第一章植物組織培養(yǎng)實驗室2

1、第三節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)基本操作植物組織培養(yǎng)基本操作 第一節(jié)第一節(jié) 培培養(yǎng)養(yǎng)基成分、種類及特點基成分、種類及特點 第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 第三節(jié)第三節(jié) 外植體無菌接種外植體無菌接種 第四節(jié)第四節(jié) 外植體培養(yǎng)外植體培養(yǎng) 第五節(jié)第五節(jié) 試管苗的馴化與移栽試管苗的馴化與移栽第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)基成分、種類及特點培養(yǎng)基成分、種類及特點植物生長必需植物生長必需1616種基本元素種基本元素：N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S、FeFe、MnMn、B B、CuCu、ZnZn、MoMo、ClCl、C C、H H、O O。離體培養(yǎng)條件下，各元素主要從培養(yǎng)基中獲得：離體培養(yǎng)條件下，

2、各元素主要從培養(yǎng)基中獲得：H H和和O O來源于水，來源于水，C C來源于添加的糖類，其它礦質(zhì)元來源于添加的糖類，其它礦質(zhì)元素來源于組成培養(yǎng)基的無機鹽。素來源于組成培養(yǎng)基的無機鹽。培養(yǎng)基是根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的培養(yǎng)基是根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制作的營養(yǎng)物質(zhì)。供植物生長的人工制作的營養(yǎng)物質(zhì)。一、培養(yǎng)基的成分一、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基一般包括培養(yǎng)基一般包括無機鹽、有機化合物和生長調(diào)無機鹽、有機化合物和生長調(diào)節(jié)劑節(jié)劑三大基本組成成分。三大基本組成成分。 1 1、無機鹽類、無機鹽類 功能功能: : 離體組織生長發(fā)育的基本成分離體組織生長發(fā)育的基本成分 根據(jù)植物對必需

3、元素需要的量，可以分為以下兩類：根據(jù)植物對必需元素需要的量，可以分為以下兩類： 大量元素大量元素植物所需元素的使用量一般在每升幾十植物所需元素的使用量一般在每升幾十- -幾千幾千毫克，有毫克，有C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S。 微量元素微量元素植物所需元素的濃度小于植物所需元素的濃度小于1010-5-51010-7-7mol/mol/L L，F(xiàn)eFe、CuCu、ZnZn、MnMn、MoMo、B B、ClCl。 除除C C、H H、O O外，其它礦質(zhì)元素通常以離子態(tài)吸收外，其它礦質(zhì)元素通常以離子態(tài)吸收 N- N-硝態(tài)氮和銨態(tài)氮硝態(tài)氮和銨態(tài)氮 2 2、有

4、機化合物、有機化合物 培養(yǎng)基中只有無機鹽叫做培養(yǎng)基中只有無機鹽叫做基本培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基，為使培養(yǎng)物更好的為使培養(yǎng)物更好的生長，還需添加有機成分，常用有生長，還需添加有機成分，常用有糖類、維生素、醇類、嘌呤、糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸等。氨基酸等。 糖類糖類 功能功能 離離體培養(yǎng)物生長與發(fā)育不可缺少的有機成分，即作為體培養(yǎng)物生長與發(fā)育不可缺少的有機成分，即作為碳源碳源，又維持培養(yǎng)基的，又維持培養(yǎng)基的滲透壓滲透壓在在1.5-4.11.5-4.1MPaMPa。 多使用蔗糖多使用蔗糖，試管苗生長與繁殖濃度，試管苗生長與繁殖濃度2-3%2-3%，幼胚培養(yǎng)，幼胚培養(yǎng)4-6%4-6%，某些特殊培養(yǎng)中

5、用某些特殊培養(yǎng)中用8-10%8-10%。 細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)還用細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)還用麥芽糖、葡萄糖、果糖麥芽糖、葡萄糖、果糖。 維生素類維生素類 功能功能 參與酶的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代謝，明顯的促進離參與酶的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代謝，明顯的促進離體培養(yǎng)物的生長。體培養(yǎng)物的生長。 鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素- -VB1VB1、鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇- -VB6VB6、煙酸煙酸- -VppVpp、生物素生物素- -VHVH、維生素維生素C-C-VcVc。 肌醇肌醇 功能功能 促進糖的轉(zhuǎn)化、維生素和激素的利用，對胚狀體和促進糖的轉(zhuǎn)化、維生素和激素的利用，對胚狀體和芽的形成有良好影響。芽的形成有良好影響。 用

6、量用量 一般一般50-10050-100mg/Lmg/L。 腺嘌呤腺嘌呤 合成各種合成各種細胞分裂素的前體物質(zhì)之一細胞分裂素的前體物質(zhì)之一，利于細胞分裂，利于細胞分裂，促進芽的形成和生長。促進芽的形成和生長。 氨基酸氨基酸 蛋白質(zhì)的成分，是蛋白質(zhì)的成分，是有機氮化合物有機氮化合物，常用，常用甘氨酸和多種氨甘氨酸和多種氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白?；峄旌衔锶缢饫业鞍?、水解乳蛋白。 其它復(fù)合成分其它復(fù)合成分 成分尚不清楚的成分尚不清楚的天然提取物天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麥芽糖等。取液、番茄汁、麥芽糖等。3 3、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

