論文--乙腦疫苗生產(chǎn)

1、 畢業(yè)論文（頂崗實(shí)習(xí)作業(yè)文件）2009 /2010學(xué)年（二）學(xué)期題 目 乙腦疫苗生產(chǎn) 專 業(yè) 生物技術(shù)與應(yīng)用 班 級(jí) 生物0712 姓 名 蔡春劍 指導(dǎo)教師 蔣志城 2010年5 月25 日 杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)論文（頂崗實(shí)習(xí)技能訓(xùn)練）任務(wù)書專 業(yè)班 級(jí)生物技術(shù)及應(yīng)用生物0712學(xué)生姓名蔡春劍專業(yè)指導(dǎo)教 師蔣志城實(shí) 習(xí)單 位浙江天元生物股份有限公司崗位指導(dǎo)教 師孫海龍崗 位（工作分工）出血熱論文（技能訓(xùn)練）選 題乙腦疫苗生產(chǎn)選題依據(jù)：疫苗是目前人類唯一可以徹底消滅某一疾病的武器。近年來SARS、禽流感的爆發(fā)，生化恐怖襲擊的威脅、愛滋病傳播，新老疾病的流行，危機(jī)頻發(fā)促進(jìn)了疫苗產(chǎn)業(yè)的研制和發(fā)展，使

2、疫苗行業(yè)再次走到歷史的前臺(tái)。 乙腦疫苗預(yù)防乙腦可收到明顯的效果,1960年我國開始使用地鼠腎細(xì)胞組織培養(yǎng)滅活疫苗,一直沿用至今。80年代后期,我國又研制成功并使用乙腦減毒活疫苗。,90年代末對(duì)乙腦減毒活疫苗的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，并純化了乙腦減毒活疫苗，減少了副反應(yīng)。鑒于此進(jìn)行頂崗訓(xùn)練，造福人類。技能訓(xùn)練內(nèi)容、技能要求和訓(xùn)練目標(biāo)：1.內(nèi)容：地鼠取腎、組織消化，地鼠腎組織細(xì)胞分散，地鼠腎細(xì)胞沖洗感染，地鼠腎細(xì)胞種毒后換液。2.技能訓(xùn)練要求：詳見附件：專業(yè)（崗位）實(shí)習(xí)教學(xué)要求細(xì)則。3.訓(xùn)練目標(biāo)：了解并掌握地鼠取腎、組織消化，地鼠腎組織細(xì)胞分散，地鼠腎細(xì)胞沖洗感染，地鼠腎細(xì)胞種毒后換液的各個(gè)操作步驟。鍛

3、煉實(shí)際操作能力，積累工作經(jīng)驗(yàn)，學(xué)會(huì)分析，能及早發(fā)現(xiàn)問題并及時(shí)解決問題，鍛煉解決實(shí)際中異常情況的能力。任務(wù)書發(fā)給日期2010年 2月 28 日頂崗實(shí)習(xí)時(shí)間 2010 年 3 月 1 日至 2010 年 5 月 31 日專業(yè)負(fù)責(zé)人意見（簽名）：系（院）主任意見（簽名）：實(shí)習(xí)單位概況單位名稱 浙江天元生物股份有限公司單位地址 中國浙江省杭州市余杭區(qū)臨平天荷路56號(hào)企業(yè)文化和管理理念（基本情況）天元遵循“追求卓越，服務(wù)人類”的原則，為了預(yù)防疾病，滿足全球穩(wěn)步增長的市場(chǎng)需求，我們?cè)竿卣购蛧鴥?nèi)外研究機(jī)構(gòu)和疫苗制造商的合作。 天元的團(tuán)隊(duì)精神是掌握新技術(shù)、工藝和質(zhì)量等的關(guān)鍵，只有在共同分享知識(shí)、經(jīng)驗(yàn)、觀念的基

4、礎(chǔ)上，才能成為具有創(chuàng)造力的企業(yè)。 天元十分重視和尊重外國專家的作用和價(jià)值。我們將和他們一起推動(dòng)公司的國際化戰(zhàn)略。員工的個(gè)性、多樣性和創(chuàng)造力是企業(yè)在國內(nèi)外取得成功的關(guān)鍵。 天元獨(dú)特的企業(yè)文化是“培養(yǎng)人才，激勵(lì)創(chuàng)新”，實(shí)行以員工表現(xiàn)為基礎(chǔ)，實(shí)行競爭獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制。 我們促進(jìn)機(jī)會(huì)均等的承諾反映在以下核心價(jià)值： 正直，品德高尚 尊重個(gè)人獨(dú)立性和多樣性 開放，開明，誠實(shí)誠信 領(lǐng)導(dǎo)能力，榜樣作用企業(yè)主要產(chǎn)品和生產(chǎn)工藝簡介流感病毒裂解疫苗：以接種病毒到雞胚尿囊腔進(jìn)行繁殖開始。孵化一段時(shí)間后進(jìn)行收獲、滅活，再通過幾道不同的下游工序進(jìn)行純化。純化后的全病毒使用裂解劑裂解，然后進(jìn)一步純化得到原液。三種不同疫苗成分的生產(chǎn)

5、需分開單獨(dú)進(jìn)行。在最后一步中，這些成分按照適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行混合，然后分裝到注射器或西林瓶中腎綜合征出血熱疫苗：使用-丙內(nèi)脂滅活后，經(jīng)過離心、超濾、層析以及過濾等進(jìn)一步純化。最后加入人血白蛋白作為穩(wěn)定劑、氫氧化鋁佐劑以及硫柳汞作為防腐劑制成成品乙型腦炎純化疫苗：使用丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活，然后經(jīng)過離心、超濾、層析和過濾等一系列工序進(jìn)行純化。最終加入人血白蛋白作為穩(wěn)定劑以及硫柳汞作為防腐劑形成疫苗成品流腦多糖疫苗: 流腦疫苗生產(chǎn)始于將流腦菌接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行傳代，然后移至60L的種子罐進(jìn)行發(fā)酵，最后用600L的發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。流腦菌體收獲、滅活之后，多糖由不同的下游工序進(jìn)行提取和純化國內(nèi)外該行業(yè)現(xiàn)狀及技

