分離工程思考題1

1、）1 生物工程下游技術(shù)的主要內(nèi)容、根本任務(wù)和主要目標(biāo)？2 生物產(chǎn)品與普通化工產(chǎn)品分離過(guò)程有何不同？3 設(shè)計(jì)生物產(chǎn)品的分離工藝應(yīng)考慮哪些因素？4 初步純化與高度純化分離效果有何不同？5 分離純化的得率與純化倍數(shù)如何計(jì)算？6 現(xiàn)化生物分離技術(shù)研究方向有哪些特點(diǎn)？二）1. 為什么要進(jìn)行發(fā)酵液預(yù)處理？處理的目標(biāo)及內(nèi)容分別是什么？ 發(fā)酵液多為黏度大的懸浮液； 目標(biāo)產(chǎn)物在發(fā)酵液中的濃度常較低； 成分復(fù)雜，固體粒子可壓縮性大，懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大。因此，不易通過(guò)過(guò)濾或離心進(jìn)行細(xì)胞分離。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以便于固液分離，使后續(xù)的分離純化工序順利進(jìn)行。發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程包括：發(fā)酵液雜質(zhì)的

2、去除，包括除去雜蛋白、無(wú)機(jī)鹽離子以及色素、熱原、毒性物質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)；改善發(fā)酵液的處理性能，主要通過(guò)降低發(fā)酵液的黏調(diào)節(jié)適宜的PH值和溫度、絮凝和凝聚。2. 發(fā)酵液金屬離子的去除方法分別有哪些？（1）鈣離子的去除加入草酸，生成草酸鈣，沉淀去除。草酸與鎂離子結(jié)合生成草酸鎂，去除Mg2+草酸酸化發(fā)酵液，改變其膠體狀態(tài)，有助于目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相。在用量大時(shí)，可用其可溶性鹽。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液質(zhì)量。（2）鎂離子的去除可加入三聚磷酸鈉，形成絡(luò)合物。還可用磷酸鹽處理，大大降低鈣和鎂離子。（3）鐵離子的去除一般用黃血鹽去除，形成普魯士藍(lán)沉淀。3. 雜蛋白去除的方法和機(jī)理分別是什么？去除方

3、法主要有：鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、加熱法、有機(jī)溶劑沉淀法、吸附法等鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）使蛋白質(zhì)溶解度降低并沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析（saltingout）。這是由于這些鹽類離子與水的親和性大,又是強(qiáng)電解質(zhì)，可與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水膜。另外，大量中和蛋白質(zhì)顆粒上的電荷，使蛋白質(zhì)成為既不含水膜又不帶電荷的顆粒而聚集沉淀。等電點(diǎn)沉淀法：處于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥力最小，使它失去了作為膠體體系穩(wěn)定的基本因素，迅速結(jié)合成聚集體，極易沉淀析出。有機(jī)溶劑法：有機(jī)溶劑和水的親和力大，能奪取蛋白質(zhì)表面的水分子，即破壞蛋白質(zhì)膠體的水化膜，

4、同時(shí)也可降低溶液的介電常數(shù)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，產(chǎn)生凝聚和沉淀。發(fā)酵液處理性能的改善有哪些方法？降低發(fā)酵液的黏度，包括加熱法和加水稀釋法；調(diào)節(jié)pH值;絮凝絮凝和凝聚的概念、機(jī)理分別是什么？絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，是一種以物理的集合為主的過(guò)程。凝聚是指在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低（或由于微粒所帶電荷被加入的帶有相反電荷的高價(jià)離子中和），而使膠體體系不穩(wěn)定，微粒互相黏著在一起的現(xiàn)象。有哪些絮凝劑可以使用？從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，主要分為三類：高聚物、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)溶劑和表面活性劑。目前最常見(jiàn)的高聚物絮凝劑是有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類衍生