7、生長素類生長素類 功能功能 促進細胞脫分化和細胞伸長，促進細胞脫分化和細胞伸長，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生 生長素與細胞分裂素協(xié)調(diào)作用，在生長素與細胞分裂素協(xié)調(diào)作用，在離體培養(yǎng)中，生長素促進根的形成，離體培養(yǎng)中，生長素促進根的形成，抑制芽的形成。抑制芽的形成。 液體培養(yǎng)中利于體細胞胚胎發(fā)生。液體培養(yǎng)中利于體細胞胚胎發(fā)生。 常用常用IAAIAA、IBAIBA、NAANAA、2,4-D2,4-D。IBAIBA促進生根促進生根細胞分裂素的生理效應(yīng)細胞分裂素的生理效應(yīng)細胞分裂素類細胞分裂素類 功能功能 促進細胞分裂和擴大，促進細胞分裂和擴大，調(diào)節(jié)器官分化，延緩組織衰老，調(diào)節(jié)器官分化，延緩組織衰老

8、，增強蛋白質(zhì)合成。離體培養(yǎng)中，增強蛋白質(zhì)合成。離體培養(yǎng)中，促進不定芽的發(fā)生，與生長素促進不定芽的發(fā)生，與生長素協(xié)調(diào)作用可有效控制培養(yǎng)物的協(xié)調(diào)作用可有效控制培養(yǎng)物的生長與分化。生長與分化。 常用常用6-6-BABA、ZTZT、KTKT、2iP2iP。 植株的形態(tài)建成是植株的形態(tài)建成是CTKCTK和和IAAIAA的比值調(diào)控的的比值調(diào)控的 CTK/IAA CTK/IAA高，誘導(dǎo)愈傷組織形成芽高，誘導(dǎo)愈傷組織形成芽 CTK/IAA CTK/IAA低，誘導(dǎo)愈傷組織形成根低，誘導(dǎo)愈傷組織形成根煙草煙草在不在不同細同細胞分胞分裂素裂素與生與生長素長素濃度濃度下的下的生理生理效應(yīng)效應(yīng)赤霉素類赤霉素類 功能功能

9、 促進細胞伸長生長、誘導(dǎo)花芽形成、打破種子促進細胞伸長生長、誘導(dǎo)花芽形成、打破種子休眠以及誘導(dǎo)單性結(jié)實等。休眠以及誘導(dǎo)單性結(jié)實等。 與生長素協(xié)調(diào)作用對形成層分化有影響，刺激體細胞與生長素協(xié)調(diào)作用對形成層分化有影響，刺激體細胞胚進一步發(fā)育成植株。胚進一步發(fā)育成植株。 有有2020多種，目前主要是多種，目前主要是赤霉酸赤霉酸GAGA3 3。4 4、水、水 離體培養(yǎng)中，既是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的溶劑，又離體培養(yǎng)中，既是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的溶劑，又是培養(yǎng)基的重要組成部分，占培養(yǎng)基成分的是培養(yǎng)基的重要組成部分，占培養(yǎng)基成分的95%95%。 原生質(zhì)體培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般原生質(zhì)體培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分生組織培

10、養(yǎng)一般應(yīng)用雙蒸水或超純水應(yīng)用雙蒸水或超純水 大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用一般蒸餾水或純凈一般蒸餾水或純凈水。水。 5 5、其它附加成分、其它附加成分 瓊脂瓊脂 功能功能 來自海藻的多糖類物質(zhì)，組織培養(yǎng)中來自海藻的多糖類物質(zhì)，組織培養(yǎng)中最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支持物。持物。 常用量常用量0.6%-1.0%0.6%-1.0%，不是培養(yǎng)基必需成分。，不是培養(yǎng)基必需成分。 卡拉膠卡拉膠 海藻提取物，含雜質(zhì)少純度更高，海藻提取物，含雜質(zhì)少純度更高，凝固后培養(yǎng)基透明，利于材料觀察。凝固后培養(yǎng)基透明，利于材料觀察。 活性炭活性炭

11、功能功能 常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)（酚類物以吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)（酚類物質(zhì)），有利于培養(yǎng)物的生長。質(zhì)），有利于培養(yǎng)物的生長。常用濃度常用濃度1 15mg/L5mg/L左右左右 其吸附作用選擇性較差，使用應(yīng)慎重。常受其吸附作用選擇性較差，使用應(yīng)慎重。常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低甚至解吸附。甚至解吸附?？股乜股?培養(yǎng)基中添加抗生素可防止菌類污染，常用培養(yǎng)基中添加抗生素可防止菌類污染，常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等的抗生素有青霉素、鏈霉素、慶

12、大霉素等，用，用量一般為量一般為5 520mg/L20mg/L。大部分抗生素需要大部分抗生素需要過濾過濾除除菌。菌。抗氧化物抗氧化物 抗酚類氧化常用的藥劑有抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸、聚乙烯半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（吡咯烷酮（PVPPVP）及抗壞血酸（）及抗壞血酸（VcVc），），可用可用5050200mg200mgL L的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過濾除菌后加入固體培養(yǎng)基的表層?；蜻^濾除菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點（一）培養(yǎng)基種類（一）培養(yǎng)基種類1 1、根據(jù)態(tài)相分：、根據(jù)態(tài)相分： 固體

13、培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基- -加凝固劑的培養(yǎng)基加凝固劑的培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基- -不加凝固劑的培養(yǎng)基。不加凝固劑的培養(yǎng)基。2 2、根據(jù)培養(yǎng)過程分：、根據(jù)培養(yǎng)過程分： 初代培養(yǎng)基初代培養(yǎng)基- -初次接種外植體的培養(yǎng)基。初次接種外植體的培養(yǎng)基。 繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基- -接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。3 3、根據(jù)作用分：、根據(jù)作用分： 誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基- -誘導(dǎo)外植體啟動生長誘導(dǎo)外植體啟動生長 增殖增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)基- -誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗擴大繁殖。誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗擴大繁殖。 生根生根培養(yǎng)基培養(yǎng)基- -誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗生根誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗生根4 4、根據(jù)營養(yǎng)水平分：、根據(jù)

