微生物的遺傳變異與育種

1、1 微生物的遺傳變異與育種 第八章2本章內(nèi)容：基因突變與誘變育種基因重組菌種的衰退、復(fù)壯及保藏3第一節(jié) 基因突變與誘變育種4一、基因突變：一、基因突變：（一）突變類型： 基因突變與誘變育種 細(xì)胞形態(tài)形態(tài)突變型 菌落形態(tài) 營養(yǎng)缺陷型生化突變型 抗性突變 抗原性突變（包括細(xì)胞內(nèi)部、表面成分的 改變）致死性突變型（合成關(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變，則表現(xiàn) 出致死突變）條件致死突變型：如突變?yōu)闇囟让舾行停?7死， 25 活） 其它突變型：毒力突變、糖發(fā)酵突變、產(chǎn)量、產(chǎn)品突變等 按表型分5溫度敏感型突變基因突變與誘變育種6（二）突變的特點(diǎn)： 1）不對應(yīng)性：環(huán)境與變異無對應(yīng)性 2）自發(fā)性：非人為的誘變因素下發(fā)

2、生 3）稀有性：生物體的自發(fā)突變率為10-1010-12 4）獨(dú)立性：一個基因的突變對其它基因突變無 影響 5）誘變性：誘變劑可提高突變率10105倍 6）穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳 7）可逆性：有回復(fù)突變基因突變與誘變育種7（三）基因突變自發(fā)性及不對應(yīng)的證明： 基因突變與誘變育種 變量彷徨試驗(yàn)： 涂布試驗(yàn)試驗(yàn)： 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)：自發(fā)突變：沒有人工誘變因素的參與，生物體的自然突變81.1.變量彷徨試驗(yàn)：變量彷徨試驗(yàn)：1)抗性細(xì)胞的出現(xiàn)，是在接觸噬菌體之前；2)噴上噬菌體，僅起淘汰野生型和鑒別抗性株作用；3)由于甲方高度彷徨，說明突變是隨機(jī)的?；蛲蛔兣c誘變育種92. 2. 涂布試驗(yàn)涂布試驗(yàn)

3、基因突變與誘變育種1、突變與噬菌體無關(guān)；2、涂布使抗性菌株均勻分布；3、抗性突變可在任何時間發(fā)生，與噬菌體存在無關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理間接證明。103. 3. 平板影印平板影印基因突變與誘變育種實(shí)驗(yàn)表明：從未接觸 str 的菌株可發(fā)生抗性突變， 分離可得到純的 str r 菌株。11由此表明： 突變是自發(fā)的與環(huán)境不對應(yīng)的?；蛲蛔兣c誘變育種（四）基因突變的機(jī)制：（自學(xué)） （五）紫外線(U.V)對DNA的損傷及修復(fù): （自學(xué)）12二、突變與育種二、突變與育種（一）自發(fā)突變與生產(chǎn)育種基因突變與誘變育種1.生產(chǎn)選育：群體培養(yǎng)中個別的變異個體表現(xiàn)出 生長優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)突變種后，隨時分離、純化。2.定向培

4、育：用特定的環(huán)境長期處理某一微生物 群體,同時不斷對其移種、傳代，以達(dá)到積累 和選擇合適的自發(fā)突變 體的一種育種方法. 133、自發(fā)突變的機(jī)制：自發(fā)突變(spontaneous)：在非人為的情況下由于 遺傳 物質(zhì)的微小變化引起的性狀變異。原因可能是：1）環(huán)境因素；2）自身有毒產(chǎn)物的積累；3）互變異構(gòu)效應(yīng)；4）環(huán)出效應(yīng)等?；蛲蛔兣c誘變育種14（二）誘變育種1. 概念：誘變育種是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。 基因突變與誘變育種152. 誘變劑：2）種類： 物理因子（phisical agent

5、s) 化學(xué)因子(chemical agents) 轉(zhuǎn)座子(transposable elements)物理誘變劑：U.V、快中子、超聲波等。基因突變與誘變育種1） 概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。16 化學(xué)誘變劑： 烷化劑 (alkylating agents)： 如：氮芥、硫酸二乙酯、亞硝基胍、NTG等 機(jī)制：將烷烴加在含氮堿基上，改變氫鍵性質(zhì) 堿基類似物 (base analogs)： 如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）等； 機(jī)制：在DNA復(fù)制時將堿基類似物插入DNA中，而堿 基類似物沒有正常堿基的氫鍵性質(zhì)，在DNA復(fù) 制時出現(xiàn)突變體。基因突變與誘變育種17 插入劑 (intercalati