6、術(shù)現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)疫苗是目前人類唯一可以徹底消滅某一疾病的武器。一、全球疫苗產(chǎn)業(yè)主要呈現(xiàn)以下特點(diǎn) 疫苗市場(chǎng)高速發(fā)展，嬰幼兒是疫苗的主要消費(fèi)者 。二、我國疫苗產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀疫苗制品是生物制藥領(lǐng)域的一個(gè)重要組成部分，我國是全球最大的疫苗生產(chǎn)國。接種疫苗是預(yù)防疾病最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段，發(fā)展疫苗產(chǎn)業(yè)是我國醫(yī)療衛(wèi)生以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。完三、中國疫苗行業(yè)面臨良好發(fā)展機(jī)遇政策方面，國家高度重視疾病預(yù)防體系建設(shè)，并出臺(tái)一系列政策扶持疫苗產(chǎn)業(yè)；市場(chǎng)方面，2005年6月1日開始實(shí)施的疫苗流通和預(yù)防接種管理?xiàng)l例對(duì)疫苗市場(chǎng)發(fā)展具有里程碑意義。從行業(yè)景氣度角分析，疫苗產(chǎn)業(yè)是醫(yī)藥行業(yè)中難得的未來景氣度可持續(xù)看漲的“亮點(diǎn)

7、”行業(yè)：引出實(shí)習(xí)崗位與本次實(shí) 習(xí)的目的與意義 實(shí)習(xí)崗位：出血熱，乙腦疫苗生產(chǎn)實(shí)習(xí)的目的與意義：了解并掌握地鼠取腎、組織消化，地鼠腎組織細(xì)胞分散，地鼠腎細(xì)胞沖洗感染，地鼠腎細(xì)胞種毒后換液的各個(gè)操作步驟。鍛煉實(shí)際操作能力乙腦疫苗生產(chǎn) 開題報(bào)告 生物技術(shù)及應(yīng)用 蔡春劍一， 乙腦簡介和注意事項(xiàng)疫苗是目前人類唯一可以徹底消滅某一疾病的武器。近年來SARS、禽流感的爆發(fā)，生化恐怖襲擊的威脅、愛滋病傳播，新老疾病的流行，危機(jī)頻發(fā)促進(jìn)了疫苗產(chǎn)業(yè)的研制和發(fā)展，使疫苗行業(yè)再次走到歷史的前臺(tái)。 一、 疾病簡介 流行性乙型腦炎（乙腦)是由乙腦病毒經(jīng)蚊子傳播的急性傳染病,在人畜間流行。常累及患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng),癥狀輕重

8、不一,重型患者病死率很高,幸存者常殘留有明顯的后遺癥。 乙腦疫苗預(yù)防乙腦可收到明顯的效果,1960年我國開始使用地鼠腎細(xì)胞組織培養(yǎng)滅活疫苗,一直沿用至今。80年代后期,我國又研制成功并使用乙腦減毒活疫苗。,90年代末對(duì)乙腦減毒活疫苗的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，并純化了乙腦減毒活疫苗，減少了副反應(yīng)。 二.注意事項(xiàng) 疫苗混濁、變色變黃、安瓿有裂紋、有異物者均不可使用。 為減少注射時(shí)疼痛,在疫苗中加入適量亞硫酸氫鈉,疫苗由橘紅色變?yōu)辄S色,即可注射。 疫苗注射后在現(xiàn)場(chǎng)休息片刻,以防副反應(yīng)發(fā)生。應(yīng)備有1：1000腎上腺素,以供偶發(fā)休克時(shí)急救用。 我國大部分地區(qū)為乙腦流行區(qū),人群隱性感染率很高。10歲以上人群已普

9、遍因隱性感染而獲得免疫力,故無必要再接種疫苗。 接種對(duì)象 乙腦流行區(qū)1周歲以上健康兒童。 使用方法 每安瓿內(nèi)加入疫苗中附帶的稀釋液(滅菌磷酸鹽緩沖生理鹽水)2.5ml時(shí),待完全溶解后使用。 初免兒童于上臂外側(cè)三角肌附著處皮膚用75%乙醇消毒,待干后皮下注射0.5ml。 2歲、7歲加強(qiáng)免疫時(shí)各注射1針0.5ml,以后可不再免疫。 免疫效果 本疫苗經(jīng)1針注射后中和抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)80%以上,次年加強(qiáng)1針,陽轉(zhuǎn)率可達(dá)90%以上。 接種反應(yīng)及禁忌癥 接種反應(yīng) 注射后一般無反應(yīng),少數(shù)人局部紅腫,偶有發(fā)熱和過敏性皮疹。 禁忌癥 發(fā)熱。 急性傳染病。 中耳炎。 心、腎及肝臟等疾病。 活動(dòng)性結(jié)核病。 有過敏史或抽

10、風(fēng)史者。 已知有免疫系統(tǒng)缺陷,近期或正在進(jìn)行免疫抑制治療者。 乙腦活疫苗于8以下貯運(yùn),有效期在8以下保存為1年半;在-20保存為2年。二， 實(shí)習(xí)目標(biāo)了解并掌握地鼠取腎、組織消化，地鼠腎組織細(xì)胞分散，地鼠腎細(xì)胞沖洗感染，地鼠腎細(xì)胞種毒后換液的各個(gè)操作步驟，在上學(xué)期的基礎(chǔ)上有所提高。 學(xué)會(huì)處理各種突發(fā)狀況，鍛煉實(shí)際操作能力，積累工作經(jīng)驗(yàn)，學(xué)會(huì)分析，能及早發(fā)現(xiàn)問題并及時(shí)解決問題。三， 論文所需工作量和時(shí)間安排：2010年2月 地鼠取腎、組織消化2010年3月 地鼠腎組織細(xì)胞分散2010年4月 地鼠腎細(xì)胞沖洗感染2010年5月 地鼠腎細(xì)胞種毒后換液參考資料1 楊立清,張晉,盧立新,李紅,石男;蔗糖梯度

