G試驗(yàn)-侵襲性真菌病的輔助診斷方法

1、1唐麗娟容目錄 一、真菌感染概一、真菌感染概 湛江安度斯生物有限公司是查爾斯河公司設(shè)在中國(guó)的子公司，是中國(guó)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑的最大供應(yīng)商，也是中國(guó)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域的技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者和創(chuàng)新先鋒； 世界著名的美洲鱟試劑（LAL）生產(chǎn)企業(yè)美國(guó)CR恩度斯弗公司（Charles River Endosafe, Inc.），也是查爾斯河實(shí)驗(yàn)室公司的子公司湛江安度斯的簡(jiǎn)介Charles River Laboratories 作為全球最大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，Charles River Laboratories一直是全球?qū)嶒?yàn)動(dòng)物商業(yè)化繁育和市場(chǎng)供應(yīng)的領(lǐng)導(dǎo)者，擁有分布在北美、歐洲和日本的15個(gè)分

2、設(shè)施和遍布全球的銷售網(wǎng)絡(luò)；已成為一個(gè)生物醫(yī)學(xué)前臨床產(chǎn)品和服務(wù)的主要供應(yīng)商。庫(kù)珀博士 C R Endosafe（恩度斯弗） 公司是美國(guó)著名三大鱟試劑企業(yè)之一,有國(guó)際知名權(quán)威學(xué)者詹母斯 弗.庫(kù)珀博士(Dr. Jammes F.Cooper)創(chuàng)建。庫(kù)珀博士是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查研究領(lǐng)域的先驅(qū)。1971年他與Lein 及 Banger等人提出以鱟實(shí)驗(yàn)法檢查熱源，并率先證明了鱟實(shí)驗(yàn)法作為注射藥品熱源檢查的敏感方法的價(jià)值。1972年他協(xié)助美國(guó)(The parentral Drug Association) 的鱟試劑.他一直主持著美國(guó)非經(jīng)腸道藥物協(xié)會(huì)(The parenteral Drug Associatoin

3、)的鱟實(shí)驗(yàn)應(yīng)用促進(jìn)工作,以及每年一屆的美國(guó)南卡羅納州查爾頓的鱟實(shí)驗(yàn)學(xué)術(shù)會(huì)議。 庫(kù)珀博士創(chuàng)建的 Endosafe 公司現(xiàn)以成為美國(guó)鱟試劑(LAL)市場(chǎng)最大的供應(yīng)商.該公司的鱟試劑以其良好的穩(wěn)定性,廣泛的適用性以及優(yōu)越的抗干擾性能享譽(yù)國(guó)際醫(yī)藥工業(yè)界.一、真菌感染概述一、真菌感染概述真菌感染 ：真菌感染在通常情況下我們最常見(jiàn)的是表皮的感染，例如頭癬、體癬、甲癬等，由于侵犯的部位大都表淺，不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重問(wèn)題，因而叫淺部真菌感染；深部真菌感染則是真菌突破人體天然屏障導(dǎo)致組織臟器的感染。7美國(guó)死于感染性疾病的十大原因美國(guó)死于感染性疾病的十大原因820820圍產(chǎn)期圍產(chǎn)期828828真菌真菌1010105310

4、53胃腸道胃腸道13051305圍產(chǎn)期圍產(chǎn)期9 912591259結(jié)核結(jié)核12771277肝膽管肝膽管8 823702370真菌真菌13771377胃腸道胃腸道7 745964596肝膽管肝膽管14021402細(xì)菌性腦膜炎細(xì)菌性腦膜炎6 655775577心臟心臟23332333肺結(jié)核肺結(jié)核5 513, 41313, 413腎臟腎臟/ /泌尿道泌尿道24862486心臟心臟4 416, 52416, 524HIV/AIDSHIV/AIDS80068006腎臟腎臟/ /泌尿道泌尿道3 322, 39622, 396敗血癥敗血癥94389438敗血癥敗血癥2 287,18187,181呼吸道呼吸道