5、物、殼聚糖絮凝劑、聚苯乙烯類衍生物等。高聚物絮凝劑具有長(zhǎng)鏈狀的結(jié)構(gòu)，利用長(zhǎng)鏈上的活性基團(tuán)，通過(guò)靜電引力，形成橋架連接，從而生成菌團(tuán)沉淀。有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮和甲醛等對(duì)發(fā)酵液的絮凝有一定的作用。表面活性劑如三異丙醇胺聚氧乙烯聚氧丙烯醚，也可以提高絮凝處理效果。（三）固液分離的方法有哪些？其原理分別是什么？固液分離的方法有分離篩、懸浮分離、重力沉降以及離心和過(guò)濾等。用于發(fā)酵液固液分離的主要是離心和過(guò)濾。過(guò)濾就是利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體顆粒，從而實(shí)現(xiàn)固液分離。離心：依靠慣性離心力的作用而實(shí)現(xiàn)的沉降過(guò)程。適用于兩相密度差較小，顆粒粒度較細(xì)，在重力場(chǎng)中的沉降效率很低的非均相體系。1

6、. 生物產(chǎn)業(yè)過(guò)濾和離心分離常用的設(shè)備是什么？在生物工業(yè)中，常用的過(guò)濾發(fā)酵液的設(shè)備主要有板框過(guò)濾機(jī)、加壓過(guò)濾機(jī)和真空過(guò)濾機(jī)三類。工業(yè)生產(chǎn)中主要采用沉降式離心機(jī)，包括碟片式離心機(jī)、管式離心機(jī)和傾析式離心機(jī)。2. 改善過(guò)濾過(guò)程的方法有哪些？絮凝；助濾劑，助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，懸浮液中的大量膠體粒子吸附在助濾劑表面，改變?yōu)V餅的結(jié)構(gòu)，從而降低過(guò)濾的阻力；反應(yīng)劑，反應(yīng)劑之間能互相作用或能和發(fā)酵液中的雜質(zhì)反應(yīng)，生成CaS04AIP04等不溶性沉淀，從而提高過(guò)濾速率（四）1微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞的細(xì)胞壁都分別具有哪些特點(diǎn)?微革蘭氏革蘭氏酵母菌真菌生陽(yáng)性細(xì)菌陰性細(xì)菌物壁20-80nm10-13nm100

7、-300nm100-250nm厚層單層多層多層多層次主肽聚糖肽聚糖葡聚糖多聚糖要(40-90%)(5-10%)(30-40%)(80-90%)組多糖脂蛋白甘露聚糖脂類成胞壁酸脂多糖(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(11-22%)蛋白質(zhì)脂多糖磷脂(6-8%)(1-4%)蛋白質(zhì)脂類(8.5-13.5%)D-植物細(xì)胞壁：對(duì)于已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。初生壁由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，多糖主要成分為纖維素、半纖維素和果膠類物質(zhì)。纖維素是長(zhǎng)鏈葡聚糖，許多這樣的長(zhǎng)鏈形成微纖絲。在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素的沉積。2. 珠磨法、高

8、壓勻漿法、超聲波破碎法分別是什么原理？常用什么設(shè)備？珠磨法原理：細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂、氧化鋁（dv1mm）一起高速攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細(xì)胞達(dá)到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物。高壓勻漿法原理：利用高壓迫使懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_撞造成細(xì)胞破裂。超聲波破碎法原理：利用頻率高于20kHz的超聲波在水中傳播，產(chǎn)生能釋放巨大能量的激化和突發(fā)，即空穴作用?？昭ㄗ饔卯a(chǎn)生的空穴泡由于受到超聲波的沖擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)高達(dá)數(shù)百個(gè)大氣壓的沖擊力壓力，由此引起懸浮細(xì)胞上產(chǎn)生剪切力，使細(xì)胞液體產(chǎn)生流動(dòng)而破碎細(xì)胞。3. 酶溶法的原理是什么？對(duì)細(xì)菌和酵母分別常用什么酶？

