植物組織培養(yǎng)-外植體的選擇與建立

1、植物組織培養(yǎng)-外植體的選擇與建立根據(jù)細(xì)胞全能性學(xué)說，植物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有全部的遺傳信息，都能再生出一個(gè)新植株。但是，要使每個(gè)細(xì)胞的全能性都表現(xiàn)出來，在目前還是不易做到的事。因而，外植體（初始培養(yǎng)物）的選擇非常重要。1、基因型：、基因型：再生能力（1）、雙子葉單子葉；（2）、被子植物裸子植物；（3）、雙子葉植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）；苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae）再生力特強(qiáng)；郁金香（Tulip）再生力較弱。（4）、同一種植物中：活體（in vivo）再生力強(qiáng)者，離體（in

2、vitro）再生力也強(qiáng)。杜鵑花 Rhodoendron2、根據(jù)母株的年齡和生長(zhǎng)發(fā)育階段選擇：生長(zhǎng)開花童年期轉(zhuǎn)變年期成年期年年 齡齡階段發(fā)育階段發(fā)育2、根據(jù)母株的年齡和生長(zhǎng)發(fā)育階段選擇：植株的生長(zhǎng)與發(fā)育2、根據(jù)母株的年齡和生長(zhǎng)發(fā)育階段選擇：年齡或幼化程度外植體建立母株年齡和幼化程度與外植體建立階段發(fā)育外植體建立母株階段發(fā)育與外植體建立杜鵑花 van Weerden Poelman3、根據(jù)時(shí)間和季節(jié)取材生長(zhǎng)物質(zhì)含量時(shí)間或季節(jié)抑制物質(zhì)含量時(shí)間或季節(jié)3、根據(jù)時(shí)間和季節(jié)取材物質(zhì)含量時(shí)間或季節(jié)抑制物質(zhì)生長(zhǎng)物質(zhì)取材時(shí)間取材時(shí)間4、根據(jù)母株位置選擇：具原基結(jié)構(gòu)的外植體：莖尖、側(cè)芽、原球莖、鱗芽、分生組織不具原

3、基結(jié)構(gòu)的外植體：根、莖、葉、花、果等器官，需要脫分化。4、根據(jù)外植體的大小選擇：外植體大小外植體建立外植體大小與外植體建立4、污染（、污染（Infection）能否有效地控制微生物污染是植物離體培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。對(duì)于離體培養(yǎng)的探索性研究實(shí)驗(yàn)，污染會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；對(duì)于大規(guī)模的離體繁殖生產(chǎn)來說，污染使生產(chǎn)成本大大增加。因此，無論是科研機(jī)構(gòu)還是生產(chǎn)廠家都十分重視微生物污染問題。植物離體培養(yǎng)中的污染可分為外植體外植體、培養(yǎng)基、無菌操作培養(yǎng)基、無菌操作和培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境四個(gè)方面。其中培養(yǎng)基和無菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植體方面污染最復(fù)雜，也最難控制，其可能是細(xì)菌引起的，也可

4、能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可能是內(nèi)生性的。近年來，國(guó)外較重視各種微生物的鑒定，并根據(jù)不同的微生物種類采取相應(yīng)的控制措施，這方面的研究進(jìn)展較快。（1）、產(chǎn)生污染的因素：）、產(chǎn)生污染的因素：外植體外植體：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料帶菌多；老的材料比幼嫩的帶菌多；田間生長(zhǎng)的材料比溫室的帶菌多；帶泥土的材料比清潔的帶菌多。一年中以雨季的材料帶菌多，一天中以中午陽光最強(qiáng)時(shí)的材料帶菌少。培養(yǎng)基培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌的溫度、壓力、時(shí)間和正確使用情況，以及過濾滅菌中過濾膜孔徑、過濾滅菌器械的滅菌處理、過濾滅菌操作等均影響培養(yǎng)基的滅菌效果。操作環(huán)節(jié)操作環(huán)節(jié)：接種室是否清潔、干燥、密閉，

