內(nèi)吞與內(nèi)膜系統(tǒng)

1、植物細胞植物細胞胞吞作用胞吞作用和和內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)膜系統(tǒng) 的熒光顯微觀察的熒光顯微觀察植物細胞的吞排作用植物細胞的吞排作用細胞伸長生長所需要的物質(zhì)分別在細胞伸長生長所需要的物質(zhì)分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(如蛋白質(zhì)、脂類如蛋白質(zhì)、脂類)和和高爾基體高爾基體(細胞壁的一些組分，如果膠、半纖維素細胞壁的一些組分，如果膠、半纖維素)合成，合成，運輸小泡運輸小泡胞吐作用分泌至胞外或質(zhì)膜上胞吐作用分泌至胞外或質(zhì)膜上，促進，促進新的細新的細胞膜胞膜和和細胞壁細胞壁的生長的生長n另一方面，在細胞擴展增長過程中一些另一方面，在細胞擴展增長過程中一些過剩的蛋白質(zhì)、多過剩的蛋白質(zhì)、多糖、細胞壁前體物質(zhì)糖、細胞壁前體物質(zhì)等細胞成

2、分，需要通過等細胞成分，需要通過胞吞作用胞吞作用重重新回到胞質(zhì)中使之得以新回到胞質(zhì)中使之得以及時回收，循環(huán)利用及時回收，循環(huán)利用， 即細胞的內(nèi)吞和外排兩個過程保持基本的相對平衡即細胞的內(nèi)吞和外排兩個過程保持基本的相對平衡n在整個膜泡吞排作用（在整個膜泡吞排作用（cytosis）中，必須有）中，必須有能量能量的保的保證。證。例如，例如，膜泡組裝形成過程中膜泡組裝形成過程中的小的小G蛋白，蛋白，運輸過程運輸過程中的中的細胞骨架及相應(yīng)的馬達蛋白，以及細胞骨架及相應(yīng)的馬達蛋白，以及膜融合過程膜融合過程中中Rab蛋白等蛋白等均發(fā)生均發(fā)生GTP或或ATP的水解反應(yīng)。的水解反應(yīng)。內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)膜系統(tǒng)(endom

3、embrane systems) 內(nèi)膜系統(tǒng)是指內(nèi)膜系統(tǒng)是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體高爾基體、囊泡囊泡、溶酶體溶酶體和和液液泡泡等細胞器。這些等細胞器。這些細胞器的膜是相互細胞器的膜是相互流動的流動的, 處于動態(tài)處于動態(tài)平衡平衡, 在功能上也在功能上也是相互協(xié)同的。是相互協(xié)同的。FM類染料類染料 nFM類染料是水溶性的苯乙烯類復(fù)合物，對細胞無毒性作用，類染料是水溶性的苯乙烯類復(fù)合物，對細胞無毒性作用，使用方便使用方便n常廣泛用于質(zhì)膜和囊泡等的各類研究常用的染料有常廣泛用于質(zhì)膜和囊泡等的各類研究常用的染料有FM1-43（Ex510/Em626）和）和FM4-64（Ex558/Em734）。）。nFM

4、類染料與類染料與質(zhì)膜質(zhì)膜及及內(nèi)膜細胞器內(nèi)膜細胞器特異結(jié)合后發(fā)出高強度的熒特異結(jié)合后發(fā)出高強度的熒光，需要借助光，需要借助胞吞作用胞吞作用才能進入細胞內(nèi)。才能進入細胞內(nèi)。nFM4-64在水相中沒有熒光在水相中沒有熒光，只有插入脂質(zhì)生物膜后才顯示，只有插入脂質(zhì)生物膜后才顯示較強的熒光，胞吞回收的囊泡因吞進細胞內(nèi)部而被熒光標記，較強的熒光，胞吞回收的囊泡因吞進細胞內(nèi)部而被熒光標記，利用這種熒光探針能夠?qū)毎陌踢^程進行有效標記。利用這種熒光探針能夠?qū)毎陌踢^程進行有效標記。FM類染料染色原理類染料染色原理一、材料、試劑一、材料、試劑1.材料：材料： 煙草懸浮細胞煙草懸浮細胞 2.試劑：試劑：