11、離心法純化Vero細(xì)胞乙腦疫苗的純度分析及與層析法的比較J;微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2004年04期 2 馬學(xué)云石增寶中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志2002年 第03期3 李慧梅現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)2000年 第02期4 龐成華石慧穎常振彥陳景才丁志芬中國生物制品學(xué)雜志1993年 第04期5 徐大麟國外醫(yī)學(xué).生物制品分冊(cè)1980年 第03期6 徐程林,王強(qiáng),黃浩,唐巧英;吸附純化乙型腦炎滅活疫苗的研制J;中國生物制品學(xué)雜志;2004年05期7 楊春亭,丁志芬,石慧穎,趙敏;應(yīng)用柱層析法純化Vero細(xì)胞乙型腦炎疫苗J;中國生物制品學(xué)雜志;1997年04期目錄摘要.01 關(guān)鍵詞.01 地鼠取腎、組織消化.02地鼠腎組織細(xì)胞

12、分散.05 地鼠腎細(xì)胞沖洗感染.08地鼠腎細(xì)胞種毒后換液.11 頂崗實(shí)習(xí)技能訓(xùn)練總結(jié).14 參考文獻(xiàn).15 表1B 本崗位主要儀器設(shè)備型號(hào)、特點(diǎn)、用途.16表1C 異?，F(xiàn)象及處理方法.17 致謝.18摘 要通過對(duì)地鼠取腎、組織消化，地鼠腎組織細(xì)胞分散，地鼠腎細(xì)胞沖洗感染，地鼠腎細(xì)胞種毒后換液的研究和討論，使大家對(duì)乙腦生產(chǎn)有大致的了解，以及了解相關(guān)操作中的著重點(diǎn)和注意事項(xiàng)。規(guī)范的操作和細(xì)心都是不可缺少的。 本論文通過查閱資料，做筆記，指導(dǎo)老師指導(dǎo)，自己在工作崗位上身體力行完成，在實(shí)習(xí)中學(xué)習(xí)了技能，鍛煉了操作能力，學(xué)會(huì)了處理異常情況的方法。關(guān)鍵字：消化，分散，沖洗，種毒表1A 本崗位階段性技能訓(xùn)練

13、實(shí)施一覽表崗位名稱：地鼠取腎、組織消化頂崗實(shí)習(xí)時(shí)間安排： 2010年 2月1日2010年2月29日 一、具體要求： 本規(guī)程描述了地鼠取腎、組織消化的操作方法步驟，指導(dǎo)并規(guī)范操作人員操作。 二、操作過程： 1. 操作前確認(rèn)1.1. 操作場(chǎng)所無前次作業(yè)的遺留物，溫、濕度及壓差符合要求。1.2. 設(shè)備、器材，物料準(zhǔn)備齊全，外觀及使用期限符合規(guī)定要求。1.3. 虹吸管、13#橡膠塞等均應(yīng)121，30分鐘高壓蒸汽滅菌。1.4. 150ml 燒杯，1000ml三角燒瓶等均應(yīng)180，120分鐘干烤滅菌。1.5. 所有器材和溶液須提前14小時(shí)送入潔凈室。2. 地鼠檢查用于乙型腦炎純化疫苗生產(chǎn)的地鼠要求健康，鼠

14、齡10-14天，體重12-15g，眼睛睜開、超齡、超重或體重過低不宜使用，應(yīng)剔除。3. 地鼠解剖前的處理3.1. 地鼠放置于塑料盆內(nèi)，每盆不超過300只，使用乙醚處死，乙醚用量為150ml/盆，加蓋5分鐘。3.2. 地鼠尸體先用純化水漂洗3次（5分鐘/次），每次水量20000ml，以洗去殘留乙醚及體表臟物；再用純化水洗3次（5分鐘/次），每次水量20000ml，進(jìn)一步去除體表臟物；清洗時(shí)，應(yīng)輕輕順著盆子邊緣攪動(dòng)地鼠，以便清洗徹底。3.3. 用0.25%苯扎溴銨溶液（或用其他經(jīng)驗(yàn)證的消毒液）每次20000ml漂洗消毒 4次，前2次各5分鐘，第3次15分鐘，第4次30分鐘，每隔5分鐘輕輕順著盆子邊

15、緣攪動(dòng)地鼠，以便消毒徹底。3.4. 將消毒完畢的地鼠通過地鼠專用傳遞窗送入萬級(jí)潔凈區(qū)。3.5. 將地鼠排列在解剖板上，背朝上，每塊板定量排放10只，頸部固定整齊，每只地鼠排列之間應(yīng)有間隙，便于解剖。4. 地鼠解剖取腎4.1. 地鼠去皮： 左手拿無鉤鑷子(無菌)夾住地鼠上背頸部，稍向上提，右手持無菌手術(shù)剪刀剪開皮毛，左手順勢(shì)向下撕拉致尾部，暴露出地鼠背部肌肉(暴露地鼠腎區(qū))；4.2. 用眼科鑷子在地鼠脊柱兩側(cè)撕開腎區(qū)肌肉，以暴露出腎臟，然后用眼科鑷子輕輕取出腎臟（嚴(yán)防碰破腸壁或其它臟器）保持腎臟完整無菌，放入無菌的150ml燒杯內(nèi)，每杯（組）140-170對(duì)地鼠腎，每取一板(10對(duì))調(diào)換取腎鑷子

