人胰島素的制備

1、人胰島素的制備一、 獲得目的基因從供體細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成胰島素mRNA互補(bǔ)DNA，再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I的作用在，最終合成編碼它的雙鏈DNA序列。即得到了目的基因。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(一)從人體細(xì)胞內(nèi)提取胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA1, 細(xì)胞總RNA的提取 :取胰島B細(xì)胞，用PBS洗后，加入TRIZOL試將細(xì)胞破裂，后用DEPC處理，多次離心后，取RNA白色沉淀，測(cè)OD值，電泳。2 ，從總RNA中分離mRNA：取上述提取的總RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打勻。 70水浴

2、（裂解RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)）， 20-30條件下，靜置（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。 將Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速離心，加Buffer將其他RNA洗脫，最后用瓊脂糖凝膠電泳純化mRNA。（二）mRNA轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈cone 第一鏈的合成 加入上步獲得的mRNA和適當(dāng)引物于EP管中，加入RNase-free water，混勻后,70反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)完成后,立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min;稍微離心一下,順序加入緩沖液、 RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、 dNTP（加入放射性同位素利于檢驗(yàn)），  混勻，稍微離心反應(yīng)物之后,42放置2分鐘。取出置

3、于冰上。電泳分析，同位素活性測(cè)定。（三）PCR法擴(kuò)增，特異合成目的cDNA鏈通過胰島素的特異引物，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異的合成胰島素的cDNA鏈 。PCR法的操作步驟：預(yù)變性引物退火引物延伸循環(huán)25-35次最后延伸² 前端引物：² 5-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3² 后端引物：² 5-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt c

4、tc cag ctg gta-3二、 組建重組質(zhì)粒采用pQE-30質(zhì)粒作為載體，用雙酶切法進(jìn)行基因重組。.雙酶切法用兩種酶限制性內(nèi)切核酸酸消化載體DNA和外源DNA片段，使載體和外源目的基因的兩端分別形成不同黏性末端，將它們混合，在連接酶的作用下相同的黏性末端可退火連接成重組DNA分子，從而實(shí)現(xiàn)DNA的定向連接。.重組過程pQE-30用Hind 和BamH酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化酶切片段。外源DNA片段同樣也用Hind 和BamH酶切并回收純化酶切片段。雙酶切后的載體外源DNA片段混合退火，因?yàn)镠ind 和BamH的黏性末端不匹配，避免了載體和外源DNA片段的自身連接，外源DNA片段

5、只能定向地連接到載體的Hind 和BamH位點(diǎn)之間。當(dāng)然也不可避免發(fā)生載體的Hind 和BamH的黏性末端之間的兩個(gè)堿基互補(bǔ)形成開環(huán)，轉(zhuǎn)到大腸桿菌中被修復(fù)，但這樣的重組子占少數(shù)，是低效轉(zhuǎn)化。三、構(gòu)建基因工程菌(一) 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌-半乳糖苷酶基因的下游。重組子表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)CNBr處理后，分離純化A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸殘基性質(zhì)，采用相應(yīng)的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過體外化學(xué)折疊制備具有活性的重組人胰島素。重組DNA的轉(zhuǎn)化1, CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞：

6、取100 ml 菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心，收集菌體，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 ，冰浴放置12 - 24小時(shí)，備用。2，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50 ng 載體的重組，DNA連接液，混勻。冰浴放置半小時(shí) 。在42 保溫 2 分鐘（熱脈沖），快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 2 分鐘 。加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37 培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增） 。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。經(jīng)典的CaCl2轉(zhuǎn)化方法：a將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分

7、鐘,然后于4下3000g離心10分鐘。b 棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4下3000g離心10分鐘。 c棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。d 感受態(tài)細(xì)胞分裝成200l的小份, 貯存于-70。e從-70冰箱中取200l感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。f 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10l),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。 g42水浴中熱擊90秒或37水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5

8、分鐘。 h向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。 i將上述菌液搖勻后取100l 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)16-24小時(shí)。(二)重組子的篩選和鑒定（載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)）1.初篩選隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化單菌落，在LBAK培養(yǎng)基(含100p gml氨芐青霉素和50ug/ml卡那霉素)中進(jìn)行培養(yǎng)，用O.5mmolLIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)情況用165SDSPAGE進(jìn)行分析。2.重組菌的后續(xù)鑒定直接電泳檢測(cè)法將初篩選獲得的重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取其