9、酶溶法：利用酶反應(yīng)分解、破壞細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)健而達(dá)到破壁的目的。對(duì)細(xì)菌主要采用溶菌酶；酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等；植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。1. 雙水相去除細(xì)胞碎片分離目標(biāo)產(chǎn)物的原理和一般過(guò)程？將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無(wú)法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。雙水相萃取技術(shù)的工藝流程主要由三部分構(gòu)成:目的產(chǎn)物的萃取;PEG的循環(huán);無(wú)機(jī)鹽的循環(huán)。2. 膨脹床的概念？膨脹床吸

10、附分離的特點(diǎn)和原理是什么？一般的操作過(guò)程？膨脹床：通過(guò)對(duì)吸附劑本身物理性質(zhì)的改進(jìn)及對(duì)層析柱和流體分布器的精心設(shè)計(jì)，得到了穩(wěn)定、液固相返混程度較低的液固流化床。膨脹床吸附技術(shù),亦稱擴(kuò)張床吸附，集澄清、濃縮和初步純化于一體的吸附分離純化技術(shù)，它兼具流化床和填充床吸附的優(yōu)點(diǎn)，既能比較容易地讓固體顆粒通過(guò)填料層，又可以填充床的模式來(lái)吸附目標(biāo)產(chǎn)物。膨脹床的操作按順序可分為五個(gè)部分:(1)平衡、(2)吸附、(3)沖洗、(4)洗脫和(5)在位清洗。3. 何謂泡沫分離技術(shù)？其原理是什么？泡沫分離是一項(xiàng)利用物質(zhì)在氣泡表面上吸附性質(zhì)的差異進(jìn)行分離的技術(shù)。泡沫分離是根據(jù)吸附的原理，向含表面活性物質(zhì)的液體中鼓泡，使液

11、體內(nèi)的表面活性物質(zhì)聚集在氣液界面(氣泡的表面)上，在液體主體上方形成泡沫層，將泡沫層和液相主體分開(kāi)，就可以達(dá)到濃縮表面活性物質(zhì)(在泡沫層)和凈化液相主體的目的。被濃縮的物質(zhì)可以是表面活性物質(zhì)，也可以是能與表面活性物質(zhì)相絡(luò)合的物質(zhì)，但它們必須具備和某一類型的表面活性物質(zhì)能夠絡(luò)合或鰲合的能力。4. 比較雙水相分離技術(shù)、膨脹床分離技術(shù)和泡沫分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。(五)1、何謂超臨界流體萃?。科涮攸c(diǎn)有哪些？利用超臨界流體作為萃取劑的萃取操作稱為超臨界萃取。優(yōu)點(diǎn)：操作溫度低。能較好地使萃取物的由此成分不被破壞，可在接近常溫下完成萃取工藝。在高壓、密閉、惰性環(huán)境中，選擇性萃取分離天然產(chǎn)物。萃取工藝簡(jiǎn)單，效率高

12、且無(wú)污染。局限性：缺乏生物化合物在超臨界流體中的溶解度和相平衡數(shù)據(jù)，使工藝設(shè)計(jì)不好掌握。(原理：流體在臨界區(qū)域附近，壓力和溫度的微小變化，會(huì)引起流體密度的大幅度變化，而非揮發(fā)性溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度大致和流體的密度成正比，保持溫度恒定，壓力增加，超臨界流體的密度變大，對(duì)溶質(zhì)的溶解度增大，對(duì)溶質(zhì)的萃取能力也就增強(qiáng)。）2、何謂雙水相萃??？常見(jiàn)的雙水相構(gòu)成體系有哪些？某些親水性高分子聚合物的水溶液超過(guò)一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)，利用蛋白質(zhì)在兩個(gè)水相中的溶解度的差別進(jìn)行萃取操作的技術(shù)。常用的雙水相體系有聚乙二醇/葡聚糖，聚乙二醇/鹽體系。3、反膠團(tuán)的構(gòu)成