16、一次(2把)，如發(fā)現(xiàn)取腎鑷子被污染應(yīng)立即更換；4.3. 取腎時(shí)發(fā)現(xiàn)地鼠腸子被剪破或腹腔有腹水、滲出糜樣液體、腎臟水腫、變色等時(shí)，應(yīng)棄去腎臟，同時(shí)更換鑷子以防交叉污染；4.4. 取腎完畢后，松開解剖板把鼠尸倒入收集袋中，解剖板用75%酒精棉球擦拭消毒后可重復(fù)使用；解剖完畢，鼠尸集中移交專職人員處理。5. 地鼠腎組織消化5.1. 配液腎清洗液配制：無菌無Ca、Mg離子PBS，添加卡那霉素至終濃度1005g/ml，用7.5%NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7.47.6；配制總量以每個(gè)解剖杯約18002000 ml比例計(jì)算；消化液配制：將10倍MEM用無菌注射用水稀釋至原倍（即10MEM：無菌注射用水=1：9

17、），添加卡那霉素至終濃度1005g/ml、胰酶終濃度至0.075%，用7.5%NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7.47.6；配制總量以每個(gè)解剖杯約600 ml比例計(jì)算；5.2. 剪腎：用14cm外科手術(shù)剪刀剪碎腎組織塊至2-4mm3大??；5.3. 腎組織塊洗滌：將組織塊移入1000毫升的三角燒瓶內(nèi)(含玻璃珠)，用清洗液清洗，600650ml/次，重復(fù)洗3次；5.4. 每杯加入0.075%胰酶消化液600ml，塞緊橡皮膠塞，扎緊瓶口放2-8冷庫消化1418小時(shí)；5.5. 每一個(gè)消化杯洗滌腎組織塊所使用的器械不能交叉使用，以防交叉污染；5.6. 注意：操作過程中須戴無菌手套并每15分鐘用75%酒精棉花擦拭

18、手部；5.7. 操作過程中及時(shí)填寫生產(chǎn)記錄；6. 清場(chǎng)與清潔6.1. 地鼠解剖完畢，鼠尸移交專職人員進(jìn)行處理；6.2. 解剖器械、14cm外科手術(shù)剪刀、眼科鑷子用純化水洗凈，注射用水沖洗后，37烘干備用；6.3. 玻璃器械集中送洗滌室清洗，清除所有無菌包裝紙，現(xiàn)場(chǎng)不遺留本次操作用具器材及液體等；6.4. 操作臺(tái)面、地面用3%康威達(dá)消毒液或75%酒精（或其他經(jīng)驗(yàn)證的消毒液）擦拭消毒一次，再用注用水擦拭干凈，（參照“臺(tái)面等物體表面清潔規(guī)程SOP.HY.00.06.07”以及“地面清潔規(guī)程SOP.HY.00.06.08”進(jìn)行操作）。 6.5. 清場(chǎng)后由組長檢查，檢查合格后，發(fā)給清場(chǎng)合格證。6.6.

19、操作間用紫外線或臭氧消毒30分鐘。三、自主性學(xué)習(xí)（分析思考）：上圖是我們的更衣室，進(jìn)入生產(chǎn)車間每個(gè)人都必須穿白大卦，戴帽子，換鞋子。因?yàn)檫@能保持車間的環(huán)境。患有傳染病、皮膚病、皮膚有傷口者和對(duì)生物制品質(zhì)量產(chǎn)生潛在的不利影響的人員，不能進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)進(jìn)行操作或進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。潔凈室（區(qū)）空氣的微生物數(shù)和塵粒數(shù)定期監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)結(jié)果記錄存檔。潔凈室（區(qū)）在靜態(tài)條件下檢測(cè)的塵埃粒子數(shù)、浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)符合規(guī)定，定期監(jiān)控動(dòng)態(tài)條件下的潔凈狀況。四、技能訓(xùn)練體會(huì)：通過這個(gè)月的學(xué)習(xí)和動(dòng)手操作，進(jìn)步熟悉地鼠取腎、組織消化流程,并掌握每個(gè)工序所用物品。批生產(chǎn)記錄要保持整潔、不得撕毀和任意涂改；更改時(shí)，要在更改處簽名，并

20、使原數(shù)據(jù)仍可辨認(rèn)。崗位名稱： 地鼠腎組織細(xì)胞分散頂崗實(shí)習(xí)時(shí)間安排： 2010年3月1日2009年3月31日 一、具體要求： 1. 了地鼠腎組織細(xì)胞分散的操作方法步驟2.操作步驟嚴(yán)格按照SOP 二、操作過程： 細(xì)胞的收集1. 從28冷庫中輕輕取出消化瓶，不宜搖動(dòng)，送入萬級(jí)潔凈操作區(qū)，細(xì)胞懸浮液應(yīng)靜放1015 分鐘讓組織塊細(xì)胞重新沉淀。2. 輕輕在消化瓶口用75%酒精棉球擦拭，通過火焰燒灼后，倒去胰酶消化液，應(yīng)避免組織塊倒出。3. 沿消化瓶邊緣慢慢加入650ml左右胰酶洗滌液，輕輕搖動(dòng)消化瓶，以充分洗滌胰酶，靜置，等組塊沉淀下來后，倒去洗滌液，再加入650lm洗滌液，重復(fù)洗滌2次。4. 消化瓶輕輕