5、56, 96656, 966呼吸道呼吸道1 1死亡人數(shù)死亡人數(shù)感染類型感染類型死亡人數(shù)死亡人數(shù)感染類型感染類型1997199719801980真菌感染的死亡率上升了真菌感染的死亡率上升了3.43.4倍倍 （死亡率：（死亡率：0.72.4 /100,0000.72.4 /100,000）8 EORTC/MSG原稱侵襲性真菌感染（IFI），修訂后改稱IFD； 是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長(zhǎng)、繁殖，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷的疾病。 是真菌感染致死的重要原因侵襲性真菌病侵襲性真菌病(Invasive Fungal (Invasive Fungal Disease ,IFD)Disease

6、,IFD)9侵襲性真菌病已變得越來(lái)越常見(jiàn)侵襲性真菌病已變得越來(lái)越常見(jiàn)10侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)G試驗(yàn)可作為擬診病例的微生物學(xué)標(biāo)志11主要可引發(fā)侵襲性真菌病的疾病主要可引發(fā)侵襲性真菌病的疾病腫瘤類：腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤血病，惡性淋巴瘤12二、真菌與葡聚糖2022-3-24131. 某些真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)2. 細(xì)胞壁含有葡聚糖組分的真菌：（1）是導(dǎo)致侵襲性真菌病(IFD)的常見(jiàn)真菌。（2）細(xì)胞壁有葡聚糖組分2022-3-2414這類真菌有：念珠菌曲霉菌耶氏肺孢菌鐮刀酶隱球菌 接合

7、菌 .2022-3-2415隱球菌病、接合菌病占真菌病比例不高16 當(dāng)人體深部受這類真菌感染時(shí)，真菌在代謝過(guò)程會(huì)不斷釋放出葡聚糖。檢查患者的血液（血漿或血清），會(huì)發(fā)現(xiàn)葡聚糖含量明顯高于非感染者。因此，葡聚糖可作為具有這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真菌感染標(biāo)識(shí)物。2022-3-2417三、鱟試驗(yàn)與G試驗(yàn)1. 鱟（Hu，后）試驗(yàn)2022-3-2418 鱟是地球上最古老的海洋生物之一，已有三億多年的歷史，人們稱它為“活化石”。雌雄2022-3-2419 研究發(fā)現(xiàn)，鱟的循環(huán)細(xì)胞（阿米巴細(xì)胞）中含有一種特殊的凝固酶原。這種凝固酶原可以被自然界廣泛存在的兩種物質(zhì)激活為凝固酶，從而導(dǎo)致一系列的生化反應(yīng)。這兩種物質(zhì)就是脂多糖

8、(Lipopolysaccharide, LPS)和(1-3)-D葡聚糖。2022-3-2420 人們利用鱟的阿米巴細(xì)胞溶胞物制人們利用鱟的阿米巴細(xì)胞溶胞物制備成了鱟試劑（備成了鱟試劑（LALLAL或或TALTAL）。通常稱）。通常稱使用鱟試劑檢測(cè)脂多糖（使用鱟試劑檢測(cè)脂多糖（LPSLPS）或）或 - -葡葡聚糖（聚糖（ -G-G）的試驗(yàn)為鱟試驗(yàn)（）的試驗(yàn)為鱟試驗(yàn)（LAL LAL Test or TALTest or TAL TestTest）。）。2022-3-24212. 2. 鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理223. 鱟試驗(yàn)的應(yīng)用應(yīng)用I：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(Bacterial Endotoxin