13、以及反膠團(tuán)萃取的基本原理反膠團(tuán)體系由水、有機(jī)相及表面活性劑組成，是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中自發(fā)形成的一種具有微水池結(jié)構(gòu)的油包水微乳液。原理：蛋白質(zhì)能溶于反膠團(tuán)的“水池”中。在有機(jī)溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面活性劑層，同臨近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引而變形，接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)，然后擴(kuò)散到有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。（六）什么是沉淀法？沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)溶解度降低，形成固相從溶液中析出從而達(dá)到分離的一種技術(shù)。沉淀法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)有哪些？?jī)?yōu)點(diǎn)：過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低，原料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高，對(duì)大多數(shù)生物分子的分離

14、純化有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)：過(guò)濾困難，對(duì)于復(fù)雜產(chǎn)品體系，分離度不高，產(chǎn)品質(zhì)量較低，需重新精制。常用的沉淀方法包括哪些？主要包括有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、高聚物沉淀和聚電介質(zhì)沉淀、等電點(diǎn)沉淀等。有機(jī)溶劑沉淀法的原理是什么？A降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機(jī)<D水），減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質(zhì)、核酸等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B破壞水化膜：由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質(zhì)分子的溶劑化能力，破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。C相反力：疏水基團(tuán)暴露,有機(jī)溶劑與疏

15、水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層。影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素有哪些？溫度、pH值、樣品濃度、中性鹽濃度、某些金屬離子何謂鹽析？其原理是什么？在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過(guò)程。原理：（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，

16、使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。何謂“Ks分級(jí)鹽析法？何謂“（3”分級(jí)鹽析法？第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過(guò)改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，（固定pH,溫度，改變鹽濃度），由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于早期的粗提液；第二種叫B分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變PH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，改變pH及溫度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。常用的鹽是什么，影響鹽析的主要因素有哪些？硫酸銨影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素有鹽析劑的種類和濃度，溶液的PH值和溫度，蛋白質(zhì)的濃度，以及溶液中各種雜質(zhì)的種類和數(shù)量等。高聚物沉淀的原

17、理是什么？常用的高聚物是什么？高聚物分子上有許多可結(jié)合水分子的羥基，加入后結(jié)合自由水分子，使蛋白質(zhì)表面的水化層被破壞，使疏水區(qū)域暴露出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)大分子沉淀出來(lái)。聚乙二醇（PEG）等電點(diǎn)沉析的工作原理是什么？處于等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)所帶的靜電荷為零，蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥力最小，此時(shí)，蛋白質(zhì)迅速結(jié)合成聚集體，極易沉淀析出。七）什么是膜分離技術(shù)？膜分離技術(shù)（membraneseparation是利用天然或人工制備的、具有選擇透過(guò)性的膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力，對(duì)雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和濃縮的方法。膜分離技術(shù)的原理及特點(diǎn)是什么？原理：膜具有選擇透過(guò)性，低分子量的

18、物質(zhì)能通過(guò)特定的半透膜，而聚合物和其他高分子量的物質(zhì)則被截留下來(lái)。當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推動(dòng)力（如壓力差、濃度差、電位差等）原料側(cè)組分選擇性地透過(guò)膜從而達(dá)到分離提純的目的。膜分離的傳質(zhì)過(guò)程極為復(fù)雜。通過(guò)多孔型模的模型有孔模型、微孔擴(kuò)散模型、優(yōu)先吸附-毛細(xì)管流動(dòng)模型；通過(guò)非多孔膜的主要是溶解-擴(kuò)散模型等。特點(diǎn)：（1）不發(fā)生相的變化，因而能耗低；（2）壓力驅(qū)動(dòng)下常溫分離，特別適合于熱敏性物質(zhì)；（3）適用范圍極廣，從微粒級(jí)到微生物菌體，甚至是離子級(jí)等都能通過(guò)選擇不同類型的膜進(jìn)行分離；（4）穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單；（5）裝置簡(jiǎn)單、分離效率高，易與已有工藝結(jié)合。膜有哪些分類？ 按孔徑大小，可分為微濾膜（MF）、超

