蛋白質(zhì)測(cè)定-凱氏定氮法

1、【基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)】蛋白質(zhì)概述蛋白質(zhì)概述蛋白質(zhì)是食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，含蛋白質(zhì)是食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，含N是蛋白質(zhì)區(qū)是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近，一般來(lái)說(shuō)，接近，一般來(lái)說(shuō)，pro的平均含氮量為的平均含氮量為16%，即一份，即一份氮相當(dāng)于氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。注意：注意：不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為青豆、雞蛋等為6.25，花生為，花生為5.46，大米為，大米為5.95，大，大豆

2、及其制品為豆及其制品為5.71，小麥粉為，小麥粉為5.70、全小麥、大麥、全小麥、大麥、燕麥、裸麥和小米是燕麥、裸麥和小米是5.83；硬果類為；硬果類為5.30；牛乳及其牛乳及其制品為制品為6.38。【一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1、掌握凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。、掌握凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。 2、學(xué)會(huì)使用凱氏定氮裝置。、學(xué)會(huì)使用凱氏定氮裝置。 3、了解蛋白質(zhì)系數(shù)在蛋白質(zhì)含量計(jì)算中的應(yīng)用。、了解蛋白質(zhì)系數(shù)在蛋白質(zhì)含量計(jì)算中的應(yīng)用。蛋白質(zhì)是食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。測(cè)量食品中蛋蛋白質(zhì)是食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。測(cè)量食品中蛋白質(zhì)的含量對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利白質(zhì)的含

3、量對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化食品配方、提高產(chǎn)品用食品資源、指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化食品配方、提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。質(zhì)量具有重要的意義。注意注意：此法測(cè)定得到的蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生此法測(cè)定得到的蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為故稱為粗粗pro?！径⒃矶?、原理】1、消化、消化儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：儀器：【三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟】試劑試劑作用作用硫酸銅硫酸銅a催化作用催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。：加速有機(jī)物的氧化分解。b消化完全的指

4、示劑消化完全的指示劑：藍(lán)綠色，澄清，透明；：藍(lán)綠色，澄清，透明；c蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀硫酸鉀硫酸鉀提高溶液沸點(diǎn)提高溶液沸點(diǎn)，從而加快有機(jī)物分解，從而加快有機(jī)物分解 濃硫酸濃硫酸氧化作用氧化作用：有機(jī)物質(zhì)氧化分解為：有機(jī)物質(zhì)氧化分解為H2O和和CO2樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理固體試樣固體試樣 0.22g半固體試樣半固體試樣 25g液體試樣液體試樣 1025g樣品充分混勻樣品充分混勻直接消化直接消化樣品稱量、消化樣品稱量、消化1.000g1.000g奶粉奶粉0.2g0.2g硫酸銅硫酸銅6g6g硫酸鉀硫酸鉀20mL20mL濃硫酸濃硫酸

5、玻璃珠玻璃珠小火加熱炭化小火加熱炭化至泡沫完全停止至泡沫完全停止輕搖輕搖 大火加熱大火加熱保持瓶中液體微沸保持瓶中液體微沸至藍(lán)綠色澄清透明至藍(lán)綠色澄清透明繼續(xù)加熱繼續(xù)加熱0.51h冷卻冷卻加加20mL水水冷卻冷卻同時(shí)做試劑同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)空白試驗(yàn)2、蒸餾、吸收、蒸餾、吸收儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：儀器：100mL 3只只 試劑（混合指示劑）：試劑（混合指示劑）： 2 2份份甲基紅乙醇甲基紅乙醇液（液（1g/L1g/L）與）與1 1份份亞甲基藍(lán)乙醇亞甲基藍(lán)乙醇液（液（1g/L1g/L）臨用時(shí)混合。指示劑在堿性溶液中呈臨用時(shí)混合。指示劑在堿性溶液中呈綠色綠色, ,在中性溶液中呈在中性