9、 Test, BET)2022-3-2423 研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁都含有一種叫內(nèi)毒素(Endotoxin)的組分。2022-3-2424 內(nèi)毒素是能夠引起哺乳動(dòng)物原反應(yīng)的主要熱原物質(zhì)。 革蘭氏陰性細(xì)菌在新陳代謝過(guò)程不斷地向環(huán)境釋放內(nèi)毒素，污染藥品和醫(yī)療器械。因此注射藥品和醫(yī)療器械都要求必須作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）。2022-3-2425應(yīng)用應(yīng)用IIII：革蘭氏陰性菌脂多糖檢測(cè)革蘭氏陰性菌脂多糖檢測(cè)2022-3-2426 細(xì)菌內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖。當(dāng)人體深部感染革蘭氏陰性菌時(shí)，細(xì)菌會(huì)在體內(nèi)不斷釋放內(nèi)毒素（脂多糖）。檢查患者的血液（血漿）、腹水、尿液及腦脊液，會(huì)發(fā)現(xiàn)脂多糖明顯高于

10、非感染者。 脂多糖檢測(cè)對(duì)敗血癥、嚴(yán)重器官衰竭的快速輔助診斷有臨床價(jià)值。2022-3-2427應(yīng)用應(yīng)用IIIIII：真菌真菌(1-3)-(1-3)- -D-D葡聚糖葡聚糖檢測(cè)檢測(cè)2022-3-2428 醫(yī)學(xué)上通常把用于檢測(cè)真菌葡聚糖的鱟試驗(yàn)稱為G試驗(yàn)。這是取葡聚糖的英文名稱Glucan的首字母來(lái)命名該試驗(yàn)。2022-3-2429 需要指出的是，隱球菌的細(xì)胞壁雖然有葡聚糖組分，在隱球菌感染患者的血液中卻檢測(cè)不出葡聚糖異常。這可能與隱球菌具有特殊的細(xì)胞被膜有關(guān)。因此G試驗(yàn)不適合對(duì)隱球菌感染的檢測(cè)。2022-3-2430四、四、G G試驗(yàn)試驗(yàn)臨床意義臨床意義31G G試驗(yàn)的臨床意義試驗(yàn)的臨床意義32G

11、 G試驗(yàn)的臨床意義試驗(yàn)的臨床意義333435G G試驗(yàn)應(yīng)用科室試驗(yàn)應(yīng)用科室36373839404142434445464748495051侵襲性真菌感染的臨床檢測(cè)方法對(duì)比侵襲性真菌感染的臨床檢測(cè)方法對(duì)比52產(chǎn)品特點(diǎn)產(chǎn)品特點(diǎn)53七、七、“生物探針生物探針”的臨床比對(duì)的臨床比對(duì)J廠家的-G試劑、LPS試劑均無(wú)特異性54最低檢測(cè)限最低濃度重復(fù)性廠商安度斯最低檢測(cè)限10pg/ml編號(hào)檢測(cè)結(jié)果(pg/ml)陰性(pg/ml) 檢測(cè)日期110.3 1.3 3.6210.1 311.049.859.8610.8710.1810.099.61010.3 CV=6.85%1110.0129.81310.7149

12、.81512.41610.3179.7189.6199.4209.9219.6批內(nèi)精密度批間精密度“生物探針生物探針”的臨床比對(duì)的臨床比對(duì)58八、八、G G試驗(yàn)的影響因素試驗(yàn)的影響因素2022-3-24591. 檢測(cè)試劑的靈敏度1.1 葡聚糖的量值與標(biāo)準(zhǔn)品2022-3-24602022-3-2461 目前G試驗(yàn)中葡聚糖采用的單位為重量單位“pg”。pg是一個(gè)非常非常微量的單位。因此G試驗(yàn)是一項(xiàng)非常靈敏的生物檢測(cè)。當(dāng)然，越是靈敏精確的檢測(cè)，越容易受到干擾。 目前葡聚糖沒(méi)有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)！ 沒(méi)有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，也沒(méi)有公認(rèn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，只有企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)控品）2022-3-2462 各

