌操作。用預先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液用預先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化的培養(yǎng)瓶進行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學試劑及有害藥物如碘、汞等學試劑及有害藥物如碘、汞等。3 3. . 取材時取材時要細心去除組織中的

23、血液、結(jié)締組織、脂肪及壞要細心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞死組織等。死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中少量培養(yǎng)液中；組織塊培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細胞的方法，原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細胞的方法，故也被稱為組織培養(yǎng)故也被稱為組織培養(yǎng)(tissue culture)(tissue culture)。 (1 (1) ) 取材取材、修剪、組織剪或切成、修剪、組織剪或切成1mm1mm3 3左右的小左右的小 塊。塊。(2)(2)將將

24、剪切剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培好的組織小塊用眼科鑷送入培 養(yǎng)養(yǎng) 瓶瓶內(nèi)。內(nèi)。25ml25ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶( (底面積約為底面積約為17.5cm17.5cm2 2）以）以2020一一3030小塊為宜。小塊為宜。(3 (3) ) 放置放置24h24h待組織小塊貼附后將培養(yǎng)瓶慢慢待組織小塊貼附后將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)組織塊接種后組織塊接種后l-3l-3天天，游出，游出細胞數(shù)很少細胞數(shù)很少, ,組織塊組織塊的粘貼不牢固。的粘貼不牢固。觀察、移動觀察、移動過程中要注意過程中要注意動作動作輕巧輕巧。盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對組織盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力

25、使其漂起。塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的在原代培養(yǎng)的1-2d1-2d內(nèi)要持別內(nèi)要持別注意觀察注意觀察，是否有，是否有細菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，細菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細胞帶來污染。以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細胞帶來污染。原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)3-5d3-5d需需換液換液一次，去除漂浮的組織塊一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細胞和殘留的血細胞，以免影響，以免影響原代細胞的原代細胞的生長。生長。 1. 細胞種類：小鼠胚細胞種類：小鼠胚胎胎成纖維細胞成纖維細胞 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4d； 3. 放大倍數(shù)：放大倍數(shù)：倒置顯微倒置顯微鏡鏡 ； 4. 培養(yǎng)

26、基種類：培養(yǎng)基種類：1640+10%X小牛血清小牛血清； 5. 5. 細胞細胞狀態(tài)與特征簡述狀態(tài)與特征簡述:細胞呈長梭形，貼壁生長細胞呈長梭形，貼壁生長 細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，不論是否稀釋，將細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)將細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)(passage)。根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有根據(jù)細

27、胞生長的特點，傳代方法有2 2種。種。懸浮生長細胞傳代懸浮生長細胞傳代離心法離心法傳代：離心（傳代：離心（1000rpm1000rpm）去上清，沉淀物加去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除養(yǎng)液去除l l2 22 23 3，然后用吸管直接吹打形成細，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代胞懸液再傳代。貼壁生長細胞傳代貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。在傳代時，需要用胰蛋采用酶消化法傳代。在傳代時，需要用胰蛋白酶將細胞消化，使其從支持物上脫落，或用白酶將細胞消化，使其從支持物上脫落，

28、或用EDTAEDTA溶液與胰蛋白酶按溶液與胰蛋白酶按1 1：1 1或或2 2：1 1比例混合比例混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白的胰蛋白酶液。酶液。 Optimal confluency for moving cells to a new dish is 70-80%too low, cells will be in lag phase and wont proliferateToo high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove fro

29、m plate操作全過程注意無菌操作操作全過程注意無菌操作胰酶消化時間要適度胰酶消化時間要適度吹打細胞時用力要適度，盡量減少氣泡吹打細胞時用力要適度，盡量減少氣泡游離期游離期貼壁貼壁期期潛伏期潛伏期對數(shù)生長期對數(shù)生長期停止停止期（平臺期）期（平臺期）細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期期細胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形細胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形1010分鐘分鐘-4 -4小時小時細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。底物：膠原、玻璃、塑料等底物：膠原、玻璃、塑料等細胞株平均在細胞株平均在1010分鐘分鐘-4 -4小時貼壁小時貼壁血清血清中

