分子雜交技術(shù)

1、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共50頁第一節(jié)第一節(jié) 分子雜交的原理分子雜交的原理核酸分子雜交核酸分子雜交（nucleic acid hybridization） 指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程?；鋵υ瓌t形成雙鏈的過程。 分子雜交是通過配對堿基對之間的非共價鍵非共價鍵（主要是氫鍵）結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共50頁不同來源的不同來源的DNA或或RNA單鏈在一

2、定條件下重單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子新組成的新的雙鏈分子雜交分子雜交分子 若所用的核酸探針的片段較長(幾百個核苷酸以上)，可以得到很準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。但若人工合成的寡核苷酸探針片段較短（如2030個核苷酸），則難免會出現(xiàn)準(zhǔn)確性差的假陽性現(xiàn)象。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。知核酸序列稱探針?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共50頁雜交的雙方：探針和要檢測的核酸。 將核酸分子固定在固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針和被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。被檢測的核酸： 克隆化的基因組DNA 提純的 細(xì)胞總DNA

3、細(xì)胞內(nèi)雜交（細(xì)胞原位雜交） 細(xì)胞總RNA現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共50頁 DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共50頁 雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共50頁（一）（一）DNA變性變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性變性l2、變性的方法：、變性的方法：l（1）熱變性：溫度升高到）熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核時，雙鏈核酸酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完全斷裂。l （2）酸堿變性：）酸堿

4、變性：pH值低于值低于3或高于或高于10時，雙鏈核時，雙鏈核酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。l （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共50頁GC含量與含量與Tm值之間的關(guān)系值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共50頁l（二）復(fù)性（二）復(fù)性l 1、定義：變性的單鏈核酸分子在、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過

5、程，稱復(fù)性或雜交。雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。l具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：形成雙鏈：lDNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共50頁2、復(fù)性過程、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列中心序列（4）形成完整的雙鏈分子）形成完整的雙鏈分子現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共5

6、0頁待測核酸制備待測核酸制備濾膜上核酸固化濾膜上核酸固化雜雜 交交去除未參與雜交的探針去除未參與雜交的探針檢檢 測測 雜雜 交交 信信 號號制備探針核酸片段制備探針核酸片段探探 針針 標(biāo)標(biāo) 記記加入標(biāo)記核酸探針加入標(biāo)記核酸探針 電泳電泳現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共50頁 制備制備DNA或或RNA樣品樣品與固定基質(zhì)結(jié)合與固定基質(zhì)結(jié)合80真真空固定空固定預(yù)雜交預(yù)雜交加入標(biāo)記探針雜交加入標(biāo)記探針雜交洗滌洗滌放放射自顯影或顯色反應(yīng)。射自顯影或顯色反應(yīng)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共50頁探針（探針（Probe)Probe)的概念的概念: : 一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的D

7、NA特異互補的已知核苷酸序列。特異互補的已知核苷酸序列?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共50頁長度一般以長度一般以50300bp為宜，有時達(dá)為宜，有時達(dá)1.5kb。制。制備方法：備方法： (1) DNA重組技術(shù)重組技術(shù) (2) PCR擴增擴增 (3) 化學(xué)合成化學(xué)合成現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共50頁2. 探針的分類探針的分類 據(jù)來源及性質(zhì)不同可分為：據(jù)來源及性質(zhì)不同可分為： (1) 基因組基因組DNA探針探針 (2) cDNA探針探針 (3) RNA探針探針 (4) 寡核苷酸探針寡核苷酸探針現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共50頁(1) (1) 長度（長度（10-50 bp); 10-50 bp); (2) G:

8、C(2) G:C對含量對含量40%-60%40%-60%；(3) (3) 探針內(nèi)避免互補；探針內(nèi)避免互補；(4) (4) 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5) (5) 與非靶序列有與非靶序列有70%70%以上同源性或連續(xù)以上同源性或連續(xù)8 8個以上堿基序列相同，最好不用。個以上堿基序列相同，最好不用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁，共50頁 為確定為確定探針是否與相應(yīng)基因組探針是否與相應(yīng)基因組DNADNA雜交雜交，有必要，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。信號?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，共50頁 同位素：同位素： 3232P P、3