9、質(zhì)粒DNA，通過PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大，用電泳法檢測(cè)質(zhì)粒是否為重組質(zhì)粒。目的蛋白表達(dá)檢驗(yàn)所得菌體經(jīng)溶菌酶超聲破碎細(xì)胞后得到的包涵體進(jìn)行SDSPAGE分析，所需基因工程菌表達(dá)的外源蛋(His)6·Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在，其分子大小約為13kb，經(jīng)電泳與胰島素原marker對(duì)比，如條帶顯示有所需目的蛋白，則所得菌既可做工程菌使用，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，斜面保存以便后續(xù)使用。3.工程菌的保藏 15%甘油保存菌種，菌液=20:80,充分混勻后,-70度保藏。四、 培養(yǎng)工程菌優(yōu)化發(fā)酵條件采用比濁法測(cè)定不同時(shí)間培養(yǎng)基中菌量，繪制基因工

10、程菌的生長(zhǎng)曲線，在搖瓶培養(yǎng)的水平下，采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵基因工菌，培養(yǎng)4小時(shí)候即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可延長(zhǎng)至17小時(shí)。1，正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：采用正交法，選取搖瓶培養(yǎng)條件中七個(gè)主要因素進(jìn)行兩水平正交優(yōu)化，該七個(gè)因素為：種子活化方式，搖床轉(zhuǎn)速(通風(fēng)量)，IPTG誘導(dǎo)溫度，接種量，IPTG添加量，誘導(dǎo)時(shí)間，補(bǔ)料方式。分別用A、B、C、D、E、F、G表示以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量及發(fā)酵液的A600為目標(biāo)量，考察條件優(yōu)化的效果，進(jìn)行八次實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化出最佳實(shí)驗(yàn)條件。2，其他條件優(yōu)化：在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步就各種金屬元素對(duì)苗體生長(zhǎng)發(fā)重組蛋白誘導(dǎo)的影響作了分析。3，放大培養(yǎng)

11、（比較不同發(fā)酵工藝產(chǎn)量）：在優(yōu)化搖瓶水平發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，放大至1 L培養(yǎng)基中比較兩種發(fā)酵工藝。在不同轉(zhuǎn)速，通氣量，pH條件下，比較選擇產(chǎn)量最高的發(fā)酵工藝。五、 產(chǎn)物分離純化由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對(duì)產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品?；蚬こ趟幬锏姆蛛x純化一般不應(yīng)超過4-5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞分離，分別得到胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物。胞外產(chǎn)物直接進(jìn)行透析濃縮然后進(jìn)行再?gòu)?fù)性及酶轉(zhuǎn)化，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高度純化，最后制劑即可。胞內(nèi)產(chǎn)物用溶酶菌或超聲波將細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎后用高速離心法進(jìn)行固液分離。分離后用

12、變性劑或者離子去污劑得到包含體，再用變性劑（尿素）使其變形，接著用二次復(fù)性法將其復(fù)性。對(duì)復(fù)性后的產(chǎn)物進(jìn)行透析濃縮，然后進(jìn)行再?gòu)?fù)性及酶轉(zhuǎn)化，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高度純化，最后制劑即可。重組蛋白分離純化的特點(diǎn)重組蛋白質(zhì)分離純化的特點(diǎn)為：(1)大多數(shù)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品是生物活性物質(zhì)，在分離純化過程中，有機(jī)溶劑、溶液pH值、離子強(qiáng)度的變化均可使蛋白質(zhì)變性失活a(2)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品在物料中含量很低，凰物料組成非常復(fù)雜。例如，利用基因工襁菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藤，物料中含有大量綴成復(fù)雜的培養(yǎng)基、榮體生產(chǎn)代謝物等，疆揀蛋鑫囊魏含量囂豢不瑟蛋鑫凄慈爨鵑1。舂些囂揀鬣囊矮存在予綴懿武或在胞內(nèi)形成包含體，為獲敬蛋白質(zhì)，還需避行細(xì)脆破

