細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法定義：根據(jù)細(xì)胞中的各顆粒（亞細(xì)胞成分和生物大分子及其復(fù)合物）在離心場中沉降速率不同，而把它們區(qū)分開來的技術(shù)，用來研究細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和其他組分的化學(xué)性質(zhì)和功能。 按轉(zhuǎn)速分： 普通離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)（1105 rpm以上）。 按分離基礎(chǔ)不同分： 差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分。 密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離。基本原理: 當(dāng)懸浮液靜止不動(dòng)時(shí)，由于重力場的作用，較大的懸浮顆粒會(huì)逐漸沉降，顆粒越重下沉越快，反之會(huì)上浮。但很小的顆粒不僅沉降速度慢，而且擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重，很難或根本無法沉降。這樣就需離心的方法產(chǎn)生出離心力場，使之產(chǎn)生沉降。一般步驟：

2、勻漿化：破壞細(xì)胞，使細(xì)胞崩解。方法有：低滲、超聲波粉碎、強(qiáng)制過濾、研磨等； 離心處理； 收集分析。沉降系數(shù)（Sedimentation Coefficient） 顆粒在離心場中的沉降速度的大小與顆粒大小、形狀、密度、離心力、懸浮介質(zhì)的密度和粘度有關(guān)。單位離心力場中溶質(zhì)分子的沉降速度稱為沉降系數(shù)通過下式計(jì)算：S=dx /dt/2xx：顆粒到轉(zhuǎn)頭中心距離（cm）；. ：角速度（弧度/秒）；dx/dt：沉降速度；S：沉降系數(shù)（單位：秒）。 各種顆粒都有一定的沉降系數(shù)，習(xí)慣上（規(guī)定）把10-13秒作為一個(gè)沉降系數(shù)單位，簡寫成S（Svedberg unit，斯維得伯格單位，瑞典人，1926年設(shè)計(jì)超速離心

3、機(jī)，因此獲諾貝爾獎(jiǎng)。） 如某一蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)為5S，說明它的沉降系數(shù)實(shí)際上是510-13秒，S值越大，說明顆粒的沉降速度越大。 離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)（轉(zhuǎn)/分，用rpm或r/min表示）與重力加速度（g）是什么關(guān)系呢？ 相對離心力（RCF）以重力常數(shù)（980 cm /秒）的倍數(shù)表示： RCF（g）=42（rpm）2 r /3600980，整理化簡 g =1.1110-5（rpm）2 r。實(shí)際應(yīng)用時(shí)可查表直接得出。 離心方法的選擇 根據(jù)分離對象和目的不同，采用不同的離心方法。 制備離心 (preparative centrifuge) 分離和純化亞細(xì)胞成分和大分子，目的是制備樣品。 差速離心法：是最常用的

4、方法，根據(jù)不同離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分離開來。 此方法可有效的分離大小上差別較大的顆粒，但不能分離大小相似的顆粒，而且分離出來的組分往往不純，混有其他性質(zhì)的顆粒。 差速離心（P64圖3-18） 分析離心（analytical centrifuge） 分析和測定制劑中純的大分子的種類和性質(zhì)，如浮力密度和分子量、生物大分子的構(gòu)象變化、分析樣品的純度等。此工作必須是在制備離心的基礎(chǔ)上進(jìn)行。密度梯度離心法是最常用的方法。 密度梯度離心法又稱為區(qū)帶離心法，用于沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)的分離，可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組分分離。不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，

5、顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成不同的沉降帶的方法。單一的酶都可分離。 常用介質(zhì)有蔗糖、氯化銫。 分為： 速度沉降：密度相近而大小不一組分。（梯度濃度） 等密度沉降：不同密度組分。連續(xù)密度高濃度介質(zhì)離心力場長時(shí)間作用。十分靈敏，可分辨到同位素級別。（連續(xù)梯度）密度梯度離心差速離心 原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯 色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來 判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。 一）化學(xué)顯示劑法基本原理： 利用某些化學(xué)物質(zhì)和某些細(xì)胞成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合，從而顯示出一定的顏色，進(jìn)行定性和定位研究的方法。1、Feulgen reaction

