第二章熒光光譜與熒光信號(hào)采集處理

1、第二章 熒光光譜與熒光信號(hào)采集處理1.熒光的產(chǎn)生熒光（Fluorescence）： 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)以光的形式釋放出它所吸收的能量，這種光即稱為光致發(fā)光： 利用光源激發(fā)而產(chǎn)生，熒光和磷光均為光致發(fā)光.共聚焦顯微鏡常涉及的光譜區(qū)域共聚焦顯微鏡常涉及的光譜區(qū)域激發(fā)光(EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光的激發(fā)光。 激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長)激發(fā)光譜： 又稱熒光激發(fā)光譜，通過測(cè)量熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長變化而獲得的光譜。實(shí)質(zhì)： 反映了不同波長激發(fā)光所激發(fā)出熒光的相對(duì)效率。發(fā)射光譜： 又

2、稱熒光發(fā)射光譜，反映熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射光波長之間相互關(guān)系的光譜曲線。受激光照射后所發(fā)出的熒光不是單一波長，而是由許多不同波長所組成的光譜曲線 實(shí)質(zhì)： 反映了所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對(duì)強(qiáng)度。二者關(guān)系: 物質(zhì)發(fā)生電子從基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷過程中吸收的能量，要高于熒光發(fā)射的能量，因此，熒光的波長要大于激發(fā)光的波長，兩者的差值稱為 Stokes shift（斯托克斯位移）。激發(fā)和發(fā)射之間存在著能量損失激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的用途 是選擇和使用熒光探針、鑒別不同熒光物質(zhì)的依據(jù) 2.熒光的淬滅 由于各種原因，使熒光探針的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。 能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為淬滅劑。 熒光的

3、淬滅原因（內(nèi)因與外因） 外因的影響因素：光照射最常見的因素，會(huì)引起碰撞淬滅熒光分子與外部分子形成非熒光的絡(luò)合物共振能量的轉(zhuǎn)移溶劑種類、pH值溫度 光漂白光漂白如何避免：使用低強(qiáng)度激發(fā)光，盡量縮短采集時(shí)間；使用閃爍光源，避免一直激發(fā)使用一些有效的熒光保護(hù)劑，延緩熒光淬 滅時(shí)間。3.熒光探針： 能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）。 熒光探針的發(fā)展非常迅速，目前僅美國 Molecular Probes公司就可提供1800多種熒光探 針，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通 常每種被測(cè)物質(zhì)都有幾種或幾十種特異的熒光 探針。 選擇合適的熒光探針是有效

4、地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并獲取理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。理想熒光探針的標(biāo)準(zhǔn)：準(zhǔn)確真實(shí)地測(cè)出所需要檢測(cè)的指標(biāo)；不影響細(xì)胞固有的狀態(tài)；盡量減小不同熒光物質(zhì)間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。熒光探針的選擇 已經(jīng)商品化的熒光探針有數(shù)千種，可以根據(jù)自己研究課題的需要進(jìn)行選擇。 1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募八獧z測(cè)的指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)中選擇使用何種熒光探針是由實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定的，如待測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子 選擇范圍就限定為標(biāo)記活細(xì)胞鈣離子的探針等。 Molecular Probes, Inc 商品探針價(jià)目Probes for ProteinsProbe Excitation EmissionFITC 488525PE 488575APC 630650PerC

5、P 488680Cascade Blue 360450Coumerin-phalloidin 350450Texas Red 610630Tetramethylrhodamine-amines 550575CY3 (indotrimethinecyanines) 540575CY5 (indopentamethinecyanines) 6406702. 考察熒光探針的特異性和毒性 考察的熒光特性包括：熒光探針與樣品的反應(yīng)性： 選擇性或?qū)Ｒ恍裕?探針的跨膜特性；如標(biāo)記核的探針AO/ PI 反應(yīng)條件（濃度、溫度、pH值、作用時(shí)間、反應(yīng)介質(zhì)）； 熒光探針是否對(duì)樣品有毒副作用等干擾。熒光強(qiáng)度應(yīng)用細(xì)胞毒

6、性熒光強(qiáng)度應(yīng)用細(xì)胞毒性PIViable Cell Damaged Cell PI：細(xì)胞核熒光染料 熒光探針的靈敏度及熒光強(qiáng)度 光吸收效率（摩爾消光系數(shù)）和熒光量子產(chǎn)率能反映探針靈敏度及強(qiáng)度。在選擇時(shí)，盡量挑選這兩個(gè)數(shù)值高的探針。 熒光探針標(biāo)記后樣品的光譜特性 了解探針的穩(wěn)定性和光漂白性 對(duì)光照、熒光物質(zhì)的濃度、探針?biāo)诘慕橘|(zhì)、溫度的穩(wěn)定性等。如光照下容易淬滅，注意避光濃度低，熒光強(qiáng)度低；濃度太高，熒光強(qiáng)度也下降 樣品中 之間的相互影響 多重?zé)晒庥脙煞N或兩種以上熒光探針標(biāo)記同一樣品中不同成分或結(jié)構(gòu)的方法。常用于分子的細(xì)胞內(nèi)定位、檢測(cè)熒光原位雜交信號(hào)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞融合、細(xì)胞外藥物跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)等。 樣