5、是否經(jīng)常用紫外線燈照射、甲醛熏蒸、70酒精噴霧殺菌等，操作是否等熟練。培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境：培養(yǎng)室要求清潔、密閉。每天用70酒精噴霧除菌、降塵，每周用少量甲醛熏蒸滅菌。如有空氣過濾裝置效果更好。培養(yǎng)室相對(duì)濕度太高時(shí)，污染加重。（2）、污染的防止）、污染的防止：母株保護(hù)母株保護(hù)：保持母株清潔，減少噴灌。溫室種植，噴施殺菌（蟲）劑，減少病原菌含量。材料選擇材料選擇：選取生長(zhǎng)發(fā)育健壯，病蟲危害少的材料。嚴(yán)格清洗嚴(yán)格清洗、消毒與無菌操作。小容器、分散接種小容器、分散接種。（3）、污染估算及對(duì)策：污染估算：首次接種通常污染率4060%按40%計(jì)：接種100個(gè)材料1個(gè)材料/容器：污染量=100X40%=40獲

6、得量=100-40=60。2個(gè)材料/容器：2污染：1X40%X40%=16%1污染：2X40%X40%=32%2未污染：60%X60%=36%污染率=100-36=62%污染量=100X62%=62獲得量=100-62=483 個(gè)材料/容器：污染率=100-（60%）3=78.4%污染量=100X78.4%=79獲得量= 100X（60%）3= 214 個(gè)材料/容器：獲得量= 100X（60%）4=135 個(gè)材料/容器：獲得量= 100X（60%）5=8防止污染的對(duì)策：小容器、多數(shù)量、盡量分散、相互隔離棄掉（4）、附生菌控制：）、附生菌控制：采用化學(xué)殺菌劑可以有效地殺死附生菌，但是一些較特殊的

7、外植體材料，如密披絨毛的葉片或幼果、花芽或帶苞片的葉芽，附生菌可能潛伏在外植體上，無法徹底清除。這時(shí)，必須采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。取材來源取材來源：從保護(hù)條件下生長(zhǎng)的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保護(hù)條件指溫室、培養(yǎng)箱、生長(zhǎng)室等。從溫室、培養(yǎng)箱里取材，可有效減少附生菌的群體數(shù)量。從栽培于溫室中的植株上取材和從露地取材相比，前者污染率更低。所取植株的生長(zhǎng)土壤，是組織培養(yǎng)中的一個(gè)重要污染源。如果采用溫室栽培，事先應(yīng)進(jìn)行土壤滅菌。此外，灌溉水也可能成為污染源。取材于用過濾水和用緘市飲用水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.材料預(yù)處理材料預(yù)處理：在對(duì)外植體進(jìn)行常規(guī)化學(xué)滅菌之前，

8、對(duì)特殊材料進(jìn)行特殊預(yù)處理，可以收到很好的效果。例如，在對(duì)密披絨毛的枇杷幼果進(jìn)行滅菌之前，先把絨毛刮去，滅菌效果很好。對(duì)于密披絨毛的葉片，可先連枝帶葉放在自來水下沖洗，去除污物后，用0.5Tween20浸1h（其間換新鮮液23次），然后進(jìn)行常規(guī)滅菌，就可起到徹底殺菌的作用。對(duì)蘭花花芽常規(guī)滅菌之前，先用10的殺藻銨（Benzalkonium Chloride）溶液浸漬材料10min，效果很好。（5）、內(nèi)源菌防治：）、內(nèi)源菌防治：植物組織培養(yǎng)中對(duì)材料只能進(jìn)行表面滅菌，而對(duì)材料組織內(nèi)部所帶的細(xì)菌往往難以對(duì)付。1.表面污染與內(nèi)源污染的區(qū)別：常見內(nèi)源菌常見內(nèi)源菌：芽孢桿菌（rod bacteria）為主，

9、尤其是Bacilus licheniformis 和B.subtilis （“white ghost”）。真菌中主要是鐮刀菌(Fusarium)、輪枝孢菌(Verticillium)、瓶霉菌(Phialophora)和絲核菌(Rhizoctonia)。 內(nèi)源菌的檢測(cè)內(nèi)源菌的檢測(cè)：通常情況下，通過觀察培養(yǎng)瓶就可看到一些污染的跡象；但是對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌或內(nèi)生菌來說，僅靠肉眼觀察是不夠的，必須通過指示培養(yǎng)，即采用微生物特別容易生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，讓外植體上的微生物快速生長(zhǎng)，然后予以鑒定培養(yǎng)基中加入蛋白胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)。防止方法：在培養(yǎng)基中加入抗生