21、旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)30-40次，使玻璃珠與組織塊混合轉(zhuǎn)動(dòng)使組織塊搖散，細(xì)胞脫落（注意不要?jiǎng)×覔u動(dòng)，也不宜來回?cái)[，避免細(xì)胞破損死亡）。5. 取650ml細(xì)胞維持液加入消化瓶中，輕搖使細(xì)胞懸浮于溶液中，細(xì)胞懸浮液經(jīng)沉淀后轉(zhuǎn)入各消化瓶細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)。6. 再次搖動(dòng)消化瓶40-50次后，按5的步驟獲取細(xì)胞懸液至相應(yīng)瓶中。7. 第三次搖動(dòng)消化瓶50次以上，按5的步驟獲取細(xì)胞懸液至相應(yīng)瓶中。8. 第四次搖動(dòng)消化瓶50次以上，按5的步驟獲取細(xì)胞懸液至相應(yīng)瓶中。（注意：搖瓶的力度應(yīng)遵循先輕后重、逐次加重的原則，每一消化瓶內(nèi)的細(xì)胞只允許分散至同一瓶培養(yǎng)液內(nèi)）。9. 對(duì)照細(xì)胞采樣：以無菌操作采取總細(xì)胞量5%或不少于500ml

22、，進(jìn)行細(xì)胞外源因子檢查。 細(xì)胞分裝1. 細(xì)胞懸浮液混勻后，以無菌操作虹吸法分裝于1.5萬毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分裝量為每瓶2000ml左右，使每瓶含細(xì)胞量為20-25對(duì)腎臟的細(xì)胞量。2. 每分裝2瓶搖動(dòng)細(xì)胞懸液一次，防止細(xì)胞下沉分裝不均。3. 每個(gè)消化杯分散的細(xì)胞懸液，應(yīng)按次序編號(hào)。 細(xì)胞培養(yǎng)1. 無菌分裝的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加13#橡膠塞塞緊，瓶口用無菌紙包裝好，防止橡膠塞脫落，立即送3637恒溫室培養(yǎng)。2. 細(xì)胞上轉(zhuǎn)瓶架前應(yīng)用力搖動(dòng)轉(zhuǎn)瓶，使細(xì)胞懸液混勻，并使細(xì)胞分散，貼壁分布均勻。3. 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)瓶機(jī)旋轉(zhuǎn)速度為 4轉(zhuǎn)/小時(shí)，恒溫室溫度為3637，培養(yǎng)3-4天。4. 操作過程中及時(shí)填寫生產(chǎn)記錄。三、自主性學(xué)

23、習(xí)（分析思考）：1上面的是我們溫室里培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞瓶和轉(zhuǎn)瓶架，里面紅色的液體就是地鼠的腎細(xì)胞.在后面的工序中我們會(huì)進(jìn)行中毒把乙腦病毒接種到腎細(xì)胞里。2在搖動(dòng)消化瓶時(shí)都應(yīng)注意每次的搖動(dòng)次數(shù)，不要過多，以免細(xì)胞死亡，也不要過少。在搖的時(shí)候也應(yīng)注意搖動(dòng)的力度，搖瓶的力度應(yīng)遵循先輕后重、逐次加重的原則，每一消化瓶內(nèi)的細(xì)胞只允許分散至同一瓶培養(yǎng)液內(nèi)四、技能訓(xùn)練體會(huì)：通過這個(gè)月的學(xué)習(xí)對(duì)分散有了進(jìn)步了解，并在大多數(shù)步驟中有所收獲，使我的實(shí)踐動(dòng)手能力有了很大的提高。有毒區(qū)和無毒區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開。生產(chǎn)過程中收獲液生產(chǎn)和毒種生產(chǎn)在局部100級(jí)；中間品的離心、除菌過濾、半成品配制和罐裝在局部100級(jí)。潔凈廠房內(nèi)空氣的塵

24、埃粒數(shù)和微生物菌落數(shù)應(yīng)符合現(xiàn)行規(guī)定。崗位名稱：地鼠腎細(xì)胞沖洗感染頂崗實(shí)習(xí)時(shí)間安排： 2010.4.1-2010.4.30 一、具體要求：1.了解地鼠腎細(xì)胞沖洗感染的操作方法步驟 2.操作后能正確清場(chǎng)二、操作過程：1. 操作前確認(rèn)1.1. 操作場(chǎng)所無前次作業(yè)的遺留物，溫、濕度及壓差符合要求。1.2. 設(shè)備、器材、物料準(zhǔn)備齊全，外觀及使用期限符合規(guī)定要求。1.3. 虹吸管、13#橡膠塞均應(yīng)121，30分鐘高壓蒸汽滅菌。1.4. 所有器材和溶液須提前14小時(shí)送入潔凈室。2. 毒種準(zhǔn)備2.1. 乙型腦炎純化疫苗生產(chǎn)毒種SA14-14-2。2.2. 按毒種管理規(guī)定辦理領(lǐng)取手續(xù)后領(lǐng)取。2.3. 毒種置-8

25、0保存，臨用前取出速溶后，送入毒種接種室。3. 細(xì)胞檢查3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)34天后，按總量的10%比例檢查細(xì)胞培養(yǎng)瓶，要求細(xì)胞致密成片（細(xì)胞致密程度95%）即可沖洗種毒。3.2. 檢查細(xì)胞污染情況，發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌、霉菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，應(yīng)立即清理出培養(yǎng)室,用3%康威達(dá)進(jìn)行浸泡消毒或高壓消毒無菌處理后送入洗滌間（或用其他經(jīng)驗(yàn)證的適宜消毒法）。4. 感染液配制10MEM培養(yǎng)基用無菌注射用水10倍稀釋，添加人血白蛋白至0.1%，添加卡那霉素至1005g/ml，添加毒種至2.7-3.7Lg PFU/ml，用7.5%NaHCO3調(diào)節(jié)pH7.47.6。5. 細(xì)胞沖洗換液5.1. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶送入萬級(jí)潔凈室，瓶口