30、有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。膠原等糖蛋白。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學合成的功能進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學合成的功能基團）基團）潛伏期潛伏期：細胞有生長活動，而無細胞分裂，細：細胞有生長活動，而無細胞分裂，細胞株潛伏期一般為胞株潛伏期一般為6-246-24小時。小時。對數(shù)生長期對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。力最佳，最適合進行實驗研究。停止停止期期：細胞長滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，：細胞長滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，機制為接觸抑制、密度依賴性。機制為接觸抑制

31、、密度依賴性。組織和細胞供體年齡組織和細胞供體年齡培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件細胞的粘附細胞的粘附培養(yǎng)技術(shù)方法培養(yǎng)技術(shù)方法促生長因子促生長因子幼年個體比老年者易于培養(yǎng)，所有動物的胚胎幼年個體比老年者易于培養(yǎng)，所有動物的胚胎組織都是最好的培養(yǎng)對象。組織都是最好的培養(yǎng)對象。來自來自同一個體的組織，分化低的比分化高的容同一個體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。易培養(yǎng)。不同的細胞對不同的細胞對培養(yǎng)基培養(yǎng)基需求不同，當前尚無一種培需求不同，當前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應選擇相應的培養(yǎng)基。應了解所養(yǎng)基是萬能的，應選擇相應的培養(yǎng)基。應了解所培養(yǎng)細胞的生物學性狀和特殊需求成分。培養(yǎng)細胞的生物學性狀和特殊需求成分。細胞在

32、體外進行培養(yǎng)，失去了機體的調(diào)節(jié)和控制。細胞在體外進行培養(yǎng)，失去了機體的調(diào)節(jié)和控制。因此，除滿足營養(yǎng)的要求外，還必須使細胞生存因此，除滿足營養(yǎng)的要求外，還必須使細胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、PHPH值值等均能影響細胞等均能影響細胞的生長的生長。細胞類型細胞類型 ( (附著最強附著最強) )巨噬細胞一成纖維細胞巨噬細胞一成纖維細胞上皮上皮細胞細胞血細胞血細胞( (最弱最弱) ) 生物因素生物因素 血清、培養(yǎng)液中的促附著因子血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機械，物理等其他因素機械，物理等其他因素

33、離心：促進附著離心：促進附著流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著低溫：可抑制附著低溫：可抑制附著現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促進細胞生長作用。胰島素能促進細胞利用葡萄糖和氨進細胞生長作用。胰島素能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸，用量為基酸，用量為1 110U/ml10U/ml。氫化可的松可促進表皮細胞。氫化可的松可促進表皮細胞和乳腺上皮細胞生長，并能提高膠質(zhì)細胞和成纖維細和乳腺上皮細胞生長，并能提高膠質(zhì)細胞和成纖維細胞的克隆形成率，用量為胞的克隆形成率，用量為1010-8 -8 1010-7 -7mol/Lmol

34、/L。人表皮生長因子（人表皮生長因子（hEGFhEGF) )對大鼠宮頸鱗狀上皮細胞對大鼠宮頸鱗狀上皮細胞(RCEC)(RCEC)有促進增殖的作用。有促進增殖的作用。表皮生長因子表皮生長因子(EGF(EGF) )、成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子(FGF(FGF) )等生等生長調(diào)節(jié)因子都能促進細胞的生長和增殖。長調(diào)節(jié)因子都能促進細胞的生長和增殖。培養(yǎng)細胞生長狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)細胞生長狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化細胞細胞生長狀況。生長狀況。細胞細胞形態(tài)變化。形態(tài)變化。微生物微生物污染污染變黃，表示變黃，表示PHPH值下降，細胞生長旺盛，代謝值下降，細胞生長旺

35、盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導致。產(chǎn)生的酸性物不斷積累導致。變紅或紫紅色，表示變紅或紫紅色，表示PHPH值上升，細胞生長停值上升，細胞生長停滯、死亡。滯、死亡。一般生長穩(wěn)定的細胞需要一般生長穩(wěn)定的細胞需要2-32-3天換液天換液1 1次，生長次，生長慢的細胞需要慢的細胞需要3-43-4天換液一次。天換液一次。原代細胞原代細胞經(jīng)經(jīng)2424小時培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示小時培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示細胞代謝好。少量換液可刺激細胞生長。細胞代謝好。少量換液可刺激細胞生長。通常每周兩次，每次換半量或通常每周兩次，每次換半量或1/5-1/31/5-1/3量。原代細量。原代細胞第胞第1 1次換液時，切記不