6、ng agents):如：溴化乙啶等一些三環(huán)分子。機(jī)制：與DNA中的一對堿基有大致相同的位點(diǎn)，這些分子 不改變堿基的氫鍵性質(zhì)，而插入在雙螺旋中，加寬間 距，引起堿基增加。基因突變與誘變育種183. 誘變程序：基因突變與誘變育種原始菌種純化斜面/肉湯培養(yǎng)單孢子/單細(xì)胞懸液誘變劑處理平板分離移至斜面小試中試初篩復(fù)篩計(jì)算存活率觀察形態(tài)變異，挑單菌落良種保藏原菌種特性鑒定194. 誘變的主要環(huán)節(jié)1）誘變劑的選擇：基因突變與誘變育種a. 了解誘變劑的性質(zhì)、作用機(jī)理和使用方法b. 處理方式： 單一因子處理： 復(fù)合因子處理：兩種以上因素先后使用同時使用單一因子重復(fù)使用20c. 處理劑量：測致死率。 方法平板

7、菌落計(jì)數(shù)法紙片法一般殺菌率為70%左右。基因突變與誘變育種21Ames testAmes test：對化學(xué)誘變劑做檢測：對化學(xué)誘變劑做檢測菌種：鼠傷寒沙門氏菌 his -；原理： his -在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長?；蛲蛔兣c誘變育種22Ames test Ames test 方法示意圖方法示意圖用于檢測食品、飲料、藥物和飲水等樣品的中致癌物基因突變與誘變育種232）出發(fā)菌株： 育種的原始菌種；應(yīng)具備：對誘變劑的敏感性高；生產(chǎn)中選育過的自發(fā)變異菌株；本身具有一些有利性狀；對代謝產(chǎn)物有一定積累；已經(jīng)發(fā)生過某些變異?；蛲蛔兣c誘變育種243）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備a. 必要性： 單

8、細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑 避免出現(xiàn)不純的菌落菌種退化基因突變與誘變育種b. 制備： 物理誘變劑生理鹽水（0.85%NaCl) 化學(xué)誘變劑緩沖液 25 c. 方法： 三角瓶內(nèi)加0.5cm玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐溫80（表面活性劑） 用無菌脫脂棉過濾。d. 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個/ml 霉菌、酵母菌 106個/ml基因突變與誘變育種264)設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法初篩： 平板上做定性、半定量的測定，觀察突變株 的生理效應(yīng)范圍。方法：梯度平板法；（抗性菌株） 紙片法； （抗性菌株） 透明圈法；（淀粉酶產(chǎn)生菌株等） 變色圈法；（氨基酸生產(chǎn)菌株）基因突變與誘變育種27如：

9、用梯度平板法篩選抗性菌株基因突變與誘變育種28抗生素法直接篩選抗藥性突變體基因突變與誘變育種29 復(fù)篩： 較精確的生物化學(xué)分析方法 做搖瓶測定（見P250）基因突變與誘變育種30三、營養(yǎng)缺陷型的篩選三、營養(yǎng)缺陷型的篩選（一）概念：基因突變與誘變育種1. 三種遺傳型個體營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能 力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng) 有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。 如：lys - ; bio - ;野生型(wild type)：自然界分離到的任何微生物，在 其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為 該微生物的野生型。如：lys + ; bio + ; 原養(yǎng)型 (prot

10、otroph) ：指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組 后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。 312、篩選用的培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（minimal medium,MM）-：滿足野生 型菌株?duì)I養(yǎng)要求最低成分的組合。 完全培養(yǎng)基（complete medium,CM）+：滿足一 切auxo生長的天然或半組合培養(yǎng)基。 補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplemented medium,SM）x：在 MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成 分以滿足相應(yīng) auxo生長的組合培養(yǎng)基。 基因突變與誘變育種32（二）篩選方法auxo的鑒定 基因突變與誘變育種誘變處理auxo的濃縮auxo的檢出331. 1. 誘變處理（同前）誘變處理（同前

11、）auxoauxo的篩選程序：的篩選程序： 基因突變與誘變育種細(xì)菌培養(yǎng)離心洗滌誘變處理CM后培養(yǎng)洗滌MM加PN涂布于CM平板影印培養(yǎng)挑取鑒定菌種保存342. 2. auxoauxo的濃縮：的濃縮：基因突變與誘變育種1）抗生素法： 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細(xì)胞，對休止態(tài)細(xì)胞無作用。方法：菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中。352）菌絲過濾法：適用于絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過?；蛲蛔兣c誘變育種363）差別殺菌法： 基本培養(yǎng)基上只有野生型生長，加熱殺死野生型營養(yǎng)體，保留auxo芽孢。 細(xì)菌80 酵母60 適用