19、濾膜（UF）、納濾膜（NF）、反滲透膜（R0）等。 按推動(dòng)力的不同，可分為滲透、透析、電滲析、反滲透、納濾、超濾、微濾。微濾、超濾、納濾、反滲透的相同點(diǎn)和相異點(diǎn)？微濾、超濾、納濾、反滲透相同點(diǎn)： 以膜兩側(cè)壓力差為推動(dòng)力；按體積大小而分離；膜的制造方法、結(jié)構(gòu)和操作方式都類似。微濾、超濾、納濾、反滲透區(qū)別： 膜孔徑：微濾0.110m超濾0.010.卩納濾0.0010.0Wm反滲透小于O.OOWm分離粒子：微濾截留固體懸浮粒子，固液分離過(guò)程；超濾、納濾、反滲透為分子級(jí)水平的分離;分理機(jī)理：微濾、超濾和納濾為截留機(jī)理，篩分作用；反滲透機(jī)理是滲透現(xiàn)象的逆過(guò)程：壓差：微濾、超濾和納濾壓力差不需很大0.10

20、.6MPa膜材料有哪些要求？都有哪些類別？1）基本要求： 耐壓,膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在0.10.5MPa,反滲透膜的壓力更高，約為110MPa; 耐高溫,高通量帶來(lái)的溫度升高和清洗的需要；耐酸堿性，防止分離過(guò)程中，以及清洗過(guò)程中的水解； 化學(xué)相容性，保持膜的穩(wěn)定性；生物相容性，防止生物大分子的變性； 低成本。2）類別：天然材料：纖維素酯類；人造材料：縮合系聚合物，聚烯烴及其共聚物，脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物，全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物，聚碳酸酯。特殊材料：復(fù)合膜，無(wú)機(jī)膜,不銹鋼膜，陶瓷膜膜組件有哪些種類？膜組件：有膜、固定膜的支撐體、間隔物以及

21、容納這些部件的容器構(gòu)成的一個(gè)單元。微濾膜的主要性能特點(diǎn)是什么？過(guò)濾的機(jī)理有哪些？微孔膜的主要性能特點(diǎn)包括：（1）分離效率是微孔膜最重要的性能特性。其孔徑較均一，過(guò)濾精度較高，可靠性較高（2）孔隙率是微孔膜的又一重要特性。可達(dá)70%以上。（3）微孔膜的厚度在90-150卩m,不僅有利于過(guò)濾，而且吸附造成的損失非常少。（4）高分子類微孔膜為一均勻的連續(xù)體。機(jī)理：微濾膜的分離機(jī)理主要是篩分截留。對(duì)于懸浮液中的液固分離，微濾膜的主要作用有：（1）篩分作用；（2）吸附作用；（3）架橋作用；（4）網(wǎng)絡(luò)作用；（5）靜電作用。對(duì)氣體中的懸浮顆粒進(jìn)行分離時(shí)，微濾膜的主要作用是直接截留、慣性沉積、擴(kuò)散沉積和攔集作

22、用。微濾膜的污染原因、預(yù)防措施、清洗措施分別有哪些？（1）微濾膜的污染分為兩部分，一部分是可逆污染，即通過(guò)水力沖洗等方法可以除去，包括微粒等在膜表面形成的極化層或凝膠層；另一部分是不可逆污染，即常規(guī)物理方法難以消除，包括溶質(zhì)在膜表面的吸附、膜孔堵塞等。（2）采用親水性的膜；使用帶負(fù)電荷的微濾膜；膜污染的控制主要有以下幾種方法： 原料液的預(yù)處理； 膜表面的改性； 外加場(chǎng)對(duì)膜污染進(jìn)行控制； 高壓反沖； 強(qiáng)化傳質(zhì)。(3) 物理清洗法：水力學(xué)反沖洗、氣體反沖洗化學(xué)清洗法：常用的清洗劑有酸液、堿液、表面活性劑、酶、消毒劑、配合劑。(八)色譜原理當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。