5、1）煙草懸浮細胞培養(yǎng)基）煙草懸浮細胞培養(yǎng)基 2）FM4-64 （膜染料）（膜染料） 3）疊氮化鈉）疊氮化鈉 4）山梨醇）山梨醇 5）ER Tracker-Blue/White (內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異染料內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異染料) 二、實驗步驟二、實驗步驟n取取3個共聚焦專用培養(yǎng)皿，分別編號、；個共聚焦專用培養(yǎng)皿，分別編號、；n往中加入往中加入198 L 含含BY2細胞培養(yǎng)液（細胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）移液器）和和2 L FM4-64；n往中加入往中加入178 L含含BY2細胞培養(yǎng)液（細胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）移液器）和和20 L山梨醇山梨醇；n往中加入往中加入194 L含含BY2細胞培養(yǎng)液（細胞培

6、養(yǎng)液（1000mL移液器）移液器）和和4 L NaN3；n置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式；置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式；n觀察完畢中的觀察完畢中的FM4-64后再往中加入后再往中加入4 L ER Blue/white；n往、中分布加入往、中分布加入2 L FM4-64，隨后先觀察中的熒，隨后先觀察中的熒光分布；光分布；n接著再觀察中的熒光分布模式；接著再觀察中的熒光分布模式；n最后再次觀察中最后再次觀察中FM4-64、ER-Blue/White雙染下的熒雙染下的熒光分布。光分布。內(nèi)膜系統(tǒng)及內(nèi)吞作用的熒光標記觀察內(nèi)膜系統(tǒng)及內(nèi)吞作用的熒光標記觀察 取取3個共聚焦專用培養(yǎng)皿，分別編號、；個共聚焦專

7、用培養(yǎng)皿，分別編號、； 往中加入往中加入178 L含含BY2細胞培養(yǎng)液（細胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）和移液器）和20 L山梨醇；山梨醇； 往中加入往中加入194 L含含BY2細胞培養(yǎng)液（細胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）和移液器）和4 L NaN3； 往中加入往中加入198 L 含含BY2細胞培養(yǎng)液（細胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）和移液器）和2 L FM4-64； 置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式；置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式； 觀察完畢中的觀察完畢中的FM4-64后再往中加入后再往中加入4 L ER Blue/white； 往、中分布加入往、中分布加入2 L FM4-64，隨后先觀察中的

8、熒光分布；，隨后先觀察中的熒光分布； 接著再觀察中的熒光分布模式；接著再觀察中的熒光分布模式； 最后再次觀察中最后再次觀察中FM4-64、ER-Blue/White雙染下的熒光分布。雙染下的熒光分布。三、結(jié)果與分析三、結(jié)果與分析正常正常BY2 的的FM4-64標記標記 FM4-64先標記于先標記于BY2外周，并隨著時間的延長外周，并隨著時間的延長逐漸進入細胞內(nèi)部。逐漸進入細胞內(nèi)部。疊氮化鈉疊氮化鈉處理的的處理的的BY2 的的FM4-64標記標記 疊氮化鈉能抑制疊氮化鈉能抑制BY2的的呼吸作用呼吸作用，進而抑制細胞的，進而抑制細胞的內(nèi)吞內(nèi)吞作用作用，導(dǎo)致，導(dǎo)致FM4-64不會進入不會進入BY2內(nèi)部，說明內(nèi)部，說明FM4-64是通過是通過內(nèi)吞作用內(nèi)吞作用而不是而不是擴散擴散進入進入BY2的。的。質(zhì)壁分離質(zhì)壁分離的的BY2 的的FM4-64標記標記 用山梨醇處理用山梨醇處理BY2 2-3分鐘，使分鐘，使BY2發(fā)生質(zhì)壁發(fā)生質(zhì)壁分離，證明分離，證明FM4-64是一種是一種膜膜染料。染料。 ER tracker-Blue/white和和FM4-64雙標記雙標記 細胞膜顯示紅色，而一部分細胞器顯示紫色（紅色細胞膜顯示紅色，而一部分細胞器顯示紫色（紅色藍色疊加）表明內(nèi)吞的藍色疊加）表明內(nèi)吞的FM染料部分進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。染料部分進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 實驗報告實驗報告1）