6、溶液中呈灰色灰色, ,在酸性溶液中呈在酸性溶液中呈紅色紅色。凱氏定氮蒸餾裝置凱氏定氮蒸餾裝置傳統(tǒng)裝置傳統(tǒng)裝置1：電爐：電爐2：水蒸氣發(fā)生器：水蒸氣發(fā)生器3：螺旋夾：螺旋夾4：小玻杯及棒狀玻塞：小玻杯及棒狀玻塞5：反應(yīng)室：反應(yīng)室6：反應(yīng)室外層：反應(yīng)室外層7：橡皮管及螺旋夾：橡皮管及螺旋夾8：冷凝管：冷凝管9：蒸餾液接收瓶：蒸餾液接收瓶水蒸氣發(fā)生器：水蒸氣發(fā)生器：裝水至裝水至2/32/3處，加入數(shù)粒處，加入數(shù)粒玻璃珠玻璃珠，加，加甲基紅乙醇甲基紅乙醇指示劑指示劑數(shù)滴及數(shù)滴及硫酸硫酸數(shù)數(shù)mlml，使水呈微紅色（保持酸性，使水呈微紅色（保持酸性以防水中氨的逸出）以防水中氨的逸出）按上圖所示搭好裝置按上

7、圖所示搭好裝置蒸餾及吸收蒸餾及吸收n10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液100mL100mL三角瓶三角瓶加加1 12 2滴混合指示劑滴混合指示劑 冷凝管下端插入三角瓶液面下冷凝管下端插入三角瓶液面下準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取10mL10mL試樣試樣由由小玻杯流入反應(yīng)室小玻杯流入反應(yīng)室少量水洗滌小漏斗少量水洗滌小漏斗蓋緊玻璃塞蓋緊玻璃塞 量筒取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液倒入小玻杯倒入小玻杯提起玻塞使其緩提起玻塞使其緩慢流入反應(yīng)室慢流入反應(yīng)室立即塞緊玻璃塞立即塞緊玻璃塞加水于小玻杯防漏氣加水于小玻杯防漏氣 通蒸汽通蒸汽顏色變化時(shí)開始計(jì)時(shí)蒸餾顏色變化時(shí)開始計(jì)時(shí)蒸餾5min 5m

8、in 移動(dòng)接受瓶使移動(dòng)接受瓶使液面離開冷凝管下端液面離開冷凝管下端再蒸餾再蒸餾1min1min 用少量水沖洗冷凝用少量水沖洗冷凝管下端外部管下端外部取下接收瓶取下接收瓶注意注意加加NaOH一定要過量一定要過量，此時(shí)溶液生成，此時(shí)溶液生成深藍(lán)色深藍(lán)色或黑色或黑色沉淀沉淀為為防止樣液中氨氣逸出。防止樣液中氨氣逸出。一是要水封，二要夾緊廢液蝴蝶一是要水封，二要夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽，三要注意接頭處有無(wú)松漏現(xiàn)象夾后再通蒸汽，三要注意接頭處有無(wú)松漏現(xiàn)象硼酸吸收液的顏色硼酸吸收液的顏色反應(yīng)室中溶液的顏色反應(yīng)室中溶液的顏色 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能

9、蒸餾。吸收液溫度不應(yīng)超過吸收液溫度不應(yīng)超過4040，避免氨氣逸出，避免氨氣逸出，若超過若超過時(shí)可置于冷水浴中使用。時(shí)可置于冷水浴中使用。 在蒸餾時(shí)，在蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得，蒸餾過程中不得?；饠嗥；饠嗥? ,否則會(huì)發(fā)生否則會(huì)發(fā)生倒吸倒吸。 蒸餾完畢后，先將冷凝管下端離開液面，再蒸蒸餾完畢后，先將冷凝管下端離開液面，再蒸1 1分鐘，分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開，收瓶移開，最后關(guān)閉電源最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生則吸收液將發(fā)生倒吸倒吸。所用的試

10、劑溶液所用的試劑溶液 必須用必須用無(wú)氨蒸餾水無(wú)氨蒸餾水配制。配制。 3、鹽酸滴定、鹽酸滴定接收瓶接收瓶 以以HCL標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定 灰色終點(diǎn)灰色終點(diǎn) 記錄記錄VHcl（1 1）硼酸吸收液的）硼酸吸收液的顏色顏色（2 2）吸收氨氣后的）吸收氨氣后的硼酸吸收液的顏色硼酸吸收液的顏色（3 3）鹽酸滴定終點(diǎn)）鹽酸滴定終點(diǎn)的顏色的顏色項(xiàng)目名稱項(xiàng)目名稱檢測(cè)日期檢測(cè)日期樣品名稱樣品名稱檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)依據(jù)內(nèi)容內(nèi)容1 12 23 3 空白空白樣品質(zhì)量樣品質(zhì)量m/gm/gV V初初 /mL/mLV V終終 / / mLmL消耗的體積消耗的體積V V1 1 /mL /mL吸取消化液體積吸取消化液體積V V

