引物設(shè)計(jì)(丁香園)

1、引物設(shè)計(jì)有3條根本原那么：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間防止形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反響(即錯配)。 具體實(shí)現(xiàn)這3條根本原那么需要考慮到諸多因素，如引物長度primer length，產(chǎn)物長度 product length，序列Tm值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用G值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)duplex formation and hairpin的能值，在錯配位點(diǎn)false primi

2、ng site的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量composition，等等。必要時還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)： 1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反響。 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3¡¯端相似性較高的序列，否那么容易導(dǎo)致錯配。引物3¡¯端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。 

3、3. 引物3¡¯端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)防止在引物的3¡¯端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反響失敗。5¡¯端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最正確。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式

4、Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method) 。 6. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)中選用3¡¯端G值較低絕對值不超過9，而5¡¯端和中間G值相對較高的引物。引物的3¡¯端的G值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反響。 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高超過4.5kcal/mol易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反響不能正常進(jìn)行。 8. 對引

5、物的修飾一般是在5¡¯端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分適宜的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。(轉(zhuǎn)載)現(xiàn)在針對PCR引物設(shè)計(jì)的引物有好幾種:Oligo 6.22 Primer 5.0 等 ,如果你對引物沒有特殊要求也可以利用generunner進(jìn)行設(shè)計(jì)引物,近來我一直都在用其設(shè)計(jì)引物效果也是不錯的.具體方法可以參照各自使用說

6、明書.一般是通過設(shè)計(jì)軟件，例如oligo6，primer5等，你可以在網(wǎng)上搜一下引物設(shè)計(jì)軟件下載和使用說明，是比較容易的。至于設(shè)計(jì)引物的一般原那么如下：* 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段* 防止引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，防止引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu) * 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。* Tm值在5565因?yàn)?0核酸外切酶活性最高，GC含量在40%60%* 引物之間的TM相

7、差防止超過2* 引物的3端防止使用堿基A，引物的3端防止出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基* 為防止的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個外顯子。* Taqman探針PCR要求片段長度在80bp150bp * 引物末端最后5個核苷酸不能有超過2個的G和C。怎么設(shè)計(jì)引物來源： 張小偉的日志1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件比方DNAman比對Alignment，各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長度一般在1530堿基之間。引物長度primerlength常用的是18-27bp，

8、但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反響。3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。GC含量composition過高或過低都不利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值meltingtemperature是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510。假設(shè)按公式Tm=4G+C+2A+T估計(jì)引物的Tm值，那么有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最正確。4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的

9、第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。6.堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否那么容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)Falsepriming。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯

10、誤引發(fā)。7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否那么引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Hairpin使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)防止3端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體Dimer與Crossdimer的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可防止的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高應(yīng)小于4.5kcal/mol。否那么易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反響不能正常進(jìn)行。8.引物5端和中間G值應(yīng)該相對較高，而3端G值較低。G值是指DNA雙鏈

11、形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，那么雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)中選用5端和中間G值相對較高，而3端G值較低絕對值不超過9的引物。引物3端的G值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反響。不同位置的G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不

12、能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。10.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件比方RNAstructure可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)說明，待擴(kuò)區(qū)域自由能G°小于58.6lkJ/mol時，擴(kuò)增往往不能成功。假設(shè)不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。11.引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件

13、比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分適宜的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。做RealTime時,用于SYBRGreenI法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求：1)防止重復(fù)堿基，尤其是G.2)Tm=58-60度。3GC=30-80%.4)3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150bp最為適宜可以延長至300bp。7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特別注意防止引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到適