13、碎，結(jié)鬈物料中含有大量的細(xì)胞碎片和胞內(nèi)產(chǎn)物。(3)含蛋白質(zhì)產(chǎn)晶的物料不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)產(chǎn)品易受料液中蛋自水解酶降解。(4)很多熏組蛋白質(zhì)產(chǎn)品作為醫(yī)藥、食品被人炎利用，因而要求蛋國(guó)艨產(chǎn)器必綏是裹癀縫銫瓣，產(chǎn)蘸無螢、茲致熱源等。與傳統(tǒng)麓生物大分子分離方式楣鐨，蘩綴蛋臼的分離純純恣憝秘用其攜理稻化學(xué)性質(zhì)的差異，即以分子的大小、形狀、溶解度、等電點(diǎn)、祭疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。二次復(fù)性法：05g包涵體溶解于一定量的緩沖液B(50mmolLGlyNaOH，8 molL尿素，B_巰基乙醇，pH 95)中，使之充分混懸，靜置1小時(shí)以上。混懸液分步逐滴加入到緩沖液C(50mmolLGly-Na

14、OH，半胱氨酸一胱氨酸，pH 95)中，4靜置復(fù)性過夜。上樣于已用50mmolLGlyNaOH(pH 95)平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用01molL的氯化鈉梯度洗脫，通過SDS-PAGE確定RRhPI位置，用DEAE-Sepharose FF做離子交換層析，收集含RRhPI的洗脫峰2，層析圖譜見（圖6）。電泳檢測(cè)顯示(圖11)峰2主要為RRhPI，及少量高分子雜質(zhì)，收集峰2做再?gòu)?fù)性。峰1為pH高于95及一些疏水性蛋白質(zhì)形成的穿透峰，絕大部分pH低于RRhPI的蛋白質(zhì)和核酸類雜質(zhì)則牢固地結(jié)合在柱子上，在較高鹽濃度及2molL NaCl的條件下被洗脫下來，形成其他峰3和峰4。胰島

15、素原（RRhPI）的再?gòu)?fù)性及酶切轉(zhuǎn)化：1,復(fù)性將初步復(fù)性及純化后的RRhPI通過透析濃縮，先后轉(zhuǎn)換到緩沖液B和D(50mmolL G1y-NaOH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)一還原型谷胱甘(GSH)pH95)中，使蛋白濃度為01O6 mgml，4靜置過夜。2,酶切復(fù)性后的RRhPI復(fù)性液調(diào)節(jié)pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)在37。C進(jìn)行協(xié)同酶切一段時(shí)間，然后滴加2 molL ZnCI：至ZnCl：濃度為01molL終止反應(yīng)并沉淀生成的hI，用雙蒸水洗滌沉淀得較純B9重組人胰島素約79 mg/L培養(yǎng)基。重組胰島素粗品的純化：胰島素粗品

16、用02 molL NaAc·HAc，pH40溶解。溶解后的樣品通過Superdex 75進(jìn)行純化(圖10)，得1、2、3峰，收集峰3，透析后凍干即為胰島素產(chǎn)品所得胰島素產(chǎn)品用SDS-PAGE分析為單帶，電泳檢測(cè)見圖。六、 除菌過濾 傳統(tǒng)過濾只能濾去空氣中的塵埃、液體中的異物微粒，很難去除微生物活體（細(xì)菌、病毒及熱原體）；薄膜過濾是微孔篩分，大于孔徑的微粒均被截留，微生物粒子大小為0.5-2微米，只要選用0.45微米 的微孔濾膜即可將微生物截留去除，用0.22微米的微孔濾膜則可能將病毒、熱原體去除。 注射用藥液除用傳統(tǒng)過濾器去除藥液中的異物外，現(xiàn)已采用微孔濾膜將澄清的藥液再次除菌、除熱

17、原，其濾膜孔徑最好在0.22微米以下。制藥空氣的過濾亦因GMP的不同級(jí)別要求而采用相應(yīng)的器材、過濾器。要指出的是，制藥無菌空氣的供應(yīng)僅采用傳統(tǒng)濾材、濾器往往不能達(dá)到要求，其終端必須選用微孔薄膜，孔徑必須在0。45微米以下。注射用無菌藥液的處理：按GMP要求，注射用藥液應(yīng)當(dāng)無菌無熱原，本品藥液配制好后，經(jīng)過粗砂棒、細(xì)砂棒（ 適當(dāng)使用滑石粉或碳粉）過濾成澄明液后，再經(jīng)過0.45微米 多層微孔濾芯除菌，終端通過0.22微米單層超微孔濾膜后上機(jī)灌裝。目前，用于過濾器常用的主要過濾材料大致有以下幾種：混合纖維素酯常用來制成圓形的單片平板濾膜，用于液體和氣體的精過濾；聚丙烯(PP)做成折疊式，常用于筒式過