12、于產(chǎn)芽孢、孢子菌?；蛲蛔兣c誘變育種373.3. auxo auxo的檢出的檢出1）逐個檢出法基因突變與誘變育種382）影印平板培養(yǎng)法3）限量補(bǔ)充法 （在mm中加0.01%蛋白胨， auxo菌落小，野生型菌落大）基因突變與誘變育種393）夾層培養(yǎng)法404.4. auxo auxo的鑒定的鑒定基因突變與誘變育種1）生長譜法方法簡便；回變和污染不影響 結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末 或紙片41混合氨基酸法步驟：a. 將多種營養(yǎng)因子編組， 如： 一組：1 2 3 4 5 二組：2 6 7 8 9 三組：3 7 10 11 12 四組：4 8 11 14 五組：5 9 12 14 15基因突變與誘變育種2）混合

13、氨基酸（Vit）法1）每組內(nèi)無重復(fù)的營 養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出 現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng) 分別出現(xiàn)二次營養(yǎng)因子分組編排時注意：42基因突變與誘變育種b. 將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)c. 結(jié)果分析a. 將多種營養(yǎng)因子編組， 如： 一組：1 2 3 4 5 二組：2 6 7 8 9 三組：3 7 10 11 12 四組：4 8 11 14 五組：5 9 12 14 15435. 5. auxoauxo 的應(yīng)用的應(yīng)用1）作為標(biāo)記菌株：進(jìn)行基因工程、誘變育種、 代謝過程的研究中的親本標(biāo)記；2）作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；3）作為aa、維生素、堿基的測定菌株?；蛲蛔?/p>

14、與誘變育種44第二節(jié) 基因重組 本節(jié)內(nèi)容： 原核生物的基因重組 真核生物的基因重組45基因重組： 把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個體的方式?；蛑亟M分子水平的雜交一般雜交細(xì)胞水平基因重組46甲生長快、產(chǎn)量低乙生長慢、產(chǎn)量高基因重組基因重組如：生長快、產(chǎn)量高47一、原核生物的基因重組一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation)基因重組 受體菌(receptor)直接吸收來自供體菌(donor)的DNA片段，通過交換，將其整合到自己的基因組中，再經(jīng)復(fù)制就使自己變成一個轉(zhuǎn)化子(transformation)。 這種受體菌接受供體菌的D

15、NA片段而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。概念：481. 感受態(tài)基因重組 不同菌株的親緣關(guān)系 受體細(xì)胞是否處于感受態(tài)感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí) 現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時間不同。轉(zhuǎn)化的決定因素：492. 感受態(tài)因子一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為510kD基因重組其作用為：催化轉(zhuǎn)化，促進(jìn)外來DNA片段吸收可降解細(xì)胞表面某種成分，使DNA受體暴露 1）不同菌細(xì)胞DNA受體位點(diǎn)不同2）有的菌感受態(tài)因子只對同種菌起作用503. 轉(zhuǎn)化因子：轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是供體DNA片段一般為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；轉(zhuǎn)化的頻率往往很低，一般為0.11%。 據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（

16、雙鏈閉合環(huán)狀）的 轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高基因重組514. 轉(zhuǎn)化的檢出甲（受體） strr，lys-基因重組如出現(xiàn)strr，lys+的菌株，則表明已經(jīng)轉(zhuǎn)化乙（供體）strs，lys+在含str的MM上培養(yǎng)52轉(zhuǎn)化的全過程（以噬菌體為例）基因重組53（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction) 以噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子?；蛑亟M概念：54轉(zhuǎn)導(dǎo)以溫和噬菌體為媒介，其從宿主DNA上誘導(dǎo)裂解時可能有三種情況：1）包入的完全是噬菌體的DNA（噬菌體）2）包入的完全是細(xì)菌DNA（完全

17、缺陷噬菌體）3）部分帶有噬菌體基因的DNA（部分缺陷噬菌體）基因重組551. 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）1）完全轉(zhuǎn)導(dǎo)(complete transduction)： 由完全缺陷噬菌體將外源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，經(jīng)交換、整合、復(fù)制形成遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 此時受體細(xì)胞的特點(diǎn)：a. 不發(fā)生溶源化； b. 不顯示免疫性； c. 不會裂解產(chǎn)生正常噬菌體。2）流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive transduction)： 外源DNA片段不經(jīng)交換、整合、復(fù)制，僅轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和 性狀表達(dá)。 特點(diǎn)：子代只有一個細(xì)胞帶有重組子性狀?；蛑亟M 由完全缺陷噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。562.