14、營養(yǎng)水平分： 基本基本培養(yǎng)基培養(yǎng)基- -包含無機鹽等基本營包含無機鹽等基本營養(yǎng)成養(yǎng)成分。分。 完全完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基- -包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。（二）幾種常用培養(yǎng)基（二）幾種常用培養(yǎng)基細胞工程常用的基本培養(yǎng)基有：細胞工程常用的基本培養(yǎng)基有：MSMS、MTMT、WhiteWhite、NitschNitsch、 BlaydesBlaydes、N N6 6、B B5 5、NTNT、SHSH、MillerMiller、HellerHeller等。等。（三）幾種常見培養(yǎng)基的特點（三）幾種常見培養(yǎng)基的特點1 1、富鹽平衡培養(yǎng)基、富鹽平衡培養(yǎng)基 無機鹽濃度高，元素比例適當，離

15、子平衡好，無機鹽濃度高，元素比例適當，離子平衡好，具有較強的緩沖性，培養(yǎng)中維持較好的穩(wěn)定性，含具有較強的緩沖性，培養(yǎng)中維持較好的穩(wěn)定性，含高量氮、鉀，營養(yǎng)豐富，元素種類齊全，高量氮、鉀，營養(yǎng)豐富，元素種類齊全，MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基使用最廣泛。使用最廣泛。2 2、低鹽培養(yǎng)基、低鹽培養(yǎng)基 無機鹽濃度低，有機成分含量低，多數(shù)作為生無機鹽濃度低，有機成分含量低，多數(shù)作為生根培養(yǎng)基、胚胎培養(yǎng)使用，根培養(yǎng)基、胚胎培養(yǎng)使用，常用常用WhiteWhite培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。3 3、高硝態(tài)鹽培養(yǎng)基、高硝態(tài)鹽培養(yǎng)基 較低銨鹽，高硝酸鹽和鹽酸硫胺素較低銨鹽，高硝酸鹽和鹽酸硫胺素B5B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基適適合雙子葉植物特別是

16、木本植物的生長。合雙子葉植物特別是木本植物的生長。 N N6 6培養(yǎng)基為水稻等禾谷類花藥培養(yǎng)設(shè)計，培養(yǎng)基為水稻等禾谷類花藥培養(yǎng)設(shè)計，KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量高含量高, ,不含鉬。不含鉬。 SH SH培養(yǎng)基培養(yǎng)基 ( (NHNH4 4)H)H2 2POPO4 4代替（代替（NHNH4 4）2 2SOSO4 4, ,礦質(zhì)濃礦質(zhì)濃度較高，多數(shù)單子葉和雙子葉植物上使用較好。度較高，多數(shù)單子葉和雙子葉植物上使用較好。 4 4、中鹽培養(yǎng)基、中鹽培養(yǎng)基 大量元素無機鹽為大量元素無機鹽為MSMS的的1/21/2，微量元素種類，微量元素種類減少含量增高，無肌醇維生素種類

17、多，增加生減少含量增高，無肌醇維生素種類多，增加生物素、葉酸，有物素、葉酸，有H H、HitschHitsch、MillerMiller、BlaydesBlaydes等培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，適用于特殊細胞培養(yǎng)。，適用于特殊細胞培養(yǎng)。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 制作一升培養(yǎng)基所需藥品制作一升培養(yǎng)基所需藥品2020多種，為節(jié)省時間和多種，為節(jié)省時間和配制的準確，需將各種藥品濃縮成一定倍數(shù)，并且配制的準確，需將各種藥品濃縮成一定倍數(shù)，并且混合成一定母液，進行保存。制作培養(yǎng)基時根據(jù)需混合成一定母液，進行保存。制作培養(yǎng)基時根據(jù)需求制培養(yǎng)基數(shù)量取用母液。求制培養(yǎng)基數(shù)量取用母液。一、培養(yǎng)基母液的配制一

18、、培養(yǎng)基母液的配制 （一）營養(yǎng)成分的配制（一）營養(yǎng)成分的配制 根據(jù)藥品性質(zhì)將母液配制成以下四類：根據(jù)藥品性質(zhì)將母液配制成以下四類：1 1、大量元素、大量元素 可以混在一起配制成可以混在一起配制成10102020倍液，硫酸鎂和氯倍液，硫酸鎂和氯化鈣化鈣CaCa+ +和和MgMg2+2+會與磷酸鹽混合，產(chǎn)生不溶性沉淀，會與磷酸鹽混合，產(chǎn)生不溶性沉淀，要分別單獨配制要分別單獨配制,Ca,Ca+ +與與POPO4-4-一起混合易沉淀，定一起混合易沉淀，定容后消失。容后消失。2 2、微量元素、微量元素可配成可配成100100200200倍混合母液，倍混合母液，KIKI可單獨配?？蓡为毰?。3 3、鐵鹽、鐵

19、鹽硫酸亞鐵和硫酸亞鐵和EDTAEDTA鈉鹽易沉淀，需單獨配制，配成鈉鹽易沉淀，需單獨配制，配成100100200200倍鰲合劑不易沉淀。倍鰲合劑不易沉淀。4 4、有機化合物、有機化合物維生素、肌醇、氨基酸等一起配成維生素、肌醇、氨基酸等一起配成100100或或200200倍液，倍液，也可分別配制。也可分別配制。（二）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配制（二）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配制 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)分別配成母液儲于冰箱，濃度一般植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)分別配成母液儲于冰箱，濃度一般為為0.50.51 1mg/mlmg/ml。1 1、IAAIAA、NAANAA：先用少量先用少量95%95%酒精使之充分溶解。酒精使之充分

