花旗松素和落婦新苷在Caco-2細胞單層中的轉(zhuǎn)運(2(、(3)

1、.說明：黑色部分均是內(nèi)容，藍色部分為解釋。1.轉(zhuǎn)運試驗前準備工作：取在Transwell板上培養(yǎng)21天的Caco-2細胞，選擇跨膜電阻(TEER)>400cm2 ,熒光黃的表觀滲透參數(shù)0.5×10-6cm/s的細胞單層進行藥物轉(zhuǎn)運實驗。Transwell板:一種細胞培養(yǎng)板，具微孔濾膜。實驗前細胞用預熱至37的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)漂洗2次，37預孵育30min,使細胞有充分時間適應轉(zhuǎn)運介質(zhì)，同時在不破壞其單層細胞膜的基礎上除去細胞表面的雜質(zhì).Hank's液（HBSS）是一種平衡鹽溶液，主要用于細胞培養(yǎng)取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。2.轉(zhuǎn)運實驗

2、：1) 在Transwell板的頂側(cè)（AP)加入0.5ml含不同濃度花旗松素或落新婦苷的HBSS，作為給藥室，同時在底側(cè)（BL）加入1.5ml空白HBSS，作為接受室，進行由頂側(cè)至底側(cè)方向的轉(zhuǎn)運。2) 當考察由底側(cè)至頂側(cè)方向的轉(zhuǎn)運時，需在BL側(cè)加入1.5ml含不同花旗松素或落新婦苷的HBSS，作為給藥室，同時在AP側(cè)加入0.5ml空白HBSS，作為接受室。Transwell板的頂側(cè)（AP) 和底側(cè)（BL）底側(cè)（BL）頂側(cè)（AP）(個人猜想轉(zhuǎn)運的動力可能是濃度差)將Transwell板置于37恒溫溫床中孵育，轉(zhuǎn)速50r/min,并分別于試驗開始后30、60、90、120及180min,從接受室中

3、吸取100L接收液，立即補充相同體積的空白HBSS。接收液中花旗松素與落新婦苷濃度以HPLC-UV法測定。3. 轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對花旗松素和落新婦苷在Caco-2細胞中轉(zhuǎn)運的影響：考察P-糖蛋白抑制劑維拉帕米、MRP2抑制劑MK-571對花旗松素和落新婦苷在Caco-2細胞中轉(zhuǎn)運的影響，用含100mol/L維拉帕米、50mol/LMK-571的HBSS替代上述實驗中的空白HBSS進行實驗。具體操作步驟：Ø 在Transwell板的頂側(cè)（AP)加入0.5ml含不同濃度花旗松素或落新婦苷的HBSS，作為給藥室，同時在底側(cè)（BL）加入1.5ml100mol/L維拉帕米或50mol/LMK-5

4、71的HBSS，作為接受室，進行由頂側(cè)至底側(cè)方向的轉(zhuǎn)運。Ø 當考察由底側(cè)至頂側(cè)方向的轉(zhuǎn)運時，需在BL側(cè)加入1.5ml含不同花旗松素或落新婦苷的HBSS，作為給藥室，同時在AP側(cè)加入0.5ml100mol/L維拉帕米或50mol/LMK-571的HBSS，作為接受室。將Transwell板置于37恒溫溫床中孵育，轉(zhuǎn)速50r/min,并分別于試驗開始后30、60、90、120及180min,從接受室中吸取100L接收液，立即補充相同體積的100mol/L維拉帕米或50mol/LMK-571的HBSS。接收液中花旗松素與落新婦苷濃度以HPLC-UV法測定。4. 溫度對花旗松素和落新婦苷在Caco-2細胞中轉(zhuǎn)運的影響 考察溫度對花旗松素和落新婦苷在Caco-2細胞中轉(zhuǎn)運的影響時，具體操作按“2.轉(zhuǎn)運實驗”所述步驟，不同之處在轉(zhuǎn)運實驗在4條件下進行。即取一帶蓋容器，裝入冰后蓋好蓋子，放入搖床中平衡，使容器中的溫度降至4左右，然后將用于轉(zhuǎn)運實驗的Transwell培養(yǎng)板放入裝有冰的容器中，連同容器一起放入搖床中進行轉(zhuǎn)運實驗，實驗中所用試劑均冰浴保存，備用。5.轉(zhuǎn)運液中花旗松素和落新婦苷的HPLC測定：1) 色譜分析條件：采用Waters Symmetry C18 柱（1500mmX4.6mm，5m)和C18保護柱，柱溫30；檢測波長291nm；流動相為甲醇-0.3%醋