18、 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)： 指通過部分缺陷噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象?；蛑亟M部分缺陷噬菌體：噬菌體帶有宿主gal基因dgal噬菌體噬菌體帶有宿主bio基因dbio噬菌體特點(diǎn)：a、無正常溶源化能力； b、受體細(xì)胞不具免疫性。57根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的高低，可分為：1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）： 部分缺陷噬菌體比例低，獲得局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子量極少。582）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）：雙重溶源菌：感染dgal噬菌體后，又感染正 常噬菌體，且同時整合在菌染色體上。 HFT裂解物：誘導(dǎo)裂解雙重溶源菌，裂解物 中含等量的兩種噬菌體，稱此裂解物為。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：用低感染復(fù)數(shù)的HFT裂解物感染 另一gal-受體菌時，

19、可高頻地將其轉(zhuǎn)化 為gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種方式稱3. 溶源轉(zhuǎn)換與轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別（自學(xué)）基因重組59（三）接合(conjugation) 供體與受體細(xì)胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA的過程。在受體細(xì)胞中發(fā)生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱接合子?；蛑亟M概念：60（四）原生質(zhì)體融合（protoplast fusion） 使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）的過程?；蛑亟M 已成功地應(yīng)用與植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、屬間、科間的遠(yuǎn)緣細(xì)胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細(xì)胞基因組。61過程：基因重組62二、真核微生物的

20、基因重組二、真核微生物的基因重組基因重組（一）有性雜交 一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。 凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。63（二）準(zhǔn)性雜交（parasexual hybridization） 同種異株的兩個體細(xì)胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻基因重組發(fā)生的一種繁殖方式。（單倍體體細(xì)胞重組）基因重組1. 準(zhǔn)性生殖2. 準(zhǔn)性生殖的意義： 對一些沒有有性過程但有重要生產(chǎn)價值的半知菌來說，進(jìn)行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準(zhǔn)性生殖提供了一個重要的手段。 發(fā)現(xiàn)存在構(gòu)巢曲菌、米曲菌、青霉等真

21、菌和放線菌中，使之有普遍意義。643. 過程1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis）;2）形成異核體（heterocaryon）; 細(xì)胞質(zhì)、核交流形成異核菌絲體。3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點(diǎn)：頻率低，10-510-7促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫4）體細(xì)胞交換和單倍體化基因重組65半知菌的準(zhǔn)性生殖示意圖基因重組66異核體的特點(diǎn)：1）具有感受性的兩種菌絲間才可形成異核體；2）具有野生型性狀，可在基本培養(yǎng)基上生長 ； （基因互補(bǔ)功能）3）大多數(shù)異核體的分生孢子不能在基本培養(yǎng)基 上生長；如能生長，則為異核體、或?yàn)殡s合 二倍體（重組子）?；蛑亟M異核體：同一菌絲有不同遺傳性狀的核在同一

22、 細(xì)胞質(zhì)中生長。同核體：同一菌絲中只有一種核。67體細(xì)胞交換和單倍體化 雜合體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子、雙倍體及非整倍體。ABA+B（同核體）（異核體）AABBABAABB（雜合二倍體）單倍體雜合子基因重組684. 檢出：1）若MM和CM上差別不大的，為穩(wěn)定 的雜合二倍體2）若MM上不長，CM上大量長，為不 穩(wěn)定異核體基因重組69第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯及保藏70一、菌種的衰退和復(fù)壯一、菌種的衰退和復(fù)壯1.衰退： 概念：菌種經(jīng)長期的人工培養(yǎng)或保藏，在 其自發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良 性狀變?nèi)趸蛳У?/p>

23、現(xiàn)象，稱為衰退。菌種的衰退、復(fù)壯及保藏現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生 能力下降；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。71衰退的原因： 有關(guān)基因負(fù)突變1）多次傳代造成負(fù)突變數(shù)量增加 如斜面保藏： 細(xì)菌：1個月 酵母菌：3個月 放線菌、霉菌、芽孢：半年2）培養(yǎng)條件；3）誘變時出現(xiàn)不純菌落。菌種的衰退、復(fù)壯及保藏722. 防止衰退的方法： 控制傳代次數(shù)； 選擇合適的培養(yǎng)條件； 采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代； 采用有效的菌種保藏方法。菌種的衰退、復(fù)壯及保藏733. 菌種的復(fù)壯：復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu) 良性狀的方法。復(fù)壯的方法：1）純種分離： 菌落純（劃線法、涂布法、傾注法） 菌株純（單細(xì)胞挑取法）2）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯；3）淘汰已衰退的個體。菌種的衰退、復(fù)壯及保藏74二、菌種保藏：二、菌種保藏：1. 目的：存活，不丟失，不污染防止優(yōu)良性狀喪失隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種2. 原理： 創(chuàng)造一定條件，盡可能降低微生物代謝活動強(qiáng)度，使之基本上處于休眠狀態(tài)。條件：1）挑選優(yōu)良純種的休眠體；2）創(chuàng)造適合長期休眠的環(huán)境條件（干燥、低溫、 缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑等）菌種的衰退、復(fù)壯及保藏753. 方法：1）暫時保藏法斜面保藏方法：斜面置4冰箱保