9、535S S、3 3H H、125125I I等標(biāo)記探針等標(biāo)記探針非同位素：非同位素： 生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共50頁l按其分子種類劃分按其分子種類劃分（1）Southern印跡雜交印跡雜交（2）Northern印跡雜交印跡雜交3） Western印跡雜交印跡雜交現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共50頁按待測核酸是否固定在固相支持物上分：按待測核酸是否固定在固相支持物上分：l 固固-液相雜交液相雜交 膜上印跡雜交膜上印跡雜交 原位雜交原位雜交l 液相雜交液相雜交 RNA酶保護(hù)分析法酶保護(hù)分析法 核酸酶核酸酶S1保護(hù)分析法保護(hù)分

10、析法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共50頁l其基本原理是將待檢測的其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。有與探針同源的片段以及該片段的長度。lDNA經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。l利用這一技術(shù)可進(jìn)行克隆基因利用這一技術(shù)

11、可進(jìn)行克隆基因DNADNA的酶切圖譜分的酶切圖譜分析，基因組中某一基因的定性與定量分析、基因點突析，基因組中某一基因的定性與定量分析、基因點突變及限制性片段長度多態(tài)性分性等。變及限制性片段長度多態(tài)性分性等?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共50頁步驟：l酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 (3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 (5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共50頁帶有帶有DNA片段的凝膠片段的凝膠D

12、NA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳至至膜（尼龍膜或硝酸膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）纖維素濾膜）上上轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜雜交、顯影雜交、顯影凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移用緩沖液轉(zhuǎn)移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印跡雜交的技術(shù)流程印跡雜交的技術(shù)流程現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共50頁（一）待測核酸樣品的制備（一）待測核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細(xì)胞、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化、限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁，共50頁（二）待測（二）

13、待測DNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記，所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記，雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共50頁 （三）凝膠中核酸的變性（堿變性）（三）凝膠中核酸的變性（堿變性） 分子量超過10kb的較大的DNA片段，需要很長的轉(zhuǎn)移時間。必須將最長的DNA片段控制在大約2kb以下。如果靶序列5kb，則需進(jìn)行脫嘌呤處理（ DNA產(chǎn)生缺口將提高轉(zhuǎn)移的質(zhì)量）。l把凝膠浸在0.25mol/LHCl中，室溫輕輕晃動，直到溴酚藍(lán)從藍(lán)變黃。 注意：處理人類基因組DNA10分鐘；處理植物基因組DNA20分鐘。 再 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十

14、六頁，共50頁l如果靶序列5kb，則直接進(jìn)行下面的步驟 (1) 把凝膠浸在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室溫215分鐘，輕輕晃動。 (2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中 (3) 把凝膠浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，Ph7.5，1.5mol/L NaCl），室溫215分鐘。 (4) 在20SSC中平衡凝膠至少10分鐘。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁，共50頁（四）（四）Southern印跡印跡高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長用）上，烘干固定后即可用于雜交本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)

15、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁，共50頁（1）毛細(xì)管虹吸印跡法）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移片段移出凝膠而滯留在膜上

16、出凝膠而滯留在膜上現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁，共50頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁，共50頁白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十一頁，共50頁優(yōu)點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十二頁，共50頁（2）真空轉(zhuǎn)移法）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片凝膠和濾膜抽到下

17、層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十三頁，共50頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十四頁，共50頁優(yōu)點是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(109 cpm/g)互補DNA。如果將10g基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十二頁，共50頁（七）（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量、特定基因定性和定量 3、基因突變分析、

18、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析、限制性片段長度多態(tài)性的分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十三頁，共50頁原理：原理：Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至分離開來，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或或RNA探針，探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)RNA所在位置表示其所在位

19、置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標(biāo)分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標(biāo)RNA在所測樣品中的相對含量（即目標(biāo)在所測樣品中的相對含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。的豐度）?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十四頁，共50頁 1、鑒別、鑒別RNA 2、探針可用、探針可用DNA或或RNA片段片段 3、待測樣品為總、待測樣品為總RNA或或mRNA現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十五頁，共50頁Northern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點印跡的不同點1. 總總RNA不需要進(jìn)行酶切，即是以各個不需要進(jìn)行酶切，即是以各個RNA分子的形式存分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳；在，可直接應(yīng)用于電泳； 2、變性：、變性：RNA電泳前加熱變性，電泳前加熱變性，電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。DNA電泳前和電泳電泳前和電泳 中不變性中不變性 3、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印印跡時，跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理。轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理。在烘烤前RNA與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，