36、要把培養(yǎng)液全部倒掉次換液時，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。細胞株（系）細胞株（系）：條件合適時生長迅速，過夜就變條件合適時生長迅速，過夜就變黃，可進行全量換液。這種情況下，最好減少細黃，可進行全量換液。這種情況下，最好減少細胞接種數(shù)，延長換液的時間。胞接種數(shù)，延長換液的時間。常規(guī)應特別注意細胞的生長增殖情況。常規(guī)應特別注意細胞的生長增殖情況。原代細胞：經(jīng)歷一個適應或潛伏期。原代細胞：經(jīng)歷一個適應或潛伏期。細胞系：多為細胞系：多為2424小時以內(nèi)。小時以內(nèi)。細胞細胞長滿瓶底長滿瓶底80%80%時應及時傳代。時應及時傳代。生長良好細胞：透明度大，折光性強，輪廓不生長良好細胞：透明度大，折光性強，輪廓不

37、清。清。生長狀態(tài)不良時，細胞折光性變?nèi)酰喞鰪姡L狀態(tài)不良時，細胞折光性變?nèi)?，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細胞胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細胞之間空隙加大。之間空隙加大。培養(yǎng)液顏色與透明度：培養(yǎng)液顏色與透明度：培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細胞菌。培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細胞菌。支原體污染，沒有明顯癥狀，但細胞生長卻明支原體污染，沒有明顯癥狀，但細胞生長卻明顯變緩。顯變緩。不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成份和造成細胞不純的異物，因此胞生存有害的成份和造成細胞不純的異物，因此一般包括一般包括微生物微生物

38、( (真菌、細菌、病毒和支原體真菌、細菌、病毒和支原體) )、化學物質(zhì)化學物質(zhì)( (影響細胞生存、非細胞所需的化學成份影響細胞生存、非細胞所需的化學成份) )及及細胞細胞( (非同一種的其它細胞非同一種的其它細胞) )。其中以微生物污。其中以微生物污染最多見。另外隨著細胞種類增多不同種細胞染最多見。另外隨著細胞種類增多不同種細胞交叉污染也時有發(fā)生、從而造成細胞不純。交叉污染也時有發(fā)生、從而造成細胞不純?？諝饪諝猓嚎諝馐俏⑸飩鞑サ淖钪饕緩健＃嚎諝馐俏⑸飩鞑サ淖钪饕緩?。 凈化凈化工作臺使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈工作臺使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常化工作不能正常進行進行

39、工作工作時不戴口罩或面對操作野大聲講話、咳嗽等時不戴口罩或面對操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過使外界氣流過強強減少減少空氣流動是防止污染的重要環(huán)節(jié)。空氣流動是防止污染的重要環(huán)節(jié)。器材器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底徹底 洗刷洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底徹底CO2CO2溫箱由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存溫箱由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細胞時不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細菌、霉菌孽生，細胞時不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細菌、霉菌孽生，而而CO2CO2溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)如不定期消毒溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)如不定期消毒, ,可形

40、可形成污染成污染. .操作操作無菌無菌觀念不強、動作不準確、使用污染的器具或觀念不強、動作不準確、使用污染的器具或封瓶時不封瓶時不嚴嚴培養(yǎng)培養(yǎng)兩種以上細胞時，操作不規(guī)范、交叉使用吸兩種以上細胞時，操作不規(guī)范、交叉使用吸管或營養(yǎng)液瓶等有可能導致細胞交叉污染。管或營養(yǎng)液瓶等有可能導致細胞交叉污染。血清血清：有些血清在生產(chǎn)時就已被支原體或病毒：有些血清在生產(chǎn)時就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。等污染，即可成為污染的來源。組織樣本組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術(shù)時使用碘酒消毒，這些混入本；另一方面手術(shù)時使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘

41、可以影響細胞生長。組織中的碘可以影響細胞生長。支支原體和病毒原體和病毒對細胞的形態(tài)和機能的影響是長期對細胞的形態(tài)和機能的影響是長期的、緩慢的和潛在的、緩慢的和潛在的的霉菌霉菌和細菌和細菌繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)壓制細胞繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)壓制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細胞。生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細胞?；瘜W物質(zhì)污染化學物質(zhì)污染如重金屬或其它化學試劑混入培養(yǎng)如重金屬或其它化學試劑混入培養(yǎng)液中后，有的毒性較小、如能及時排出，細胞仍液中后，有的毒性較小、如能及時排出，細胞仍可存活但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，可存活但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導致細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化能導致細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化細菌污

42、染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌，枯草桿菌、白色葡萄球菌， 以及以及大腸桿菌、假單大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。胞菌等革蘭氏陰性菌。 培養(yǎng)細胞受細菌污染后，培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pHpH改變。污染后細胞發(fā)生改變。污染后細胞發(fā)生病理改病理改 變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。死

43、亡。肉眼直接觀察法肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法顯微鏡觀察法PCRPCR檢測檢測真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有真菌有煙曲霉、煙曲霉、 黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受培養(yǎng)細胞受真菌真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微淺黃色的小點，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有

44、的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營生渾濁。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑微生物，最小直徑0.2um0.2um，一般，一般過濾除菌過濾除菌無法去無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在

45、于細胞之間。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。相差顯微鏡觀察法相差顯微鏡觀察法HayflickHayflick 培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNADNA熒光染色法（熒光染色法（Hoechst 33258Hoechst 33258）PCRPCR方法（即用型細胞培養(yǎng)中支原體檢測方法（即用

46、型細胞培養(yǎng)中支原體檢測PCRPCR試劑盒）試劑盒）細胞的直接觀察細胞的直接觀察動物接種檢查動物接種檢查電子顯微鏡觀察電子顯微鏡觀察PCRPCR技術(shù)技術(shù)防止污染，防止污染，預防預防是關(guān)鍵，預防措施應貫穿于整個細胞培養(yǎng)的是關(guān)鍵，預防措施應貫穿于整個細胞培養(yǎng)的始終。始終。器皿器皿準備準備開始操作開始操作前前操作過程操作過程中中其他細節(jié)方面的預防其他細節(jié)方面的預防在在培養(yǎng)液中加入適量的培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素抗菌素。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各100U/ml100U/ml。必要時加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素。必要時加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素B B等。等。培養(yǎng)箱內(nèi)應經(jīng)常清

47、潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。培養(yǎng)箱內(nèi)應經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。購入的未滅活血清應采取購入的未滅活血清應采取5656水浴滅活水浴滅活30min30min的措施以使血清的措施以使血清中的補體和支原體中的補體和支原體滅活滅活。小牛小牛血清血清是造成支原體初級污染的主要是造成支原體初級污染的主要來源來源次級次級污染源，即已污染支原體的細胞在污染的傳播中更為污染源，即已污染支原體的細胞在污染的傳播中更為重要重要保證保證培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)細胞的來源來源絕對干凈，同時應做好檢測，一旦發(fā)現(xiàn)支絕對干凈，同時應做好檢測，一旦發(fā)現(xiàn)支原體污染就應廢棄原體污染就應廢棄嚴禁已知污染了支原體的細胞進入未污染的工作

48、區(qū)域。嚴禁已知污染了支原體的細胞進入未污染的工作區(qū)域。嚴格嚴格無菌操作無菌操作，杜絕人為污染。，杜絕人為污染。對每批小牛血清嚴格檢查，對每批小牛血清嚴格檢查，滅活、過濾滅活、過濾有利于抑制支原體的污有利于抑制支原體的污染。染。培養(yǎng)的細胞一旦污染應及時處理，防止污染其培養(yǎng)的細胞一旦污染應及時處理，防止污染其他細胞他細胞。高壓滅菌高壓滅菌被污染的細胞，然后棄掉被污染的細胞，然后棄掉。有價值有價值的細胞被污染，并且污染程度較輕，可的細胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細胞恢復以通過及時排除污染物，挽救細胞恢復正常正常常用常用的排除微生物污染的方法有以下的排除微生物污染的方法有以