20、溶解。 2 2、2,42,4D D：可用少量可用少量0.10.1mol/Lmol/L的的NaOHNaOH溶液充分溶解，再緩緩加蒸餾水溶液充分溶解，再緩緩加蒸餾水定容至需要的體積。定容至需要的體積。 3 3、KTKT和和BABA等細胞分裂素類：等細胞分裂素類： 先用少量先用少量0.10.1mol/L mol/L 的的HClHCl溶解，再用蒸餾水定容至需溶解，再用蒸餾水定容至需要的體積。要的體積。（三）（三）藥品用量藥品用量的計算：的計算： 配制母液時藥品用量配制母液時藥品用量( (mg)=mg)=配方用量配方用量( (mg)mg)濃濃縮倍數(shù)制備容量（縮倍數(shù)制備容量（L L） 二、培養(yǎng)基的制作二、

21、培養(yǎng)基的制作（一）母液取用量的計算（一）母液取用量的計算 制 備 培 養(yǎng) 基 時 母 液 取 用 量 （制 備 培 養(yǎng) 基 時 母 液 取 用 量 （ m lm l ）=1000=1000濃縮倍數(shù)制備培養(yǎng)基數(shù)量（濃縮倍數(shù)制備培養(yǎng)基數(shù)量（L L）（二）培養(yǎng)基制作程序（二）培養(yǎng)基制作程序 1 1、按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分、按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分順序?qū)㈨樞驅(qū)⒛敢耗敢喝〕?，混合。取出，混合?2 2、適量蒸餾水放入加熱容器，蒸餾水應(yīng)少于、適量蒸餾水放入加熱容器，蒸餾水應(yīng)少于所制培養(yǎng)基數(shù)量，約終體積的所制培養(yǎng)基數(shù)量，約終體積的2/3-3/42/3-3/4，接通電源，接通電源加熱

22、。加熱。 3 3、向加熱容器中加入稱量好的、向加熱容器中加入稱量好的瓊脂瓊脂（0.6-0.6-0.8%0.8%），攪拌加熱，至完全溶化。），攪拌加熱，至完全溶化。4 4、瓊脂熬化后，稱取相應(yīng)量的、瓊脂熬化后，稱取相應(yīng)量的蔗糖蔗糖（2-3%2-3%），加入加熱容器中至溶解。，加入加熱容器中至溶解。5 5、將母液混合液加入到加熱容器中，攪拌混、將母液混合液加入到加熱容器中，攪拌混勻。勻。6 6、蒸餾水、蒸餾水定容定容至所需體積。至所需體積。7 7、測試培養(yǎng)基溶液的、測試培養(yǎng)基溶液的PHPH值值(5.8-6.0)(5.8-6.0)，過高滴，過高滴加加0.10.1mol/Lmol/L的的HCLHCL調(diào)

23、整，過低滴加調(diào)整，過低滴加0.10.1mol/Lmol/L的的NaOHNaOH調(diào)整。調(diào)整。8 8、迅速、迅速分裝分裝到培養(yǎng)瓶中，備用到培養(yǎng)瓶中，備用。 培養(yǎng)基制作程序圖培養(yǎng)基制作程序圖 培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)物賴以生存和生長的人工環(huán)培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)物賴以生存和生長的人工環(huán)境的重要組成部分，常用的培養(yǎng)基依據(jù)其物理狀態(tài)境的重要組成部分，常用的培養(yǎng)基依據(jù)其物理狀態(tài)的不同分為固態(tài)培養(yǎng)基和液態(tài)培養(yǎng)基。的不同分為固態(tài)培養(yǎng)基和液態(tài)培養(yǎng)基。 固態(tài)培養(yǎng)基一般使用瓊脂為凝固劑，也有使用固態(tài)培養(yǎng)基一般使用瓊脂為凝固劑，也有使用卡拉膠或魔芋粉為凝固劑的?？ɡz或魔芋粉為凝固劑的。 液態(tài)培養(yǎng)基不使用凝固劑，但需要在容器中置液

24、態(tài)培養(yǎng)基不使用凝固劑，但需要在容器中置入適當?shù)闹挝?，試管為培養(yǎng)容器的支撐物可用濾入適當?shù)闹挝?，試管為培養(yǎng)容器的支撐物可用濾紙橋，底面積較大的培養(yǎng)容器，支撐物可選用脫脂紙橋，底面積較大的培養(yǎng)容器，支撐物可選用脫脂棉等。棉等。固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基三、培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌三、培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌 制備好的培養(yǎng)基如果帶菌，會導(dǎo)致植物離體制備好的培養(yǎng)基如果帶菌，會導(dǎo)致植物離體培養(yǎng)失敗，因而還要對培養(yǎng)基進行滅菌處理。培養(yǎng)失敗，因而還要對培養(yǎng)基進行滅菌處理。（一）高壓蒸汽滅菌（一）高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基的滅菌一般采用濕熱滅菌法：培養(yǎng)基的滅菌一般采用濕熱滅菌法： 1 1、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。、

