動物細胞融合-----雞血細胞體外融合

1、動物細胞融合-雞血細胞體外融合設(shè)計人：趙麒麟 0910150434 黃 華 0910150423 張耀鐳 0910150441 鄧江岳 0910150436 黃小江 09101504402009級臨床4班細胞融合（cell fusion) 兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細胞融合。分為自發(fā)細胞融合和誘導(dǎo)細胞融合。 指用人工方法把不同類型的兩個或兩個以上細胞合并成一個細胞的技術(shù)。所得到的融合細胞叫雜交細胞。同核體：由同一親本細胞融合而來。 異核體：由不同親本細胞融合而來。物理法：顯微操作、激光誘導(dǎo)、電刺激?；瘜W(xué)法：鹽類融合劑、法。生物法

2、：仙臺病毒法。許多病毒具有凝集動物細胞并促使凝集的動物細胞發(fā)生融合的能力，當病毒位于兩個細胞之間時，病毒表面的神經(jīng)氨基酸講解細胞膜上的蛋白，促使細胞膜局部凝集在細胞周圍，在高和鈣離子的條件下，局部細胞膜發(fā)生融合。 可以認為是細胞在脈沖電場下，細胞相緊接的區(qū)域形成可逆電擊穿，即在外加電場下形成的細胞膜電孔，在一定條件下可以自行修復(fù)。 PEG是一種多聚化合物，分子（CH2CH2O）nH。PEG靠醚鍵的聯(lián)結(jié)使其分子末端帶有弱電荷，可溶于水。PEG帶有大量的負電荷，和原生質(zhì)體表面的負電荷在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體的粘著和結(jié)合，在高Ph高鈣離子的條件下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分

3、子洗脫，導(dǎo)致電荷失調(diào)而重新分配，使兩種原生質(zhì)體的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。1.雞血細胞儲備液的制備 取雞血，加入肝素（100U/5mL全血）制成抗凝全血。再加入4倍體積生理鹽水，制成紅細胞儲備液。2.雞血細胞的處理 取雞血細胞儲備液1mL，加入4mL生理鹽水，混勻后，800rpm離心56min，棄上清，用5mL生理鹽水重懸浮沉淀，重復(fù)離心操作1次。 3.雞血細胞懸液的制備 在離心后的雞血細胞沉淀中加入適量Hanks緩沖液，將細胞懸浮，鏡檢，在血細胞計數(shù)板上計數(shù)。適當?shù)募毎麧舛葢?yīng)控制在1107個/mL左右。根據(jù)計數(shù)情況調(diào)整懸液密度，于37保溫。4.PEG誘導(dǎo)細胞融合 吸取1

4、mL雞血懸液放在離心管中，逐滴加入37的50%PEG約0.5mL,邊加邊輕輕搖動試管，混勻后于37水浴靜置15min。5.終止PEG作用緩慢加入5mL Hanks緩沖液，輕輕吹打混勻，于37水浴中靜置10min制備細胞懸液6.制備細胞懸液 用吸管輕輕吹打細胞團數(shù)次使其分散，離心使細胞沉淀，用Hanks緩沖液重懸浮7.染色和鏡檢 吸取細胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，加入詹納斯綠染液混勻，染色3min后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細胞融合情況。 取雞血加入肝素（100U/5ml）加入4倍體積的生理鹽水儲備取儲備液1ml加入4ml生理鹽水混勻800r/min離心5min棄上清，取5ml生理鹽水重離心操作一次加入hanks液，控制密度在1*107個/ml,37度恒溫保存取1ml于離心管加50%PEG約0.5ml(邊加邊晃動)37度水浴靜置15min加入5mlhanks液，吹打均勻37度水浴10min 吸管吹打分散，離心沉淀用hanks緩沖液重懸浮制臨時裝片，用詹納斯綠染色3min鏡檢 1.溫度、融合時間、PEG的濃度與作用時間、細胞密度、機械力等因素均影響融合率，實驗