23、由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。1. 色譜法中的主要參數(shù)和關(guān)系式1)分配系數(shù)Kp:定溫定壓下物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度比。KP=Cs/Cm(s固定相；m流動(dòng)相)(2) 容量因子K':分配系數(shù)與兩相體積有關(guān)的參數(shù)，表示溶質(zhì)A在兩相中的質(zhì)量之比。K'=mCs/mCm=KPxVs/Vm(3) 分離比a：色譜分析法中A、B兩種物質(zhì)的分離效率可用分離比表示基線一經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流

24、出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。峰底：基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高：峰的最高點(diǎn)至峰底的距離峰寬：色譜兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距。W=4t標(biāo)準(zhǔn)偏差(c：0.607倍峰高處峰寬的一半。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。c小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，c大，峰形胖、柱效低。2. 死時(shí)間to:不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰值所需的時(shí)間。死體積：不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰值所需的流動(dòng)相體積。但在實(shí)際測(cè)量時(shí)，它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被流動(dòng)相占據(jù)，Vo)、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。5保留時(shí)間tR:被分

25、離樣品組分從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時(shí)的時(shí)間。保留體積Vr:指從進(jìn)樣開(kāi)始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積。調(diào)整保留時(shí)間：扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。t'R=tRto調(diào)整保留體積VR：扣除死體積后的保留體積6.理論塔板數(shù)N:通常用N來(lái)表示柱效.N二L/H,即色譜柱長(zhǎng)/虛擬的塔板間高度或者理論塔板數(shù)=5.54(保留時(shí)間/半高峰寬)27吸附等溫線：在一定溫度下，平衡時(shí)吸附劑吸附溶質(zhì)濃度q*與液相溶質(zhì)濃度c之間的關(guān)系為線性函數(shù)：q*=mcq和c的關(guān)系曲線為吸附等溫線。8.色譜分離度：相鄰兩組份色譜峰保留值之差與兩個(gè)組份色譜峰低寬度總和之半的比值。以此判斷相鄰兩組份在色譜

26、柱中的分離情況。它是指相鄰兩色譜保留值之差與兩峰底寬平均值之比。R=2t(R2)-t(R1)/(W1+W2)9影響分離度的因素：二'：;4«1+(1) 增加塔板數(shù)n,可以增加分離度，若通過(guò)增加柱長(zhǎng)來(lái)增加塔板數(shù)，就會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。(2) 增大容量因子k2，可以提高分離度。但會(huì)延長(zhǎng)分離時(shí)間，一般在k是在27之間。(3) 選擇性參數(shù)a(洗脫峰相臨的兩種溶質(zhì)的容量因子之比)的微小增大，都會(huì)使分離度得到較大的改善。10.凝膠過(guò)濾色譜(GFC)凝膠滲透色譜(GPC):根據(jù)流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離。離子交換色譜(IEC):根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的

27、差別進(jìn)行溶質(zhì)分離反相色譜(RPC):根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化。疏水色譜(HIC):根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化親和色譜(AC):利用生物分子之間的專一性識(shí)別或特定的相互作用進(jìn)行分離。11凝膠特性參數(shù)： 排阻極限：凝膠過(guò)濾介質(zhì)的排阻極限是指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量。 分級(jí)范圍：能被凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。 溶脹率：溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)。12. 凝膠色譜應(yīng)用：分離純化，酶解產(chǎn)物的分離、純化青霉素、蛋白質(zhì)再?gòu)?fù)性。脫鹽，生物大分子溶液的脫鹽，以及除去其中的低