26、用75%酒精棉球擦拭消毒(保證每個(gè)瓶口濕潤)，然后用火焰燒干瓶口。5.2. 無菌操作安裝緩沖鹽沖洗管道各接口，接通下水道，用無菌操作棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)液體，將培養(yǎng)瓶倒置于沖洗架上。5.3. 開啟蠕動(dòng)泵（壓力控制在0.02Mpa左右）將除菌的緩沖鹽液，通過管道使其能均勻地從瓶底向四周瓶壁緩緩流下，水流不宜太急，以免使細(xì)胞脫落。5.4. 沖洗細(xì)胞時(shí)須不時(shí)地轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使緩沖鹽能充分地洗去小牛血清。5.5. 緩沖鹽沖洗量8001000ml/瓶。5.6. 每沖洗一瓶，用記錄筆在該培養(yǎng)瓶上作記號(hào)（沖洗順序號(hào)），以防漏沖。5.7. 沖洗完畢后，每瓶加入1000ml病毒感染液，換上13#無菌橡膠塞，用無菌紙包

27、扎后立即送入3234溫室、轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)/小時(shí)的轉(zhuǎn)瓶機(jī)上繼續(xù)培養(yǎng)。5.8. 操作過程中及時(shí)填寫生產(chǎn)記錄。6. 清場(chǎng)和清潔6.1. 細(xì)胞沖洗后清理萬級(jí)潔凈區(qū)。6.2. 緩沖鹽沖洗管道、虹吸管道用注射用水沖洗2-3min后，放37溫室烘干。6.3. 剩余毒種專人負(fù)責(zé)送消毒室滅活銷毀。6.4. 有毒觸毒物品集中在不銹鋼桶密封,專人送消毒室高壓蒸汽消毒，現(xiàn)場(chǎng)不應(yīng)遺留本次操作的任何物品 。6.5. 萬級(jí)潔凈區(qū)、操作臺(tái)面、地面用3%康威達(dá)消毒液或75%酒精（或其他經(jīng)驗(yàn)證的消毒液）擦拭消毒1次，再用注射用水擦拭干凈 。6.6. 倒沖機(jī)用75%酒精擦拭消毒1次，再用注射用水擦拭干凈。6.7. 清場(chǎng)后由組長檢查，合

28、格后,發(fā)給清場(chǎng)合格證。三、自主性學(xué)習(xí)（分析思考）： 上圖分別是細(xì)胞觀測(cè)臺(tái)和吹淋室，在進(jìn)行每一道工序時(shí)我們都要觀察細(xì)胞瓶里的細(xì)胞，挑選出污染的。在把細(xì)胞瓶，液體瓶等東西拿進(jìn)無菌室時(shí)都要進(jìn)行吹淋。種毒前細(xì)胞生長情況檢查：種毒前檢查細(xì)胞生長情況，應(yīng)有95%的細(xì)胞瓶細(xì)胞連片生長、排列緊密、形態(tài)態(tài)正常，此時(shí)可進(jìn)行種毒。有細(xì)胞間隙10%的細(xì)胞瓶可延期24小時(shí)種毒或再次更換培養(yǎng)液。細(xì)胞間隙75%的細(xì)胞瓶應(yīng)棄去，有間隙的細(xì)胞瓶應(yīng)作好標(biāo)記，沖洗后可按細(xì)胞的覆蓋比例加入維持液。四、技能訓(xùn)練體會(huì)：這段時(shí)間的學(xué)習(xí)使我對(duì)這個(gè)工序有了很好的認(rèn)識(shí)，在有些方面要有所注意：在沖洗過程中要嚴(yán)格把握時(shí)間不應(yīng)操之過急，在細(xì)胞瓶拿上轉(zhuǎn)

29、瓶機(jī)培養(yǎng)時(shí)要平穩(wěn)的上架，以免液體從瓶口接觸瓶塞，細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶機(jī)上后要嚴(yán)格檢查轉(zhuǎn)瓶機(jī)的各個(gè)工作指數(shù)，以免造成細(xì)胞死亡。崗位名稱：地鼠腎細(xì)胞種毒后換液頂崗實(shí)習(xí)時(shí)間安排： 2010.5.1-2010.5.23 一、具體要求：1.了解地鼠腎細(xì)胞種毒后換液的操作方法步驟 2.操作后能正確清場(chǎng)二、操作過程：1. 操作前確認(rèn)1.1. 操作場(chǎng)所無前次作業(yè)的遺留物，溫、濕度及壓差符合要求。1.2. 設(shè)備、器材、物料準(zhǔn)備齊全，外觀及使用期限符合規(guī)定要求。1.3. 虹吸管、13#橡膠塞均應(yīng)121，30分鐘高壓蒸汽滅菌。1.4. 所有器材和溶液須提前14小時(shí)送入潔凈室。2. 細(xì)胞檢查檢查細(xì)胞生長情況，一旦發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌、霉

30、菌污染應(yīng)立即將培養(yǎng)瓶清理出培養(yǎng)室并用3%康威達(dá)進(jìn)行浸泡消毒或高壓滅菌后送入洗滌間（或用其他經(jīng)驗(yàn)證的適宜的消毒法）。3. 維持液的配制10MEM培養(yǎng)基用無菌注射用水10倍稀釋，添加人血白蛋白至0.1%，添加卡那霉素至1005g/ml，用7.5%NaHCO3調(diào)節(jié)pH7.47.6。4. 換液4.1. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶換液前用75%酒精棉球擦拭瓶口一周消毒。4.2. 打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶塞，用火焰燒灼瓶口，倒去原維持液。4.3. 以虹吸方式加入維持液1500-2500ml/瓶，換上新滅菌的13#橡膠塞，并以無菌紙包裹好瓶口，以防瓶塞脫落。4.4. 換液后細(xì)胞培養(yǎng)瓶放3234溫室，轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)/小時(shí)的轉(zhuǎn)瓶機(jī)上繼續(xù)培