13、企業(yè)的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源不一。有的來(lái)自茯苓多糖，有的來(lái)自香菇多糖，有的來(lái)自海藻多糖。不同來(lái)源的葡聚糖對(duì)鱟試劑的活性不同。 各企業(yè)的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)不一。你的1pg可能相當(dāng)我的10pg。相互之間無(wú)可比性。2022-3-2463 無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)致不同廠家試劑盒有不同的參考值。有的是10pg為陽(yáng)性，有的是100pg為陽(yáng)性。 對(duì)參考值的表示各廠家也有所不同。有的以全血含量來(lái)表示，有的以檢測(cè)濃度來(lái)表示。2022-3-24641.2 試驗(yàn)器具對(duì)G試驗(yàn)有重要的影響！ 葡聚糖是自然界廣泛存在的一種物質(zhì)，極容易污染到試驗(yàn)器具。 葡聚糖是一種非常穩(wěn)定的物質(zhì)，通常的蒸煮高壓、輻照等滅菌手段不能徹底破壞葡聚糖。很難

14、找到真正意義的無(wú)葡聚糖的器具。2022-3-2465 G試驗(yàn)使用到的實(shí)驗(yàn)器具： 采血針 采血管（瓶） 反應(yīng)試管 移液器具（吸頭）最主要的污染來(lái)自采血管！2022-3-2466重要建議 最好使用廠家供應(yīng)的專用采血管（瓶） 其次是用經(jīng)廠家檢測(cè)合格的采血管 不能使用未經(jīng)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)器具2022-3-2467 尊重科學(xué)，為患者負(fù)責(zé)！ 無(wú)效試驗(yàn)是對(duì)患者最大的危害！2022-3-24682.試劑的生物特異性 如前所述，G試驗(yàn)的檢測(cè)試驗(yàn)就是鱟試劑。鱟試劑可以對(duì)兩種物質(zhì)反應(yīng)，用于不同的用途。如下圖表示。 檢測(cè)內(nèi)毒素/脂多糖 用于革蘭氏陰性菌檢測(cè)鱟試劑 檢測(cè)葡聚糖（G試驗(yàn)） 用于真菌檢測(cè) 2022-3-2469

15、在檢測(cè)試劑制備上，應(yīng)根據(jù)試劑的用途制備生物特異性強(qiáng)的檢測(cè)試劑，如： 用于檢測(cè)細(xì)菌脂多糖的試劑，不能對(duì)葡聚糖產(chǎn)生反應(yīng)。 用于檢測(cè)真菌葡聚糖的試劑，不能對(duì)脂多糖產(chǎn)生反應(yīng)。2022-3-2470 遺憾的是，由于技術(shù)的原因，并不是所有遺憾的是，由于技術(shù)的原因，并不是所有廠家的試劑都具有生物特異性。廠家的試劑都具有生物特異性。 有的試劑盒對(duì)LPS和-G都反應(yīng)。 有的試劑盒對(duì)非檢測(cè)對(duì)象低濃度時(shí)可能不反應(yīng)，較高濃度時(shí)會(huì)反應(yīng)。 無(wú)生物特異性的試劑盒不能區(qū)分細(xì)菌無(wú)生物特異性的試劑盒不能區(qū)分細(xì)菌感染和真菌感染，不具有臨床檢測(cè)價(jià)值！感染和真菌感染，不具有臨床檢測(cè)價(jià)值！2022-3-24712022-3-2472 鑒別試劑盒是否具有生物特鑒別試劑盒是否具有生物特異性的方法：異性的方法： 用該試劑盒與用該試劑盒與LPS/LPS/ -G-G的的標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)控品）反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)控品）反應(yīng)。3. 某些藥物對(duì)G試驗(yàn)的影響3.1 臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，注射過(guò)香菇多糖注射液的供試者作G試驗(yàn)，其血液中葡聚糖含量會(huì)顯著增高。因此需要作G試驗(yàn)的供試者應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)避免使用香菇多糖注射液。2022-3-24733.2 臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，使用過(guò)脂肪乳的供試者作G試驗(yàn)（包括作LPS檢測(cè)），反應(yīng)曲線形態(tài)會(huì)發(fā)生異常，致使檢測(cè)值非常高。因此需要作G試驗(yàn)的供試者應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)避免使用脂肪