25、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。 2 2、滅菌鍋加水至淹沒電熱絲。、滅菌鍋加水至淹沒電熱絲。3 3、封閉高壓滅菌鍋各出氣口。、封閉高壓滅菌鍋各出氣口。4 4、接通電源、接通電源加壓加壓至至4949kPakPa（0.05MPa0.05MPa）5 5、打開排氣閥，打開排氣閥，排冷氣排冷氣至壓力至壓力0 0 kPakPa。6 6、繼續(xù)加壓至繼續(xù)加壓至108108kPakPa（0.11mPa-0.12Mpa0.11mPa-0.12Mpa，即即121121）7 7、壓力至、壓力至108108kPakPa（0.11mPa-0.12Mpa0.11mPa-0.12Mpa，即即121121）時）時，穩(wěn)壓穩(wěn)壓在此

26、壓力在此壓力15-2015-20minmin。8 8、關(guān)閉電源自然冷卻至壓力為關(guān)閉電源自然冷卻至壓力為0 0 kPakPa。9 9、取出培養(yǎng)基和器械冷卻，貯存于取出培養(yǎng)基和器械冷卻，貯存于3030以下室內(nèi)。以下室內(nèi)。 （二）干熱滅菌（二）干熱滅菌 培養(yǎng)瓶、三角瓶、試管等玻璃器皿及接種培養(yǎng)瓶、三角瓶、試管等玻璃器皿及接種器械，可以進行干熱滅菌。器械，可以進行干熱滅菌。 即將洗滌干凈的玻璃器皿放到即將洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中，在烘箱中，在150150溫度下，干熱滅菌溫度下，干熱滅菌1 1小時，或小時，或120120下滅菌下滅菌2 2小時。小時。 滅菌完畢冷卻后取出器械貯存。滅菌完畢冷卻后取出器

27、械貯存。 貯存室要保持無菌、干燥、以免造成培養(yǎng)基的貯存室要保持無菌、干燥、以免造成培養(yǎng)基的二次污染。二次污染。 滅菌后的培養(yǎng)基一般應(yīng)在滅菌后的培養(yǎng)基一般應(yīng)在2 2周內(nèi)周內(nèi)使用，時間使用，時間過長易造成潛在的污染。過長易造成潛在的污染。 培養(yǎng)基滅菌后如果出現(xiàn)過多沉淀或瓊脂不凝培養(yǎng)基滅菌后如果出現(xiàn)過多沉淀或瓊脂不凝固等現(xiàn)象，該培養(yǎng)基不能繼續(xù)使用，應(yīng)查明原因固等現(xiàn)象，該培養(yǎng)基不能繼續(xù)使用，應(yīng)查明原因重新配制。重新配制。 第第四四節(jié)節(jié) 外植體無菌接種外植體無菌接種 一般來說，無論何種類型的細胞工程技一般來說，無論何種類型的細胞工程技術(shù)，起始階段均涉及外植體取材、滅菌、術(shù)，起始階段均涉及外植體取材、滅菌

28、、接種與培養(yǎng)等基本過程。接種與培養(yǎng)等基本過程。一、植物材料的培養(yǎng)與取材一、植物材料的培養(yǎng)與取材 外植體外植體是指用于離體培養(yǎng)的活的植物是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料，是植物離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)組織、器官等材料，是植物離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)材料。材料。 1 1、外植體的來源、外植體的來源 - -生長在自然環(huán)境下的植物生長在自然環(huán)境下的植物 - -有目的地培育在溫室控制條件下生長的植物有目的地培育在溫室控制條件下生長的植物 - -無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物 自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，甚至與某些微生物具有寄生關(guān)系，使植

29、株具有甚至與某些微生物具有寄生關(guān)系，使植株具有內(nèi)生菌內(nèi)生菌。取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過程中會有微生物滋取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過程中會有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。生，從而影響培養(yǎng)效果。 自然環(huán)境生長植株自然環(huán)境生長植株溫室控制條件下生長植株溫室控制條件下生長植株已已離體培養(yǎng)植株離體培養(yǎng)植株 多數(shù)情況下，應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候多數(shù)情況下，應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時，生少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時，生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料間的長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料

30、間的一致性，提高實驗的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)一致性，提高實驗的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。技術(shù)的規(guī)范。 某些多年生植物或特殊材料，必須取自某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對中的植物。對于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點部位作為起始應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點部位作為起始培養(yǎng)的材料。培養(yǎng)的材料。 2 2、供體植株的管理、供體植株的管理 取自室外的外植體材料，供體植株的管取自室外的外植體材料，

31、供體植株的管理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時的污染率密理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時的污染率密切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意：切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意：避免昆蟲危害避免昆蟲危害 許多昆蟲如蚜蟲、螨類許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會引和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會引起植物組織的潛在感染。起植物組織的潛在感染。注意防病注意防病 尤其是真菌和細菌病害的侵尤其是真菌和細菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠遠高于來自健康植株的外植體，污染率遠遠高于來自健康植株的外植體，必要時需使用化學藥劑防治病害。必要時需使用化學藥劑防治病害。控制

32、濕度控制濕度 給供體植株澆水時應(yīng)從根部給供體植株澆水時應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。濕度；取材前盡可能保持植株干爽。1 1、材料取材、材料取材 材料選擇材料選擇 培養(yǎng)材料應(yīng)選擇有代表性的主要植培養(yǎng)材料應(yīng)選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。型。 快速繁殖時應(yīng)在植株生長的快速繁殖時應(yīng)在植株生長的最適時最適時期期取材，取材，花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期取材。期取材。

33、選取材料的大小一般在選取材料的大小一般在0.5-1.00.5-1.0cmcm之間之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.50.5cmcm以下。材料太大以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。易污染，材料太小難于成活。 采收采收 從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細菌較少代性狀較穩(wěn)定，攜帶細菌較少。 二、預(yù)處理與表面滅菌二、預(yù)處理與表面滅菌 1 1、預(yù)處理、預(yù)處理 先對植物材料進行修剪整理，去掉不需先對植物材料進行修剪整理，去掉不需要部分，將準備使用的植物材料（外植體）