6、酸水解去除RNA，并除去嘌呤，醛基與希夫（schiff）試劑作用形成紫紅色。2、Brachet reaction 甲基綠派羅寧染色顯示RNA 3、P.A.S reaction 過碘酸氧化作用破壞多糖的1，2乙二醇基，使醛基暴露，與Schiff試劑作用顯示紫紅色。4、四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，由此證明脂肪滴的存在。5、堿性磷酸酶的格莫瑞法（Gomori） 堿性磷酸酶 Ca2+ 轉(zhuǎn)變甘油的磷酸脂 釋放P043- Ca3（P04）2 金屬銀、硫化鉛等有色化合物。免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限?？焖佟㈧`敏、有特異性，但其分辨率有限。 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)：

7、免疫鐵蛋白技術(shù)（已很少用）免疫鐵蛋白技術(shù)（已很少用）免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等的定位等。 基本原理基本原理：將免疫學(xué)中抗原、抗體以及補(bǔ)體間專一性反應(yīng)結(jié)合顯微或亞顯微組織學(xué)的一些研究方法的統(tǒng)稱。是免疫學(xué)原理與光鏡或電鏡技術(shù)的結(jié)合。 一般說來，發(fā)生在組織細(xì)胞內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)是不可見的，但如果事先將某種熒光素、酶、同位素、鐵蛋白等用生化方法標(biāo)記在抗體分子上（標(biāo)記抗體），或用血清學(xué)方法

8、將酶與其抗體形成可溶性物質(zhì)，就能憑借特殊光鏡及電鏡等觀察標(biāo)本中的熒光現(xiàn)象、酶作用的沉淀物（顏色）、放射線徑跡及高電子密度物質(zhì)的有無和部位，由此判斷是否發(fā)生了特異性的抗原抗體反應(yīng)以及抗原物質(zhì)的定位分布。因此利用此技術(shù)可以： 1）對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的抗原進(jìn)行定位；2）了解抗體合成過程中的動(dòng)態(tài)變化；3）抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)；4）鑒定免疫損傷引起的細(xì)胞病理變化等。一般步驟：1、抗原的選擇 抗原：能引起抗體產(chǎn)生的外源性物質(zhì)稱為抗原?？捎煞蛛x獲取或直接購買（商品抗原）。蛋白質(zhì)分子量在 1萬以上，才有較好的抗原性。各種抗原分子表面有特殊的基因，這些基因在組成、排列和空間結(jié)構(gòu)上的不同，決定著抗原抗體反應(yīng)的

9、特異性。 抗原分為： 天然抗原 來源于動(dòng)、植物、細(xì)菌、病毒； 人工抗原 經(jīng)化學(xué)修飾的天然抗原； 合成抗原 化學(xué)合成的高分子。 2、抗體分離與提純 當(dāng)需要某種抗體時(shí)，要用特異抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫（即用抗原物質(zhì)反復(fù)給動(dòng)物或人體注射），然后再從人體或動(dòng)物的血清中提取該抗體。完成這一工作常采取戊二醛直接交聯(lián)法和蛋白質(zhì)A親合層析法。3、抗體的標(biāo)記 抗體標(biāo)記的方法很多，有鐵蛋白標(biāo)記法、免疫酶標(biāo)記法、免疫金標(biāo)記法、雜交抗體標(biāo)記法、搭橋標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法、熒光標(biāo)記法等，以下介紹幾種常用標(biāo)記法。（1）免疫熒光法（熒光標(biāo)記抗體法） 用結(jié)合有熒光素的抗體與組織內(nèi)抗原反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。也可分為直

10、接法和間接法。 直接法：抗體直接與熒光素相連 間接法：先用一種抗體（第一抗體）結(jié)合到抗原部位，然后再用能識(shí)別第一抗體的另一抗體（第二抗體）把標(biāo)記物引入抗原部位。是在抗原抗體一級反應(yīng)的基礎(chǔ)上，又增加了同第一抗體反應(yīng)的熒光素標(biāo)記的第二抗體。 間接免疫法只需標(biāo)記一種或少數(shù)幾種第二抗體，就可適應(yīng)多種研究對象的需要，并且由于第一抗體的一個(gè)分子可能為第二抗體提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，故具有染色放大的作用。免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)（2）免疫電鏡技術(shù) 膠體金標(biāo)記抗體 膠體金是利用還原劑將氯化金分子聚合成具有特定大小的顆粒結(jié)構(gòu)，1970年引入免疫電鏡技術(shù)。由于膠體金顆粒可以制成預(yù)定的大小，形態(tài)規(guī)則，電子密度高，對細(xì)胞無