10、素。利用莖尖培養(yǎng)。利用無菌材料?？股胤乐蝺?nèi)源菌： 外植體頂芽培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的污染、不同采收期外植體存在的污染和表面徹底消毒后的細(xì)菌污染都可能是內(nèi)生菌造成的。內(nèi)生菌的污染，無論用何種表面消毒方法都不能徹底消除，因此，必須使用抗生素進(jìn)行間接防治處理必須使用抗生素進(jìn)行間接防治處理。 選用適當(dāng)?shù)目股靥貏e重要。理想的抗生素應(yīng)該具備以下特性：可溶性、穩(wěn)定性、不受pH高低和培養(yǎng)基差異的影響、無邊界效應(yīng)、廣譜性、殺菌性、不產(chǎn)生抗性誘導(dǎo)、既廉價(jià)又對(duì)人體無害。常用如下抗生素：鏈霉素(10 mgL)、青霉素(20mgL)、地霉素(5mgL)、夾竹桃霉素(20mgL)、桿菌肽(50mgL)、新霉素(1mgL)。例如：用

11、奧復(fù)星（氧氟沙星注射液）4080 mgL、注射用的青霉素96192 mgL可有效抑制棗樹試管苗的細(xì)菌污染，而鏈霉素40800mgL和硫酸慶大霉素2060mgL抑制棗樹細(xì)菌效果不明顯。 單獨(dú)使用一種抗生素，通常效果很差，幾種抗生素的配合使用，可以起到協(xié)同增益作用，但有時(shí)也可能使個(gè)別藥物相互作用而失效。幾種高濃度殺菌劑配合使用很可能對(duì)植物有毒害。 對(duì)于某一特定細(xì)菌，確定抗生素的最低殺菌劑量是很重要的，這種最低劑量可以通過不同濃度的抗生素與細(xì)菌進(jìn)行液體共同培養(yǎng)來確定。若找到有效濃度，則在實(shí)驗(yàn)處理前就可確定對(duì)植物材料的毒性范圍。 抗生素對(duì)植物材料的毒性因植物類型不同差異很大，因此，用植物離體培養(yǎng)進(jìn)行基

12、本的測(cè)試是實(shí)驗(yàn)成功的重要一步。由于植物毒性影響或抗生素滲透性差，在處理污染實(shí)驗(yàn)中，抗生素對(duì)分離組織也可能失效。了解抗生素對(duì)細(xì)菌和植物二者的效應(yīng)，是消除污染和保護(hù)培養(yǎng)物的關(guān)鍵。 此外，抗生素常作為預(yù)防污染作用而加入到培養(yǎng)基中，或者在已鑒定出細(xì)菌污染的情況下，用于抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或消滅細(xì)菌?？股氐目咕饔迷谥行耘囵B(yǎng)基(pH6.57.5)中比常規(guī)狀態(tài)提高許多，而在酸性條件下則失效，而且抗生素具有熱敏感性，不能采用高溫高壓滅菌，只能采用過濾滅菌的方法加入培養(yǎng)基。（6）、特殊污染源：）、特殊污染源：污染中特別注意特別注意一種呈乳白色的細(xì)菌污染，這種細(xì)菌為芽孢桿菌。法國(guó)林木育種協(xié)會(huì)鑒定為遲緩芽孢桿菌(Bac

13、illuslenlus)，它外被莢膜，耐高溫，一般滅菌劑難以殺死。它可以隨培養(yǎng)材料、用具等傳播；它可出現(xiàn)在培養(yǎng)基表面，或呈滴形云霧狀存在于培養(yǎng)基內(nèi)。若出現(xiàn)應(yīng)及時(shí)淘汰污染源，并對(duì)所用過的器皿和用具進(jìn)行嚴(yán)格高溫滅菌處理。5、褐變（Browning）：（1）、概念：）、概念：外植體在培養(yǎng)容器中被氧化變褐而死亡的現(xiàn)象。（2）、外植體材料褐化原理：）、外植體材料褐化原理：植物組織的褐化是通過含銅的氧化酶含銅的氧化酶如多酚氧化酶和酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸和鄰位羥酚類化合物如綠原酸等。酶和底物在植物正常生長(zhǎng)的情況下是在組織內(nèi)的不同部位，當(dāng)細(xì)胞受傷或組織垂死時(shí)，酶和底物就跑到一起發(fā)生作用，