34、要部分，將準備使用的植物材料（外植體）在在流水中沖洗流水中沖洗20-6020-60分鐘分鐘，備用。如特別不，備用。如特別不潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗10-1510-15分鐘，再用流水沖洗干凈。分鐘，再用流水沖洗干凈。 2 2、表面滅菌、表面滅菌（1 1）操作人員穿戴滅菌過的工作服、口）操作人員穿戴滅菌過的工作服、口罩。進入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈罩。進入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用，操作前再用70%70%酒精或消毒劑擦洗雙手。酒精或消毒劑擦洗雙手。（2 2）操作期間雙手和臺面常用）操作期間雙手和臺面常用70%70%酒精或酒精或消毒劑

35、擦拭。超凈工作臺使用前必須用紫消毒劑擦拭。超凈工作臺使用前必須用紫外燈照射殺菌，然后開啟風機。外燈照射殺菌，然后開啟風機。 （3 3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入可放入70-75%70-75%酒精中，使用時需火焰灼燒滅酒精中，使用時需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。菌，冷卻后使用。 （4 4）外植體放入超凈工作臺內(nèi)，置）外植體放入超凈工作臺內(nèi)，置70-70-75%75%酒精中酒精中5-60 5-60 秒，秒，0.10.1氯化汞氯化汞6-106-10分鐘，分鐘，或或10%10%的漂白粉上清液中的漂白粉上清液中10-1510-15分鐘，然后用分鐘，然后用無菌水沖

36、洗無菌水沖洗3-53-5次。滅菌時需進行攪動。次。滅菌時需進行攪動。 表面滅菌劑種類較多，可選取表面滅菌劑種類較多，可選取1-21-2種使用。種使用。 常用滅菌劑使用濃度及效果比較表常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑滅菌劑 使用濃度使用濃度 持續(xù)時間持續(xù)時間 去除的難易去除的難易 效果效果次氯酸鈣次氯酸鈣 9-10 9-10 5-30 5-30分鐘分鐘 易易 很好很好次氯酸鈉次氯酸鈉 2 2 5-30 5-30分鐘分鐘 易易 很好很好氯化汞氯化汞 0.1-1 0.1-1 5-10 5-10分鐘分鐘 較難較難 最好最好抗菌素抗菌素 4-50 4-50mgmgL 30-60L 30-60分鐘分鐘

37、 中中 較好較好酒精酒精 70-75% 0.2-2 70-75% 0.2-2分鐘分鐘 易易 好好過氧化氫過氧化氫 10-12% 5-15 10-12% 5-15分鐘分鐘 最易最易 好好三、外植體的接種三、外植體的接種無菌接種無菌接種 外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞、轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。胞、轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個過程均需無菌操作。整個過程均需無菌操作。（1 1）借助接種用工具將材料切割分離。）借助接種用工具將材料切割分離。（2 2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內(nèi)，火焰灼

38、燒培）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內(nèi)，火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，避免灰塵落入平中。避免灰塵落入平中。（3 3）迅速將切割分離下的所需組織、細胞、器）迅速將切割分離下的所需組織、細胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。（4 4）工具用后應(yīng)及時滅菌，避免交叉污染。）工具用后應(yīng)及時滅菌，避免交叉污染。（5 5）工作人員操作時禁止不必要的談話。）工作人員操作時禁止不必要的談話。 第五節(jié)第五節(jié) 外植體的培養(yǎng)外植體的培養(yǎng) 接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離體培養(yǎng)和栽培

39、植物一樣，生長過程中也受到各種體培養(yǎng)和栽培植物一樣，生長過程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎(chǔ)上，影響試管的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎(chǔ)上，影響試管苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。一、外植體的培養(yǎng)條件一、外植體的培養(yǎng)條件1 1、光照、光照 光照對植物生長發(fā)育有重要作用，是離體培養(yǎng)光照對植物生長發(fā)育有重要作用，是離體培養(yǎng)中非常重要的環(huán)境因素。光照強度、光質(zhì)以及光照中非常重要的環(huán)境因素。光照強度、光質(zhì)以及光照時間，對細胞的增殖、器官的分化都有很大影響。時間

40、，對細胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強度度1000-50001000-5000LxLx，根據(jù)不同植物或器官需要，可以根據(jù)不同植物或器官需要，可以每天連續(xù)光照每天連續(xù)光照12-1612-16小時，也可每天光照小時，也可每天光照1616小時，小時，8 8小時黑暗。小時黑暗。2 2、溫度、溫度 離體培養(yǎng)中對溫度的控制比光照更為重要，離體培養(yǎng)中對溫度的控制比光照更為重要，大所數(shù)植物最適溫度在大所數(shù)植物最適溫度在23-3223-32之間。培養(yǎng)室溫度之間。培養(yǎng)室溫度是是252522。低于。低于1515時，培養(yǎng)的組織生

41、長停頓，時，培養(yǎng)的組織生長停頓，高于高于3535對生長也不利。因此，培養(yǎng)室應(yīng)安裝空對生長也不利。因此，培養(yǎng)室應(yīng)安裝空調(diào)機或其他的控溫設(shè)備。調(diào)機或其他的控溫設(shè)備。3 3、濕度、濕度 培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度通常是培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度通常是100%100%，而環(huán)境中，而環(huán)境中的相對濕度會直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。因的相對濕度會直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。因此，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保此，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保持在持在70-80%70-80%，相對濕度過低影響培養(yǎng)物生長和，相對濕度過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過高雜分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，