11、毒性等優(yōu)點(diǎn)，故是當(dāng)今最為廣泛的標(biāo)記物。 當(dāng)用免疫球蛋白包被膠體金后則稱為免疫金，是一種在光鏡或電鏡下易辨認(rèn)的標(biāo)記物。 膠體金可以直接與抗體連接形成免疫金，導(dǎo)至抗原部位，稱為直接免疫法。也可以先用一種抗體（第一抗體）結(jié)合到抗原部位然后用可以識(shí)別第一抗體。的另一抗體（第二抗體）把標(biāo)記物（膠體金）引入同一部位。這稱為間接免疫法。免疫膠體金技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)：1966年由NaKane和Piere提出。用雙功能的偶聯(lián)劑使酶與抗體相結(jié)合形成酶標(biāo)抗體。最常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），是一種氧化還原酶，其抗體與體內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合，然后利用其酶的特殊催化作用使底物轉(zhuǎn)變成電子致密的沉淀物，從而在電鏡下檢出抗體的

12、反應(yīng)部位，用以定位和定量檢測抗原。如：抗羊球蛋白用過氧化物酶標(biāo)記，用以催化H2O2+二氨基聯(lián)苯胺形成棕色密電子沉淀物。1.原理 用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交（變性-退火-復(fù)性）確定特異核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法稱為原位雜交。可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。 2.標(biāo)記物 同位素如3H、35S、32P、 熒光（FISH）探針核苷酸標(biāo)記報(bào)告分子（生物素、地高辛）與被熒光標(biāo)記的親和素特異性結(jié)合而顯熒光。 膠體金 3.應(yīng)用 基因定位（FISH在小麥遠(yuǎn)緣雜交中的利用）、特異mRNA表達(dá)1.原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影（電離輻射的感光作用），對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究

13、；用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。 2.步驟：滲入：放射性同位素標(biāo)記生物大分子前體（常用同位素P68表3-3），前體物導(dǎo)入生物體內(nèi)（持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）； 由于有機(jī)大分子均含有碳、氫原子，故實(shí)驗(yàn)室一般常選用14C14C和3H3H標(biāo)記。14C和3H均為弱放射性同位素，半衰期長，14C為5760年，3H為12年。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR）來顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，研究多糖則用3H甘露糖、3H巖藻糖等。制片、敷膠：經(jīng)過一段時(shí)間后，取材制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠

14、； 曝光：經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光，自顯影（曝光）數(shù)天，如制超薄切片，乳膠單層晶體層，曝光數(shù)月；顯影：然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒；鏡檢：分析自顯影圖像（光顯，電顯）即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)行定位或相對定量測定。 （P69圖3-22）（一）流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） 對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群

15、從中分選出來。 （二）細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry） 利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括： 紫外光顯微分光光度測定法 可見光顯微分光光度測定法 將流體噴射技術(shù)、激光技術(shù)、空氣技術(shù)、射線能譜術(shù)及電子計(jì)算機(jī)等技術(shù)與顯微熒光光度計(jì)密切結(jié)合的一種非常先進(jìn)的檢測儀器。通過測量細(xì)胞及其他生物顆粒的散射光和標(biāo)記熒光強(qiáng)度，來快速分析顆粒的物理或化學(xué)性質(zhì)，并可以對細(xì)胞進(jìn)行分類收集，可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測得多個(gè)細(xì)胞特征參數(shù)，進(jìn)行定性或定量分析，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。 P70圖3-23

16、用于定量測定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量。 測定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；主要應(yīng)用：細(xì)胞周期- DNA倍體分析、 DNA含量分析；免疫學(xué)-對淋巴細(xì)胞分析，鑒別免疫功能狀態(tài)，藥物篩選;腫瘤診斷-癌基因蛋白產(chǎn)物、 DNA含量測定是鑒別良 性、惡性腫瘤的特異指標(biāo)?；驹砘驹?光是電磁波，具有不同分子結(jié)構(gòu)的無機(jī)、有機(jī)體系，對電磁波都可顯示出選擇性吸收的特性，根據(jù)這一特性，可以進(jìn)行無機(jī)、有機(jī)體系的定性、定量分析，也可對生命過程中的物質(zhì)變化進(jìn)行動(dòng)力學(xué)的分析。（二）細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）代表儀器Univ