49、下4 4種種 抗生素是細胞培養(yǎng)中殺滅抗生素是細胞培養(yǎng)中殺滅細菌細菌的主要手段的主要手段。聯(lián)合聯(lián)合應用應用比單用效果好，預防性應用比污染后應比單用效果好，預防性應用比污染后應用用好好有有的抗生素對細菌僅有抑制作用，無殺滅效應。的抗生素對細菌僅有抑制作用，無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且反復使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細胞本身也有一定對細胞本身也有一定影響影響盡量盡量不用抗生素不用抗生素處理處理一些一些有價值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽有價值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用救，在這種情況下，可采用5 51010倍于常用量的倍于常用量的沖

50、擊法，加入高濃度抗生素后作用沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24244848小時，小時，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時可以奏效再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時可以奏效根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于體污染的細胞置于4141度作用度作用5 51010小時小時（最長（最長可以達可以達1818小時）殺滅支小時）殺滅支原體原體但是但是4141度對細胞本身應有較大影響，故在處理度對細胞本身應有較大影響，故在處理前，應先進行預試驗，確定最大限度殺傷支原前，應先進行預試驗，確定最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。體而對細胞影響較小的處理時間。 受微生

51、物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時間，物，腫瘤細胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時間，從體內(nèi)取出再進行培養(yǎng)繁殖。從體內(nèi)取出再進行培養(yǎng)繁殖。在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細胞可以存活在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細胞可以存活7 71010天，并可以分泌一些細胞因子支持其他細天，并可以分泌一些細胞因子支持其他細胞的克隆生長胞的克隆生長。巨噬細胞巨噬細胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化將其消化。利用利用9696孔板將極少培

52、養(yǎng)細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，孔板將極少培養(yǎng)細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細胞、極大地降低微生物可以在高度稀釋培養(yǎng)細胞、極大地降低微生物污染程度地同時，更有效地發(fā)揮巨噬細胞清除污染程度地同時，更有效地發(fā)揮巨噬細胞清除污染的效能污染的效能。與與抗生素聯(lián)合應用效果更佳?？股芈?lián)合應用效果更佳。 細胞計數(shù)法細胞計數(shù)法胎盤蘭染色法胎盤蘭染色法MTTMTT比色法比色法細胞生長曲線法細胞生長曲線法 3 3H-H-TdRTdR( (3 3H-H-胸腺嘧啶核苷）摻入法胸腺嘧啶核苷）摻入法BrdUBrdU (5-bromo-2 (5-bromo-2deoxyuridinedeoxyuridine，5- 5-

53、溴脫氧溴脫氧尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷 ）摻入法）摻入法細胞計數(shù)法是用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中細胞計數(shù)法是用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調(diào)整細胞濃度。的細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調(diào)整細胞濃度。細胞計數(shù)結(jié)果以細胞數(shù)細胞計數(shù)結(jié)果以細胞數(shù)/ /毫升表示毫升表示將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并，并將蓋片蓋將蓋片蓋在計數(shù)板上。在計數(shù)板上。將將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使，使懸液充滿懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。蓋片和計數(shù)板之間。靜靜置置3 3分鐘。分鐘。鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)鏡下觀察，計算計數(shù)板

54、四大格細胞總數(shù)，壓線，壓線細胞只細胞只計左側(cè)和上方的計左側(cè)和上方的按下按下式計算：式計算：（細胞懸液的細胞數(shù)）（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml/ml （四（四個大格子細胞數(shù)個大格子細胞數(shù)/4)/4)稀稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)10104 4 /ml /ml公式中除以公式中除以4 4因為計數(shù)了因為計數(shù)了4 4個大格的細胞數(shù)個大格的細胞數(shù)。公式公式中乘以中乘以10104 4因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 1.0mm1.0mm（長）（長）1.0mm1.0mm（寬）（寬）0.1mm0.1mm（高）（高）0.10.1mmmm3 3 而而 1ml1ml10001000mmmm3 3 。要求