42、大量污染，應(yīng)及時地通風除濕。菌滋生，大量污染，應(yīng)及時地通風除濕。4 4、氧氣、氧氣 離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的，在固體培離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的，在固體培養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時，如果組織完全浸入培養(yǎng)基養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時，如果組織完全浸入培養(yǎng)基中，與氧氣隔絕，就會停止生長。因此，接種時中，與氧氣隔絕，就會停止生長。因此，接種時要有部分組織合空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣要有部分組織合空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增物也不能生長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速

43、除去釋放出來的加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的COCO2 2，有利有利于外植體外層細胞開始分裂。于外植體外層細胞開始分裂。組織培養(yǎng)步驟圖組織培養(yǎng)步驟圖（1 1）準備階段）準備階段 查閱相關(guān)文獻，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結(jié)合查閱相關(guān)文獻，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結(jié)合實際制定出切實可行的培養(yǎng)方案。實際制定出切實可行的培養(yǎng)方案。 根據(jù)實驗方案配制適當?shù)幕瘜W消毒劑以及不同培養(yǎng)階段根據(jù)實驗方案配制適當?shù)幕瘜W消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌后備用。所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌后備用。（2 2）外植體的選擇與消毒）外植體的選擇與消毒 選擇合適的部位作為外植體，

44、采回后經(jīng)過處理，然后進選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過處理，然后進行消毒處理。行消毒處理。 將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖、挑出花藥，接種到啟動培養(yǎng)基上。或剝離出莖尖、挑出花藥，接種到啟動培養(yǎng)基上。（3 3）啟動培養(yǎng)）啟動培養(yǎng) 接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋外植體中已分化的細胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。芽直接萌發(fā)形成芽。 將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基將愈傷組織

45、轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。（4 4）增殖培養(yǎng)）增殖培養(yǎng) 分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，采用適當?shù)脑鲋撑喾只纬傻难?、原球莖數(shù)量有限，采用適當?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)基經(jīng)反復(fù)多次切割轉(zhuǎn)接。養(yǎng)基經(jīng)反復(fù)多次切割轉(zhuǎn)接。 當芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，當芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴繁。進行脫毒苗培養(yǎng)的還要進行病另一部分保存或繼續(xù)擴繁。進行脫毒苗培養(yǎng)的還要進行病毒檢測。毒檢測。 （5 5）生根培養(yǎng)）生根培養(yǎng) 剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時可降剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無

46、根，此時可降低或不加細胞分裂素濃度，提高生長素濃度，促進芽苗低或不加細胞分裂素濃度，提高生長素濃度，促進芽苗生根，提高其健壯度。生根，提高其健壯度。（6 6）煉苗移栽）煉苗移栽 選擇生長健壯，有選擇生長健壯，有3 35 5條根的生根苗進行煉苗，移條根的生根苗進行煉苗，移栽到疏松透氣的基質(zhì)中，注意保溫、保濕、遮蔭。當苗栽到疏松透氣的基質(zhì)中，注意保溫、保濕、遮蔭。當苗完全成活后，再移向大田。完全成活后，再移向大田。擬定培養(yǎng)方案擬定培養(yǎng)方案外植體預(yù)處理外植體預(yù)處理外植體無菌接外植體無菌接種種啟動培養(yǎng)啟動培養(yǎng)分化出芽、胚分化出芽、胚狀體或原球莖狀體或原球莖繼代增殖培養(yǎng)繼代增殖培養(yǎng)生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)煉苗移

47、栽煉苗移栽成活供生產(chǎn)使成活供生產(chǎn)使用用植物組織培養(yǎng)的一般程序植物組織培養(yǎng)的一般程序 培養(yǎng)基配制滅菌培養(yǎng)基配制滅菌二、外植體的成苗途徑（第三章后講）二、外植體的成苗途徑（第三章后講）外植體的成苗途徑有三種：外植體的成苗途徑有三種：（一）外植體（一）外植體- -愈傷組織愈傷組織- -完整植株。完整植株。 具體又可分為三種：具體又可分為三種： 1 1、愈傷組織、愈傷組織- -同時長芽和根同時長芽和根- -植株。植株。2 2、愈傷組織、愈傷組織- -莖莖- -根根- -植株。植株。3 3、愈傷組織、愈傷組織- -根根- -芽芽- -植株。植株。（二）外植體（二）外植體- -胚狀體胚狀體- -植株?？蓮?/p>

48、以下幾種培養(yǎng)物植株。可從以下幾種培養(yǎng)物中產(chǎn)生：中產(chǎn)生：1 1、器官上發(fā)生。、器官上發(fā)生。2 2、愈傷組織上發(fā)生。、愈傷組織上發(fā)生。3 3、游離單細胞發(fā)生。、游離單細胞發(fā)生。4 4、小孢子發(fā)生。、小孢子發(fā)生。 誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整。誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整。 （三）外植體（三）外植體- -直接形成根與芽直接形成根與芽- -植株。如莖尖培養(yǎng)植株。如莖尖培養(yǎng) 三、培養(yǎng)中常見問題三、培養(yǎng)中常見問題（一）（一）污染污染的原因及其預(yù)防措施的原因及其預(yù)防措施1 1、污染原因、污染原因 污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)