7、品中多重?zé)晒庵g的相互影響主要表現(xiàn)為光譜交叉（竄色）。光譜交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection兩色以上熒光分析存在 光譜交叉熒光光譜拆分紅色熒光顯示微絲黃色顯示微管蘭色顯示細(xì)胞核3.考察熒光探針與所用共聚焦系統(tǒng)的匹配情況 主要指：二者的激發(fā)波長要匹配；儀器的性能能否達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，如掃描速度能否檢測(cè)到熒光信號(hào)的快速變化等。廣譜性的熒光染料（探針） 苯胺藍(lán)、焦寧Y（pyronin Y） 羅丹明B（rhodamine B） 熒光素（fl

8、uorescein） 曙紅Y（eosin Y） 吖啶橙（acridine orange）專一性的熒光染料（探針） 核酸檢測(cè)探針：DAPI、PI、YOYO、TOTO 肽和蛋白質(zhì)檢測(cè)探針：Fluorescamine，OPA， BCA method 酶檢測(cè)探針：EnzChekTM 5Nucleotidaes Assay kit 細(xì)胞骨架探針：微管探針、微絲探針常用熒光探針舉例1.標(biāo)記細(xì)胞器的熒光探針1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子, 可檢 測(cè)線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留時(shí)間 短（慢反應(yīng)線粒體膜電位探針） JC1 線粒體膜電位低時(shí)

9、為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測(cè)線粒體膜電 位最佳探針Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 , 穩(wěn)定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitotracker Orange 還原型, 只能染活細(xì)胞 2)溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器 官為非特異性3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較低濃度

10、標(biāo)記線粒體4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 5)細(xì)胞核PI propidiumiodide 536/617 DNA/RNA 死細(xì)胞EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞AO 500/526 DNA 活細(xì)胞 500/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞SYTO1116 2024

11、488/ 520 活細(xì)胞SYTO1116 2024 521/ 556 活細(xì)胞SYTO 17 621/634 活細(xì)胞2. pH熒光探針SNAFL-calcein-AM：胞漿pH熒光探針，吸收波長為 506nm，發(fā)射波長為530nm、605nm； 適用于單激發(fā)雙發(fā)射測(cè)量。BCECF-AM：胞漿pH熒光探針，吸收波長482nm,發(fā) 射波長520nmFITCdextran：通過胞飲作用進(jìn)入溶酶體。適用于 pH值范圍是46。3.常見膜電位熒光探針DiBAC4(3)膜電位慢反應(yīng)熒光探針，吸收峰波長340nm，發(fā)射波長517nm，在生理液中帶有負(fù)電荷。僅存在于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核不會(huì)著色。原理：膜電位超級(jí)化使胞

12、漿中探針濃度增加，二聚體增多，熒光強(qiáng)度降低；膜電位去極化時(shí)探針排出，胞漿內(nèi)單體增加，熒光強(qiáng)度增加。Rhodamine123慢反應(yīng)線粒體膜電位探針，吸收峰波長為505nm，發(fā)射峰波長534nm。染色后胞漿和線粒體中均有熒光探針。根據(jù)實(shí)驗(yàn)記錄的細(xì)胞熒光圖像。圈定粒體區(qū)域和胞漿區(qū)域計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。4.膜磷脂流動(dòng)性NBD-C6-HPC為磷脂特異性熒光標(biāo)記探針。吸收波長為466nm，發(fā)射波長531nm。 這種探針的熒光在強(qiáng)光源照射下會(huì)產(chǎn)生光漂白效應(yīng)，可用熒光漂白后重恢復(fù)技術(shù)（Fluorescence Recovery After Photobleaching,FRAP）測(cè)量膜磷脂的流動(dòng)性。FRAP：借

13、助高強(qiáng)度、脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的淬滅，通過低強(qiáng)度激光掃描，可以探測(cè)到該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子向照射區(qū)域擴(kuò)散的速率。觀察熒光分子在活細(xì)胞中的流動(dòng)熒光恢復(fù)漂白脂膜流動(dòng)性的測(cè)試原理 4.熒光圖像的采集、處理與定量測(cè)定4.1 采集的圖像類型與處理 采集的圖像分為兩種: 熒光圖像 光學(xué)圖像?？蓪?shí)現(xiàn)如下圖像采集功能： 1) 單獨(dú)采集熒光或光學(xué)圖像; 2) 分通道同時(shí)采集多重?zé)晒鈭D像和透射光圖像，并通過疊加使之同時(shí)展示在一幅畫面上；overlayoverlayoverlay 3)可完成斷層掃描、三維重建、時(shí)間動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及波長掃描等。4.2 采圖方法 逐層采集二維及三維熒光像高分辨率XY平面牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 ，微管轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP的菌絲體高分辨率XY平面高分辨率XY平面檢測(cè)人類癌細(xì)胞表皮生長因子高分辨率XY平面培養(yǎng)的293細(xì)胞中的綠色熒光蛋白（GFP）高分辨率XY平面培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞吖啶橙染色高分辨率XY平面 牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞藍(lán)色：Hoechst 33342 染DNA紅色：PI，染核仁RNA綠色：Alexa Fluor 488染肌絲蛋白選擇感興趣的區(qū)域（regions ofinterest,ROI)512 x 512512 x 512 Zoom IN三維膠原基質(zhì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞三維膠原基質(zhì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞 透射光圖像 利用熒光與透射光同時(shí)掃描，進(jìn)行共定位