31、養(yǎng)4872小時(shí)。4.5. 操作過程中及時(shí)填寫生產(chǎn)記錄。5. 清場(chǎng)與清潔5.1. 清除操作間內(nèi)雜物。5.2. 所用虹吸管按洗滌SOP沖洗干凈放37溫室烘干；有毒觸毒物品集中在不銹鋼桶密封，由專人送至高壓鍋滅菌；地漏沖洗干凈后用3%甲醛溶液液封。5.3. 有毒的病毒感染液送高壓滅菌處理。5.4. 萬級(jí)潔凈區(qū)、地面、操作臺(tái)面，用3%康威達(dá)消毒液或75%酒精（或其他經(jīng)驗(yàn)證的消毒液）擦拭消毒1 次，然后用注射用水擦拭干凈。5.5. 清場(chǎng)后由組長檢查，合格后發(fā)給清場(chǎng)合格證。三、自主性學(xué)習(xí)（分析思考）：在把細(xì)胞瓶拉進(jìn)無菌事時(shí)都要經(jīng)過傳遞窗，進(jìn)行消毒。圖中我們正在進(jìn)行疫苗包裝。換液前細(xì)胞生長情況檢查：換液前檢

32、查細(xì)胞貼壁與生長情況，應(yīng)有75%的貼壁細(xì)胞呈小片適應(yīng)生長，此時(shí)更換培養(yǎng)液，否則延期24小時(shí)換液；細(xì)胞貼壁率25%的瓶棄去。四、技能訓(xùn)練體會(huì)：通過一段時(shí)間的學(xué)習(xí)和了解我對(duì)這個(gè)工序已經(jīng)有了不錯(cuò)的了解，在有些方面要有所注意：細(xì)胞培養(yǎng)瓶換液前用75%酒精棉球擦拭瓶口一周消毒，并且每個(gè)棉球最好擦拭不要超過3瓶。打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶塞，用火焰燒灼瓶口，倒去原維持液。最好在打開瓶塞前瓶口帶塞子一起燒灼下。頂崗實(shí)習(xí)技能訓(xùn)練總結(jié)自我鑒定： 這幾個(gè)月下來我在天元的實(shí)習(xí)將告一段落，在這幾個(gè)月里我從學(xué)校的理論開始向?qū)嵺`發(fā)展。而天元正是我向?qū)嵺`發(fā)展的搖籃，從剛接觸天元對(duì)各個(gè)技能實(shí)踐的一知半解到現(xiàn)在的了如指掌，我有了長足的進(jìn)

33、步。在我工作崗位上的地鼠取腎、組織消化，地鼠腎組織細(xì)胞分散，地鼠腎細(xì)胞沖洗感染，地鼠腎細(xì)胞種毒后換液每一個(gè)步驟我都有了大量實(shí)踐機(jī)會(huì)，這給我的技能鍛煉提供了很好的機(jī)會(huì)，在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下我知識(shí)面和動(dòng)手操作能力都有了很大的提高。 簽名：蔡春劍2010年 5月 23日指導(dǎo)教師評(píng)語：簽名： 年 月 日 參考資料1 楊立清,張晉,盧立新,李紅,石男;蔗糖梯度離心法純化Vero細(xì)胞乙腦疫苗的純度分析及與層析法的比較J;微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2004年04期 2 馬學(xué)云石增寶中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志2002年 第03期3 李慧梅現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)2000年 第02期4 龐成華石慧穎常振彥陳景才丁志芬中國生物制品學(xué)雜志199

34、3年 第04期5 徐大麟國外醫(yī)學(xué).生物制品分冊(cè)1980年 第03期6 徐程林,王強(qiáng),黃浩,唐巧英;吸附純化乙型腦炎滅活疫苗的研制J;中國生物制品學(xué)雜志;2004年05期7 楊春亭,丁志芬,石慧穎,趙敏;應(yīng)用柱層析法純化Vero細(xì)胞乙型腦炎疫苗J;中國生物制品學(xué)雜志;1997年04期表1B 本崗位主要儀器設(shè)備型號(hào)、特點(diǎn)、用途序號(hào)設(shè)備名稱型號(hào)用途1蠕動(dòng)泵S-C-O-2006-031提供動(dòng)力2機(jī)械攪動(dòng)稀配罐S-A-J-2005-024配制溶液3管式濾器無過濾 除菌4超聲波清洗器A-J-383 S-A-J-440清洗5電熱恒溫鼓風(fēng)干烤箱S-G-T-05(06)高溫滅菌6機(jī)動(dòng)門蒸汽高壓鍋S-C-T-03

35、(04)高壓高溫7攪拌器無攪拌8電子分析天平AE-250稱量表1C 異?，F(xiàn)象及處理方法序號(hào)異 常 現(xiàn) 象原 因 分 析處 理 方 法1細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁細(xì)胞污染加消毒液廢棄2溶液顏色不符稀配罐清洗不徹底原料錯(cuò)誤廢棄3溶液PH偏高 偏低稀配罐清洗不徹底原料錯(cuò)誤廢棄4過濾管道爆裂壓力過大，停止過濾，換完好濾器5細(xì)胞生長未貼瓶壁轉(zhuǎn)瓶機(jī)指數(shù)沒調(diào)好 或轉(zhuǎn)瓶機(jī)壞了檢查轉(zhuǎn)瓶機(jī)6細(xì)胞死亡配培養(yǎng)液沒有按比例嚴(yán)格要比例配致 謝 經(jīng)過這些月的努力，本學(xué)期的實(shí)習(xí)接近尾聲。此次實(shí)習(xí)圓滿而充實(shí)，對(duì)于我的論文有很多不足，沒有2個(gè)指導(dǎo)老師的指導(dǎo)，同學(xué)們的支持，同事的幫助，我很難完成。在此我首先要感謝校內(nèi)指導(dǎo)老師蔣志城老師，沒有