28、相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，在凝膠過(guò)濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(或洗脫體積)與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成正比，所以GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。濃縮離子交換色譜的洗脫方法：如果采用離子強(qiáng)度不變的流動(dòng)相進(jìn)行恒定洗脫，兩種蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫因此，IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法、逐次洗脫法。（1）線性梯度洗脫法流動(dòng)相的離子強(qiáng)度線性增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)逐漸降低，移動(dòng)速度逐漸增大，使溶質(zhì)在較少的流動(dòng)相內(nèi)洗脫出來(lái)（2）階梯洗脫法流動(dòng)相的離子強(qiáng)度階躍增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)也階躍性降低，移動(dòng)速度也是階段式的。13. 凝膠色譜的應(yīng)用

29、：（1）氨基酸和堿性肽類的分離（2）堿性水溶性抗生素的分離（3）蛋白質(zhì)的分離純化（4）多糖類的分離純化疏水色譜（HIC）和反相色譜（RPC）都是利用蛋白質(zhì)上疏水基團(tuán)作用的大小不同而得到分離，二者主要差別如下：（1）疏水配基的密度不同。RPC的疏水配基一般采用數(shù)量級(jí)為102微摩爾/mL膠；HIC中的密度一般為1050微摩爾/mL膠。（2）流動(dòng)相體系不同。RPC流動(dòng)相一般為有機(jī)溶劑，HIC流動(dòng)相則為在水溶液。（3）再生條件不同。RPC主要用于小分子或蛋白質(zhì)，再生在劇烈條件下，而HIC主要針對(duì)大分子，采用降低鹽濃度扥方法進(jìn)行再生，條件比較溫和。14. 親和作用色譜原理及過(guò)程（1）配基固定化：親和的一

30、對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑（2）吸附樣品：當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附，其它沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出（3）樣品解析：然后改變流動(dòng)相成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)目標(biāo)產(chǎn)物洗脫方式:特異性洗脫法：利用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過(guò)與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，脫附目標(biāo)產(chǎn)物非特異性洗脫：通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標(biāo)產(chǎn)IEX分辨率高交換容量高快速CniilunIntennttlatt*簣PolishSompte

31、StartmlillQR期伽fi|高離子強(qiáng)度或pH改變的濃縮組分低離子強(qiáng)上樣體積度不限HIC分辨率較高交換容量較高快速*M高離子強(qiáng)上樣體積度不限低離子強(qiáng)度|的濃縮組分AC分辨率高交換容量高快速專一性結(jié)上樣體積合不限專一性洗脫條件下的濃縮組分使用SuphadexTM可提高分辨率高*上樣體積受限（小于柱體積的5%），低速高度稀釋的稀組分RPC分辨率高需要有機(jī)溶劑樣品在有機(jī)溶劑中可能失活I(lǐng)EX分辨率高交換容量高快速CniilunIntennttlatt*簣PolishSompteStartmlillQR期伽fi|高離子強(qiáng)度或pH改變的濃縮組分低離子強(qiáng)上樣體積度不限HIC分辨率較高交換容量較高快速*M

32、高離子強(qiáng)上樣體積度不限低離子強(qiáng)度|的濃縮組分AC分辨率高交換容量高快速專一性結(jié)上樣體積合不限專一性洗脫條件下的濃縮組分使用SuphadexTM可提高分辨率高*上樣體積受限（小于柱體積的5%），低速高度稀釋的稀組分RPC分辨率高需要有機(jī)溶劑樣品在有機(jī)溶劑中可能失活電泳：荷電溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向泳動(dòng)的現(xiàn)象。1. 電泳技術(shù)：是根據(jù)荷電溶質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的差別對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的一種實(shí)驗(yàn)方法。2. 電泳的基本原理：（1）、帶電顆粒?溶液中任何物質(zhì)由于其本身的解離或表面吸附帶電荷而帶電，在電場(chǎng)中就會(huì)發(fā)生遷移?生物大分子如蛋白質(zhì)、核算、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于溶液的H+濃度。