17、ar掃描顯微分光光度計(jì) 結(jié)構(gòu)包括：顯微鏡、光度測量裝置、電學(xué)系統(tǒng)、電子計(jì)算機(jī)等。 功能包括：透射、落射、明視野、暗視野、螢光、相差、微分干涉、微處理機(jī)、打印繪圖機(jī)、電視錄放相系統(tǒng)。 l原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動(dòng)速度不同。l利用利用 ：活細(xì)胞分離（X、 Y精子），研究生命結(jié)構(gòu)的表面性質(zhì)，鑒定細(xì)胞或單細(xì)胞有機(jī)體的功能和病理狀態(tài) 。 一、細(xì)胞的培養(yǎng) 二、細(xì)胞工程 定義：從機(jī)體取出某種組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件使其在體外生存、生長和繁殖的過程。是當(dāng)前

18、細(xì)胞生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 (一) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) （二）植物細(xì)胞 （三）非細(xì)胞體系（cell-free system） 1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：液體合成培養(yǎng)基，通常含動(dòng)物血清。 無菌、無毒的環(huán)境：對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無菌處理，通常還要在培養(yǎng)液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物累積對細(xì)胞自身產(chǎn)生危害。 營養(yǎng)物質(zhì)：無機(jī)物（無機(jī)鹽、微量元素等），有機(jī)物（糖、氨基酸、促生長因子等） 血清和血漿 (提供細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份) 溫度和pH（36.50.5，） 氣體環(huán)境（95%的空氣+5%CO2的混合氣體） 其

19、中5%CO2氣體是為保持培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定 2.基本過程 選材：取動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物器官無菌處理。 消化分散：將材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用膠原蛋白酶）處理（消化），形成分散的單個(gè)細(xì)胞，將處理后的細(xì)胞移入培養(yǎng)基中配成一定濃度的細(xì)胞懸浮液。 無菌培養(yǎng)： 原代培養(yǎng)（生物性狀未發(fā)生較大改變，在一定程度反映體內(nèi)狀態(tài)） 細(xì)胞貼壁 （幾十分鐘至數(shù)小時(shí)后，小牛血清利于貼壁） 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到互相接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，出現(xiàn)接觸抑制。 （非正常 細(xì)胞如癌細(xì)胞除外）。 單層細(xì)胞培養(yǎng)（空間、營養(yǎng)減少）此時(shí)需要將出現(xiàn)接觸抑制的細(xì)胞重新使用胰蛋白酶處理。再配成一定濃度的細(xì)胞懸浮液。 傳代培養(yǎng)（即將原代培養(yǎng)細(xì)胞

20、分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長、增殖?？蓡螌蛹?xì)胞培養(yǎng)，也可懸浮培養(yǎng)獲得大量細(xì)胞，但條件復(fù)雜。）危機(jī)1： 傳10代左右生長停滯、衰老死亡-多數(shù)危機(jī)2：少數(shù)細(xì)胞可傳40-50代，遺傳物質(zhì)不變和接觸抑制-有限細(xì)胞系 遺傳突變，失去接觸抑制，無限傳代-永生細(xì)胞系 選擇有用單個(gè)細(xì)胞增殖-細(xì)胞克隆 生物學(xué)鑒定，具有特殊遺傳標(biāo)記或性質(zhì)-細(xì)胞株細(xì)胞系Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng) 成纖維樣細(xì)胞：指棱形的平行排列或交叉成網(wǎng)的細(xì)胞上皮樣細(xì)胞：指形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰，排列緊密的六角形細(xì)胞1.生物制品的生產(chǎn)(如制備單克隆抗體） 2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培養(yǎng) 3.檢測有毒物質(zhì)并判斷其強(qiáng)弱 4.醫(yī)學(xué)研究

21、（生理 病理 藥理） 5.器官移植培養(yǎng) 6.篩選抗癌藥物 1.培養(yǎng)基不同：植物細(xì)胞（固體培養(yǎng)基），動(dòng)物細(xì)胞（液體培養(yǎng)基） 。2.培養(yǎng)基的成分不同：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)必須利用動(dòng)物血清，植物組織培養(yǎng)則不需要。 3.產(chǎn)物不同：植物組織培養(yǎng)最后一般得到新的植物個(gè)體，而動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)因?yàn)閯?dòng)物體細(xì)胞一般不能表達(dá)其全能性，因此得到的是同一種的細(xì)胞。 4.原理不同：植物組織培養(yǎng)的原理為植物細(xì)胞的全能性，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的原理為細(xì)胞的增殖。 5.過程不同：植物組織培養(yǎng)的過程為脫分化和再分化，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。非細(xì)胞體系：非細(xì)胞體系：指來源于細(xì)胞，而不具備完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與成分，但包含了進(jìn)行正常生物學(xué)反應(yīng)