14、當(dāng)酚被氧化為活性酸化物和環(huán)形多聚體氧化蛋白時(shí)便形成深色化合物，這些物質(zhì)又很快被氧化和變成復(fù)雜的抑制性物質(zhì)，從而導(dǎo)致外植體材料變褐死亡并使培養(yǎng)基變褐 。（3）、褐化發(fā)生的可能因素：）、褐化發(fā)生的可能因素： 與組培植物品種有關(guān)：與組培植物品種有關(guān)：不同的植物種與品種之間常有很大差異，有人把此歸結(jié)為基因型的不同。一般來說，植物材料中單寧類和多種羥酚類化合物的含量高，易引起外植體材料的嚴(yán)重褐化。多數(shù)木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化 。 與取樣外植體年齡有關(guān)：與取樣外植體年齡有關(guān)：引起褐化程度的輕重常與取樣外植體組織的年齡有關(guān)，通常是幼齡部位產(chǎn)生褐化較輕，隨著組織的

15、老齡化而褐化加重。因此，在外植體接種時(shí)常需要?jiǎng)內(nèi)[片和大葉片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取頂芽分生組織（或帶少量葉原基）接種更為理想 。 與外植體取樣時(shí)間有關(guān)：與外植體取樣時(shí)間有關(guān)： 外植體材料的褐化程度常與外植體的取樣時(shí)間有關(guān)。一般在春夏季，尤其是春季采取生長(zhǎng)旺盛部位的外植體產(chǎn)生褐化較輕，已木栓化或木質(zhì)化的枝條和處于休眠狀態(tài)的休眠芽作為外植體時(shí)褐化嚴(yán)重 。與培養(yǎng)基有關(guān)：與培養(yǎng)基有關(guān)：接種外植體的培養(yǎng)基的狀態(tài)（固體，半固體或液體培養(yǎng)基）、無機(jī)鹽濃度和激素種類及濃度，以及培養(yǎng)基的pH值，都與外植體接種后產(chǎn)生的褐化程度有關(guān)。一般在液體培養(yǎng)基上加濾紙橋和半固體培養(yǎng)基上褐化程度比在固體培養(yǎng)基上輕。低鹽

16、培養(yǎng)基，尤其是Mn2+和Cu2+離 子濃度較低時(shí)，外植體的褐化程度比在高鹽培養(yǎng)基上輕。培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素（BA、KT），常常不僅能促進(jìn)酚類化合物的合成，而且還能刺激酚氧化酶的活性，因此，較高濃度的BA反而會(huì)加重外植體的褐化程度。培養(yǎng)基的pH值較低時(shí)常有利于減輕外植體的褐化 。 與溫度和光照有關(guān)：與溫度和光照有關(guān)：外植體接種后，開始培養(yǎng)的溫度和光照條件也常對(duì)外植體的褐化程度有一定的影響 。（4）、防止褐化產(chǎn)生的幾種途徑：）、防止褐化產(chǎn)生的幾種途徑：根據(jù)外植體產(chǎn)生褐化的原理和有關(guān)的影響因素，可以采取以下途徑來防止或減輕褐化，提高外植體接種的成功率。 移去法：移去法：流水沖洗材料流水沖洗材料：在外