49、致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。 病原菌：細菌及真菌兩大類。病原菌：細菌及真菌兩大類。細菌污染特點細菌污染特點- -菌斑呈黏液狀，接種后菌斑呈黏液狀，接種后1-21-2天發(fā)現(xiàn)。天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：污染途徑： 外植體帶菌外植體帶菌 培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程操作人員未遵守操作規(guī)程 真菌污染的特點真菌污染的特點- -污染部分長有不同污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后顏色的霉菌，接種后3-103-10天發(fā)現(xiàn)。天發(fā)現(xiàn)。 污染途徑：污染途徑： 周圍環(huán)境不清潔周圍環(huán)境不清潔 超凈工作臺過濾裝置失效超凈工作臺過濾裝置失效 培養(yǎng)瓶的口徑過大培養(yǎng)瓶

50、的口徑過大2 2、污染的預(yù)防措施、污染的預(yù)防措施防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施- -莖尖作外植體時，進行預(yù)培養(yǎng)（無糖）或莖尖作外植體時，進行預(yù)培養(yǎng)（無糖）或暗培養(yǎng)。無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，暗培養(yǎng)。無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。以新抽嫩枝作外植體。- -晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬過可殺死部晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬過可殺死部分細菌或真菌。分細菌或真菌。- -接種時除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分接種時除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。生組織。 （2 2）外植體的滅菌）外植體的滅菌 - -多次滅菌法，次氯酸鈉多次滅菌法，次氯酸鈉- -無菌水無菌水- -次氯酸次氯酸

51、鈉鈉- -多種藥液交替浸泡法，肥皂水多種藥液交替浸泡法，肥皂水- -酒精酒精- -次次氯酸鈉氯酸鈉- -無菌水。無菌水。器皿與金屬器械的滅菌器皿與金屬器械的滅菌 玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌 金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌布質(zhì)制品的滅菌布質(zhì)制品的滅菌 濕熱滅菌濕熱滅菌無菌操作室的滅菌無菌操作室的滅菌 2%2%新捷爾滅或新捷爾滅或70%70%酒精擦拭（噴霧），紫酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。嚴格按照操作程序。嚴格按照操作程序。（二）外植體的（二）外植體的褐變褐變及其

52、防止措施。及其防止措施。1 1、褐變的原因、褐變的原因 褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化酚氧化酶被激活，使細胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死的褐變物向成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死的褐變物向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。亡的現(xiàn)象。 基因型基因型 某些植物酚類物質(zhì)含量較多。某些植物酚類物質(zhì)含量較多。外植體的生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài) 幼年的材料培養(yǎng)含醌類物幼年的材料培養(yǎng)含醌類物質(zhì)較少

53、。質(zhì)較少。培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分- -過高的無機鹽濃度過高的無機鹽濃度- -生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當，BABA過多過多- -分生能力強的材料，氧化受抑制，褐變也被抑分生能力強的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制制- -培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強，褐變培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強，褐變加速。加速。材料轉(zhuǎn)移時間材料轉(zhuǎn)移時間 時間過長引起材料褐變。時間過長引起材料褐變。2 2、褐變的防止措施、褐變的防止措施選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基。選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基。連續(xù)轉(zhuǎn)移。連續(xù)轉(zhuǎn)移。加抗氧化物。加抗氧化物。加活性炭。加活性炭。0.1-0.5%0.1-0.5%活性炭活性

54、炭 （三）（三）玻璃化玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施現(xiàn)象及其預(yù)防措施1 1、玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因、玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因玻璃化是在細胞生長過程中的環(huán)境產(chǎn)生玻璃化是在細胞生長過程中的環(huán)境產(chǎn)生變化，試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈變化，試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。主要原因是：玻璃狀。主要原因是：激素濃度激素濃度 BABA濃度提高，導(dǎo)致玻璃化苗濃度提高，導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。瓊脂濃度瓊脂濃度 瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。溫度溫度 低溫易形成玻璃化苗。低溫易形成玻璃化苗。光照時間光照時間 一般要求一般要求10-12h10-12h，大于，大于15h15h玻璃苗增加。玻璃苗

55、增加。通風條件通風條件 培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，玻璃化苗多。不良，玻璃化苗多。離子水平離子水平 植物種類不同，離子形態(tài)植物種類不同，離子形態(tài)比例量要求不同。比例量要求不同。2 2、預(yù)防措施、預(yù)防措施控制無機營養(yǎng)成分，降低氮（銨態(tài)氮）和氯?？刂茻o機營養(yǎng)成分，降低氮（銨態(tài)氮）和氯。提高蔗糖和瓊脂濃度提高蔗糖和瓊脂濃度降低細胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例。降低細胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例。增加自然光照增加自然光照1000-1800lx1000-1800lx，控制光照時間，控制光照時間8-12h8-12h。適溫生長，熱擊處理防止玻璃化發(fā)生。適溫生長，熱擊處理防止玻璃化發(fā)生。使用透氣性好的封口膜。使用透氣性好的封口膜。培養(yǎng)基中加入間苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壯培養(yǎng)基中加入間苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壯素。素。 第五節(jié)第五節(jié) 試管苗的馴化移栽（后講）試管苗的馴化移栽（后講）一、試管苗的特點一、試管苗的特點1 1、試管苗的生態(tài)環(huán)境、試管苗的生態(tài)環(huán)境 組織培養(yǎng)出來的苗通稱試管苗或組培苗。組織培養(yǎng)出來的苗通稱試管苗或組培苗。 試管苗長期生活在密閉容器中，形成其試管苗長期生活在密閉容器中，形成其獨特生態(tài)系統(tǒng)，與外界環(huán)境相比，有四大差獨特生態(tài)系統(tǒng)，與外界環(huán)境相比，有四大差異異高恒溫高恒溫 試管苗整個生長過程中采用的是恒溫培試管苗