55、懸液中細胞數(shù)目不低于要求懸液中細胞數(shù)目不低于10104 4個個/ml/ml，如果細，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。要求要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。數(shù)準確性。取樣取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更應該每次取樣都要混勻，以求次取樣計數(shù)時更應該每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確。計數(shù)準確。數(shù)數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時只按照一個細胞計算成團時只按照一個細胞計算。如果如果細胞壓在

56、格線上時，則只計上線，不計下細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。線，只計左線，不計右線。 操作操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。 在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，活細胞所占總細胞中的百分比叫做活細胞所占總細胞中的百分比叫做細胞活力細胞活力。由由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇復蘇后的細胞也要檢查活力，了

57、解凍存和復蘇的后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。效果。細胞死亡細胞死亡后，細胞膜通透性改變，臺盼藍大量進后，細胞膜通透性改變，臺盼藍大量進入細胞內(nèi)而不被排出呈藍色?；罴毎x擇性強，入細胞內(nèi)而不被排出呈藍色?；罴毎x擇性強，不易著色不易著色0.5ml0.5ml臺盼藍臺盼藍0.3ml0.3ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液0.2ml0.2ml細胞懸液細胞懸液 染色染色5 515min15min 至少計數(shù)至少計數(shù)500500個細胞中著色細胞數(shù)個細胞中著色細胞數(shù) 細胞活力細胞活力= =（總細胞數(shù)著色細胞（總細胞數(shù)著色細胞)/ )/總細胞數(shù)總細胞數(shù)100100 原理原理：活細胞線粒體中：活細胞線粒體中琥珀酸脫氫

58、酶琥珀酸脫氫酶能將能將MTTMTT黃色溶黃色溶液還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物顆粒（液還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物顆粒（formazanformazan) )，并，并沉積在細胞中。二甲基亞砜（沉積在細胞中。二甲基亞砜（DMSODMSO）或酸性異丙醇）或酸性異丙醇能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺（以（以O(shè)DOD值表示）與所含的值表示）與所含的formazanformazan量成正比。可反映量成正比。可反映活細胞的代謝水平。而死細胞沒有這種活細胞的代謝水平。而死細胞沒有這種功能功能MTTMTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞法簡單快速、準

59、確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等加入培養(yǎng)液量加入培養(yǎng)液量10的的MTT(5g/L)，繼續(xù)，繼續(xù)34h培養(yǎng)培養(yǎng)吸去培養(yǎng)液，加入等量異丙醇或吸去培養(yǎng)液，加入等量異丙醇或DMSO，振蕩，振蕩10min 490/630nm 測定測定OD值值細胞存活率實驗組細胞存活率實驗組OD值值/對照組對照組OD值值100觀察同一代細胞的增殖過程，根據(jù)細胞生長曲觀察同一代細胞的增殖過程，根據(jù)細胞生長曲線分析細胞的增殖速度，確定具體實驗、細胞線分析細胞的增殖速度，確定具體實驗、細胞傳代、細胞凍存的最佳時間傳代、細胞凍存的最佳時間計數(shù)細胞濃度，等量加入培養(yǎng)板各孔，培

60、養(yǎng)計數(shù)細胞濃度，等量加入培養(yǎng)板各孔，培養(yǎng)7 7天天 以以接種時間始，接種時間始， 每隔每隔24h24h計數(shù)計數(shù)3 3孔細胞數(shù)目，取孔細胞數(shù)目，取均值均值 以橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為細胞濃度以橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為細胞濃度（10104 4 /ml) /ml)注：注：1 1、各孔消化時間應一致。、各孔消化時間應一致。 2 2、計數(shù)細胞前應混勻。、計數(shù)細胞前應混勻。 3 3H-H-TdRTdR摻入法摻入法是將用是將用 3 3HH標記的胸腺嘧啶脫氧核標記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到新合成的苷摻入到新合成的DNADNA中，通過測定中，通過測定 3 3HH放射性放射性脈沖數(shù)比較不同細胞的增殖活性。脈沖數(shù)