17、植體材料表面消毒前用流水沖洗一段時(shí)間（數(shù)小時(shí)或過夜），然后進(jìn)行表面消毒和接種，接種后在短時(shí)間（一天后）內(nèi)多次轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上，直至褐化基本消失。多次轉(zhuǎn)移多次轉(zhuǎn)移：在外植體開始接種時(shí)用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間，并在短期內(nèi)更換幾次新鮮培養(yǎng)基，待褐化現(xiàn)象明顯減輕后再轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 。 吸附法：吸附法：用活性炭（AC）或聚乙烯毗咯烷酮（PVP）等吸收酚及其有害產(chǎn)物。通?？稍谂囵B(yǎng)基中附加23克升的活性炭，或520克升的PVP，或加倍Fe-EDTA(螯合鐵)的用量，均有減輕褐化傷害的效果 。 改變氧化一還原勢(shì)法：改變氧化一還原勢(shì)法：應(yīng)用還原劑可造成較低的氧化一還原勢(shì)，能有效地防止褐化的發(fā)生。常用

18、的還原劑有維生素C、檸檬酸、半胱氨酸鹽酸鹽、谷胱甘肽和巰基乙醇等。使用方法可以在外植體材料消毒前快速浸入上述抗氧化劑溶液中，也可以用抗氧化劑溶液浸濕濾紙，在濕潤(rùn)的濾紙上進(jìn)行外植體材料的切割，這樣傷口很快就可以接觸抗氧化劑而防止材料褐化 。 減少氧化機(jī)會(huì)減少氧化機(jī)會(huì)：創(chuàng)傷是外植物體脫分化和形成愈傷組織的一個(gè)條件。由于被溶解的氧會(huì)提高氧化還原勢(shì)，從而造成外植體傷口表面很快地氧化引起褐變。因此，應(yīng)盡可能地減少新鮮外植材料切割、接種操作過程中在空氣中暴露的時(shí)間，以便減輕外植體的褐變 。 抑制酚氧化酶的活性法抑制酚氧化酶的活性法：銅是酚氧化酶的功能性金屬離子，利用螯合劑螯合銅離子對(duì)減輕褐化也是有效的。譬

19、如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙基二硫代氨基甲酸脂和二甲基二硫代氨基甲酸脂等都是銅離子的螯合劑，同時(shí)這類螯合劑 也可能是抗氧化劑，可以用來抑制酚氧化酶的活性。一定的低溫（18以下），降低多酚氧化酶的活性或減少底物，均能降低酚類物質(zhì)的氧化速率，從而減輕材料的褐化 。 降低環(huán)境的降低環(huán)境的pH值法值法：多酚氧化酶的活性在pH值6.5時(shí)最大，隨著pH值的降低而活性下降。上述的維生素C和檸檬酸等不僅是還原劑，同時(shí)也能降低pH值，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕材料的褐化 。 熱激處理法熱激處理法：多酚氧化酶是一種不耐熱的酶，在45 50以上時(shí)活性迅速下降，在40以下保持較穩(wěn)定的活性。所以，如果外植體材料

20、采用4550高溫預(yù)處理45分鐘后進(jìn)行外植體接種，也可有效地抑制褐變 。暗培養(yǎng)法暗培養(yǎng)法：光線?？稍黾又参矬w內(nèi)酚的生物合成和加速傷口部位酚的氧化，故新接種的外值體可以先進(jìn)行暗培養(yǎng)714天后再逐步移入光照培養(yǎng) 。培養(yǎng)基的附加物法培養(yǎng)基的附加物法：一般來說，較高濃度的激動(dòng)素水平對(duì)莖尖的生長(zhǎng)和分化是需要的，但容易引起材料和培養(yǎng)基加深褐化。因此，可以在外植體接種開始的一周內(nèi)適當(dāng)降低激動(dòng)素水平來減輕材料和培養(yǎng)基的褐變。MS培養(yǎng)基中的高K含量也常容易引起褐化，可改用12的KNO3量。此外，碳水化合物也是酚化物生物合成所必需的，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的蔗糖濃度至1也常可以減輕褐化，有些植物可能在蔗糖培養(yǎng)基中褐化嚴(yán)重，而在葡萄糖或山梨糖培養(yǎng)基上褐化較輕 。6、培養(yǎng)反應(yīng)的觀察與統(tǒng)計(jì)：、培養(yǎng)反應(yīng)的觀察與統(tǒng)計(jì)：材料接種培養(yǎng)后要經(jīng)常進(jìn)行觀察和調(diào)查統(tǒng)計(jì)。并根據(jù)培養(yǎng)材料的反應(yīng)