11、3 3 /mL/mL蛋白質(zhì)含量（蛋白質(zhì)含量（g/100gg/100g）平均值（平均值（g/100gg/100g） （g/100gg/100g） F F：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.386.38【四、數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算四、數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算】n有效數(shù)字：有效數(shù)字：n蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留時(shí)，結(jié)果保留三位三位有效數(shù)字有效數(shù)字n蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留時(shí)，結(jié)果保留兩位兩位有效數(shù)字。有效數(shù)字。n精密度：精密度：n在重復(fù)性條件下的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超在重復(fù)性條件下的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的過

12、算術(shù)平均值的10%（g/100g）小結(jié)小結(jié)步驟步驟反應(yīng)前后顏色變化反應(yīng)前后顏色變化濕法消化濕法消化凱氏燒瓶：樣品無(wú)色（加硫酸前）凱氏燒瓶：樣品無(wú)色（加硫酸前）加硫加硫酸炭化黑色酸炭化黑色消化后紅棕色消化后紅棕色 棕褐色棕褐色消消化終點(diǎn)藍(lán)綠色化終點(diǎn)藍(lán)綠色/ /墨綠色墨綠色淡藍(lán)色（冷卻后溶淡藍(lán)色（冷卻后溶液）液）堿化蒸餾堿化蒸餾反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀硼酸吸收硼酸吸收紫紅色紫紅色綠色綠色鹽酸滴定鹽酸滴定甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色灰色灰色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色藍(lán)紫色藍(lán)紫色n凱氏定氮法用于所有動(dòng)物、植物類食

13、品的蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法用于所有動(dòng)物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉測(cè)定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測(cè)定結(jié)果為以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測(cè)定結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量。粗蛋白質(zhì)含量。n若要測(cè)定樣品的蛋白氮若要測(cè)定樣品的蛋白氮, ,則需要向樣品中加入則需要向樣品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶溶液液, ,使其最終濃度為使其最終濃度為5%,5%,然后測(cè)定未加入三氯乙酸的樣品然后測(cè)定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量, ,進(jìn)一步計(jì)算出蛋進(jìn)一步計(jì)算出蛋白質(zhì)

14、含量白質(zhì)含量: : 蛋白氮蛋白氮= =總氮總氮- -非蛋白氮非蛋白氮l準(zhǔn)確稱取某乳粉樣品準(zhǔn)確稱取某乳粉樣品0.8000.800克，經(jīng)凱氏法消化定容至克，經(jīng)凱氏法消化定容至100ml100ml，移 取移 取 5 m l5 m l消 化 液 進(jìn)行蒸餾 ， 用消 化 液 進(jìn)行蒸餾 ， 用 2 0 m l2 0 m l 硼 酸 吸 收 ， 再 用硼 酸 吸 收 ， 再 用0.05000mol/lHCl0.05000mol/lHCl滴定，結(jié)果消耗滴定，結(jié)果消耗5.00ml5.00ml，試計(jì)算該乳粉的，試計(jì)算該乳粉的蛋白質(zhì)含量？蛋白質(zhì)含量？l試述蛋白質(zhì)測(cè)定中，樣品消化過程所必須注意的事項(xiàng)，消試述蛋白質(zhì)測(cè)定

15、中，樣品消化過程所必須注意的事項(xiàng)，消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？l樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時(shí)溶樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時(shí)溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說(shuō)明什么問題？液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說(shuō)明什么問題？須采用什么措施？須采用什么措施？知識(shí)拓展：三聚氰胺假蛋白知識(shí)拓展：三聚氰胺假蛋白“原理原理”三聚氰胺的三聚氰胺的“優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)”1、普通蛋白質(zhì)含氮量平均為、普通蛋白質(zhì)含氮量平均為16%，一般不超，一般不超過過30%，而三聚氰胺含氮量為，而三聚氰胺含氮量為66.7。2、三聚氰胺為白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，、三聚氰胺為白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，摻入后容易摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，摻入后容易被檢測(cè)出來(lái)被檢測(cè)出來(lái)若以合格奶粉蛋白質(zhì)含量為若以合格奶粉蛋白質(zhì)含量為18%計(jì)算，則含氮量為計(jì)算，則含氮量為2.88%。三聚氰胺含氮量是牛