22、所需物質(zhì)組成的體系。主要用于研究DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、細(xì)高爾基體的膜泡運(yùn)輸機(jī)制以及胞核組裝配等方面的問題。 例如：非洲爪蟾卵提取物非細(xì)胞體系 P73 圖3-25（三）非細(xì)胞體系在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用 細(xì)胞工程是生物工程的一個(gè)重要方面?？偟膩碚f，它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，進(jìn)行在細(xì)胞水平上的遺傳操作及進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞和組織培養(yǎng)。 細(xì)胞工程的主要研究內(nèi)容： （一） 細(xì)胞融合（新的物種或品系） （二） 單克隆抗體技術(shù) （三）細(xì)胞拆合與顯微操作 細(xì)胞核移植（無性繁殖、克隆動(dòng)物） 染色體工程（多倍體育種，例：八倍體小黑麥） 胚胎工程（優(yōu)良品種、試管嬰兒

23、） 干細(xì)胞與組織工程（胚胎干細(xì)胞、組織干細(xì)胞） 轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物） （一）融合核細(xì)胞（兩個(gè)核融合為一個(gè)核）（二）單克隆抗體（二）單克隆抗體（monoclone antibody）技術(shù)）技術(shù)（三）細(xì)胞拆合與顯微操作細(xì)胞拆合：也叫細(xì)胞核移植，即利用物理或化學(xué)的方法，從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，然后在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)重組，使其裝配成具有生物活性的核質(zhì)雜交細(xì)胞。用于探明細(xì)胞核質(zhì)互作關(guān)系。 這一技術(shù)首先要制備核體和胞質(zhì)體，最常使用方法是物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)制備 中國胚胎學(xué)家童第周先生等在魚類細(xì)胞核移植方面做了許多工作。他們

24、在1976年前后首次獲得的鯉鯽移核魚，不僅有理論意義，而且也為魚類育種開辟了一條新的途徑。 鏡下微米玻璃微量注射器將外源物注入細(xì)胞。顯微切割：顯微切割術(shù)(microdissection)是90年代初發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它能夠從組織切片或細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個(gè)、幾十個(gè)同類細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞，再進(jìn)行有關(guān)的分子生物學(xué)方面的研究，如PCR，PCRSSCP及比較基因組雜交等。尤其適用于腫瘤的分子生物學(xué)研究，如腫瘤的克隆性分析，腫瘤發(fā)生和演進(jìn)過程中各階段細(xì)胞基因改變的比較研究和腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些酶活性的定量檢測等。該技術(shù)的不足之處是使用手工操作的技術(shù)難度大。 光鑷技術(shù)：激光聚集可形成光阱，微小物

25、體受光壓而被束縛在光阱處，移動(dòng)光束使微小物體隨光阱移動(dòng)，借此可在顯微鏡下對微小物體(如病毒、細(xì)菌以及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器及細(xì)胞組分等)進(jìn)行的移位或手術(shù)操作。進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說設(shè)計(jì)對照試驗(yàn)收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識(shí)科學(xué)研究的一般思路和程序不同物種享有共同分子機(jī)制不同物種享有共同分子機(jī)制 生物是從共同祖先演化而來的，所以對生命活動(dòng)有重要功能的基因在進(jìn)化上是保守的，也就是說，這些基因的結(jié)構(gòu)和功能，在低等生物和高等生物中是相似的。因此，可以用比較容易研究的生物作為模型來研究其基因的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，由此獲得的信息可以使用于其他比較難以研究的生物，特別是推測相似的人體基因的功能。1 1

26、）其生理特征能夠）其生理特征能夠代表生物界的某一大代表生物界的某一大類群；類群；4 4）容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，）容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，特別是遺傳學(xué)分析。特別是遺傳學(xué)分析。2 2）容易獲得并易于在）容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖；3 3）世代短、子代多）世代短、子代多、遺傳背景清楚；、遺傳背景清楚； 一種模式生物應(yīng)一種模式生物應(yīng)具備的特點(diǎn)具備的特點(diǎn)最常見的模式生物逆轉(zhuǎn)錄病毒 (retrovirus)大腸桿菌(Escherichiacoli)酵母(budding yeast(Saccharomyces cerevisiae) fission yeast (Schizosaccharomycespombe)秀麗線蟲(Caenorha