36、他每個(gè)月的督促和悉心教導(dǎo)很難想象我的論文現(xiàn)在寫成什么樣。還有就是我的單位指導(dǎo)老師孫海龍老師，我第一次進(jìn)單位是你一點(diǎn)點(diǎn)的教起我每個(gè)操作，每個(gè)細(xì)節(jié)，你對(duì)我的關(guān)心，對(duì)我的耐心使我在天元的這幾個(gè)月內(nèi)受益非淺。在此衷心的感謝兩位老師的幫助。還有就是浙江天元生物股份有限公司給我這個(gè)實(shí)習(xí)機(jī)會(huì)，給我提供了這么好的實(shí)習(xí)條件。最后還要感謝各位同學(xué)和同事，因?yàn)橛心銈兾也拍荛_開心心實(shí)習(xí)到現(xiàn)在，你們是我的精神動(dòng)力，在次衷心的感謝你們的幫助，祝你們幸?？鞓罚〔檀簞?010.5.23杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（學(xué)生自查用表）實(shí)習(xí)崗位出血熱學(xué)生姓名蔡春劍考核時(shí)間2.29階段技能名稱：地鼠取腎、組織消化實(shí)習(xí)訓(xùn)練

37、時(shí)間： 2010年2月1日2010年2月29日技能具體要求：本規(guī)程描述了地鼠取腎、組織消化的操作方法步驟，指導(dǎo)并規(guī)范操作人員操作。操作技能掌握情況學(xué)生自我評(píng)價(jià)（主要實(shí)習(xí)訓(xùn)練內(nèi)容、掌握程度、收獲和體會(huì)）： 通過1個(gè)月的學(xué)習(xí)和動(dòng)手操作，已熟悉地鼠取腎、組織消化流程,并掌握每個(gè)工序所用物品。備注：杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（ 企業(yè)指導(dǎo)教師用表）實(shí)習(xí)崗位出血熱實(shí)習(xí)單位浙江天元生物股份有限公司考核時(shí)間2.29學(xué)生姓名蔡春劍專業(yè)/班級(jí)生物0712指導(dǎo)教師孫海龍本階段實(shí)習(xí)時(shí)間2010年2月1日2010年2月29日技能分解考核情況獨(dú)立操作能力熟練程度規(guī)范程度其他：難度系數(shù)單項(xiàng)總評(píng)分5分制5分制

38、5分制5分制5分制5級(jí)制地鼠取腎、組織消化 本階段總評(píng)分 優(yōu)良中及格不及格 總體評(píng)價(jià) 指導(dǎo)教師簽名： 年 月 日杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（ 學(xué)校指導(dǎo)教師用表）實(shí)習(xí)單位天元生物股份有限公司實(shí)習(xí)崗位出血熱學(xué)生姓名蔡春劍實(shí)習(xí)時(shí)間2010年2月1日2010年2月29日教師評(píng)價(jià)已完成階段評(píng)價(jià)下一階段任務(wù)布置教師（簽名）： 年 月 日杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（學(xué)生自查用表）實(shí)習(xí)崗位出血熱學(xué)生姓名蔡春劍考核時(shí)間3.31階段技能名稱：地鼠腎組織細(xì)胞分散實(shí)習(xí)訓(xùn)練時(shí)間： 2010年3月1日2010年3月31日技能具體要求：1.了地鼠腎組織細(xì)胞分散的操作方法步驟2.操作步驟嚴(yán)格按

39、照SOP操作技能掌握情況學(xué)生自我評(píng)價(jià)（主要實(shí)習(xí)訓(xùn)練內(nèi)容、掌握程度、收獲和體會(huì)）： 通過這個(gè)月的學(xué)習(xí)對(duì)分散有了大致的了解，并在大多數(shù)步驟中有所操作，使我的實(shí)踐動(dòng)手能力有了很大的提高備注：杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（ 企業(yè)指導(dǎo)教師用表）實(shí)習(xí)崗位出血熱實(shí)習(xí)單位浙江天元生物股份有限公司考核時(shí)間3.31學(xué)生姓名蔡春劍專業(yè)/班級(jí)生物0712指導(dǎo)教師孫海龍本階段實(shí)習(xí)時(shí)間2010年3月1日2010年3月31日技能分解考核情況獨(dú)立操作能力熟練程度規(guī)范程度其他：難度系數(shù)單項(xiàng)總評(píng)分5分制5分制5分制5分制5分制5級(jí)制地鼠腎組織細(xì)胞分散 本階段總評(píng)分 優(yōu)良中及格不及格 總體評(píng)價(jià) 指導(dǎo)教師簽名： 年 月

40、 日杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（ 學(xué)校指導(dǎo)教師用表）實(shí)習(xí)單位天元生物股份有限公司實(shí)習(xí)崗位出血熱學(xué)生姓名蔡春劍實(shí)習(xí)時(shí)間2010年3月1日2010年3月31日教師評(píng)價(jià)已完成階段評(píng)價(jià)下一階段任務(wù)布置教師（簽名）： 年 月 日杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)生頂崗實(shí)習(xí)階段考核記錄表（學(xué)生自查用表）實(shí)習(xí)崗位出血熱學(xué)生姓名蔡春劍考核時(shí)間4.30階段技能名稱：地鼠取腎、組織消化實(shí)習(xí)訓(xùn)練時(shí)間： 2010年4月1日2010年4月30日技能具體要求：1.了解地鼠腎細(xì)胞沖洗感染的操作方法步驟 2.操作后能正確清場(chǎng)操作技能掌握情況學(xué)生自我評(píng)價(jià)（主要實(shí)習(xí)訓(xùn)練內(nèi)容、掌握程度、收獲和體會(huì)）： 這段時(shí)間的學(xué)習(xí)使我對(duì)這個(gè)工序有了很好的認(rèn)識(shí)，在有些方面要有所注意：在沖洗過程中要嚴(yán)格把握時(shí)間不應(yīng)操之過急，在細(xì)胞瓶拿上轉(zhuǎn)瓶機(jī)培養(yǎng)時(shí)要平穩(wěn)的上架，以免液體從瓶口接觸瓶塞，細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶機(jī)上后要嚴(yán)格檢查轉(zhuǎn)瓶機(jī)的各個(gè)工作指數(shù)，以免