33、?帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。（2）、電泳遷移率：即單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的遷移速度。（3）、泳動(dòng)速度：在一定的條件下，任何物質(zhì)都有自己特定的泳動(dòng)速度，泳動(dòng)速度是膠體顆粒的一個(gè)物理常數(shù)。3. 影響電泳速度的主要因素：（1）顆粒性質(zhì)*Eq由公式'可見(jiàn)，顆粒帶的靜電荷越多，直徑越小，而且形狀越接近球形，其泳動(dòng)速度越快；（2）電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度越大，泳動(dòng)速度越快（3）溶液性質(zhì)主要指的是電解質(zhì)和蛋白質(zhì)樣品溶液的pH值、離子強(qiáng)度和溶液粘度（4）pH值：決定了蛋白質(zhì)的解離度及其所帶的靜電荷量，溶液的pH遠(yuǎn)離其pl的蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速度越快。（5）離

34、子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度一般在之間時(shí)，電泳比較合適。一般選擇較低的離子強(qiáng)度，原因是在保證一定緩沖能力的情況下，低離子強(qiáng)度溶液中相反電荷離子對(duì)電泳顆粒的靜電引力作用，泳動(dòng)速度較快（6）溶液粘度n:與泳動(dòng)速度成反比（7）電滲，當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向跟電滲方向一致時(shí)，則加快顆粒的泳動(dòng)，反之則降低顆粒的泳動(dòng)速度。（8）焦耳熱；（9）支持物篩孔的大小按照有無(wú)支持介質(zhì)可將電泳分為：自由界面電泳：溶質(zhì)顆粒經(jīng)過(guò)電泳后，在膠體顆粒和緩沖溶液之間形成界面，帶電顆粒的泳動(dòng)速度通過(guò)光學(xué)方法觀察界面的移動(dòng)來(lái)測(cè)定。區(qū)帶電泳：樣品在一惰性物質(zhì)上進(jìn)行電泳的的過(guò)程。因電泳后樣品中不同的成分可形成獨(dú)立的帶狀區(qū)間而命名。4. 凝膠電泳：凝膠電泳

35、利用凝膠的分子篩作用使分子大小不同的電解質(zhì)得到分離：相對(duì)分子質(zhì)量大的溶質(zhì)受凝膠阻滯作用大，泳動(dòng)速度較慢，小分子溶質(zhì)泳動(dòng)速度較快。5. 凝膠電泳的支持介質(zhì)：-聚丙烯酰胺凝膠（PAG）-瓊脂糖凝膠8.SDS-PAGE原理：由于加入了SDS和強(qiáng)還原劑（DTT等），破壞了蛋白質(zhì)分子的高級(jí)（二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)）結(jié)構(gòu)，并與蛋白質(zhì)形成荷大量負(fù)電荷的聚合物，消除了不同蛋白質(zhì)分子電荷及分子形狀差異，而僅將分子量差異作為分離依據(jù)，常用于測(cè)定未知蛋白質(zhì)的亞基分子量。9不連續(xù)PAGE凝膠電泳：濃縮膠：為大孔膠，凝膠濃度和pH值跟樣品一致。作用是使樣品進(jìn)入分離膠之前，被濃縮成窄的區(qū)帶，提高分離效果。分離膠：為小孔膠，樣品

36、遷移受阻而形成很小的區(qū)帶在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。10等電聚焦（IEF）原理：利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子的等電點(diǎn)不同，電泳時(shí)待分離的兩性分子可以在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中遷移，直到聚集于與其等電點(diǎn)相同的區(qū)域，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。11.IPG：固定化pH梯度等電聚焦介質(zhì)IPG膠條的泡脹：讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，為IEF做準(zhǔn)備，常用的泡脹液的成分為：8M尿素，2%的去污劑、15mMDTT,0.5%IPGbuffer。（十）1包涵體：蛋白質(zhì)多肽鏈在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，形成沒(méi)有生物活性的無(wú)定形聚集。形成機(jī)制：（1）電荷平均數(shù)小、轉(zhuǎn)角形成殘基含量較高的蛋白易形成包涵體。（2）表達(dá)產(chǎn)物周圍的環(huán)境不適，高溫