18、濾器，有較大的孔徑，其具有親水性，屬粗過濾材料；聚偏二氟乙烯(PVDF)屬精過濾材料，耐熱和耐化學(xué)穩(wěn)定，蒸汽滅菌承受性良好，可制成親水性濾膜，較廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)無菌制劑用水及注射用水的過濾；聚醚砜(PES)做成折疊式，常用于筒式過濾器，耐溫耐水解性能好，親水性材料，用于精度較高的溶液的精過濾；尼龍做成折疊式，常用于筒式過濾器，親水性材料，常用作液體的精過濾；聚四氟乙烯(PTFE)做成折疊式，常用于筒式過濾器，疏水性材料，其是使用相當(dāng)廣泛的一種材料，耐熱耐化學(xué)穩(wěn)定，常用于水、無機(jī)溶劑及空氣的精過濾。除菌過濾器的特點(diǎn)（1）除菌過濾器一般采用十字懸掛式，水平進(jìn)出。多芯過濾器可設(shè)計(jì)成落地式。（2）有

19、些使用場(chǎng)合根據(jù)實(shí)際需要分成預(yù)過濾器、精過濾器兩種。（3）空氣流向：從外向內(nèi)穿過濾芯。（4）進(jìn)入除菌過濾器的壓縮空氣必須先經(jīng)過至少三級(jí)的精密過濾器及干燥機(jī)。除油、除水、除塵，油霧濃度應(yīng)0.01PPM，否則將影響除菌濾芯的壽命，達(dá)不到預(yù)期的除菌效果。（5）定期殺菌，根據(jù)實(shí)際使用情況每周或每月12次，每次30分鐘，采用經(jīng)過1過濾精度的潔凈飽和蒸汽殺菌。蒸汽溫度140，蒸汽壓力0.3MPa。閥門緩慢開關(guān)。（6）作為罐體、設(shè)備的呼吸器使用時(shí)，其作用主要在于連通大氣防止設(shè)備內(nèi)部負(fù)壓和隔離開空氣中的污染源，過濾方面的功能不大，因此在過濾上基本無要求。 對(duì)胰島素進(jìn)行除菌過濾后采用胰島素凍干粉等凍干技術(shù)凍干，既

20、得胰島素結(jié)晶。經(jīng)包裝等工序后的成品。如下圖：七、 半成品檢定重組人胰島素半成品檢測(cè)（檢測(cè)提取純化后重組人胰島素樣品）：（一）雜質(zhì)檢定1，有關(guān)物質(zhì) ： 取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含3.5mg的溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液20ml注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計(jì)算，含A21脫酰胺人胰島素不得過1.5%，其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過2.0%。2，高分子蛋白質(zhì) ：取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作為供試品溶液。按照分子排阻色譜法試驗(yàn)。以色譜用親水改性硅膠為填充劑（510mm）；冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15：20：6

21、5）為流動(dòng)相，流速為每分鐘0.5ml，檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm。取重組人胰島素單體-二聚體對(duì)照品，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液；取100ml注入液相色譜儀，重組人胰島素單體與二聚體的分離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液100ml，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，除去保留時(shí)間大于人胰島素主峰的其它峰面積，保留時(shí)間小于人胰島素主峰的所有峰面積之和不得過1.0%。3，鋅 ：對(duì)照品溶液的制備 精密量取鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000g/ml）5ml，置100ml量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻。供試品溶液的制備 精密稱取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含鋅約0.4

22、0.8g的溶液，搖勻。測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液，用0.01mol/L鹽酸溶液分別稀釋成每1ml鋅含量為0.20g、0.40g、0.60g、0.80g、1.00g的溶液。將上述各溶液與供試品溶液，照原子吸收分光光度法，在213.9nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，按干燥品計(jì)，含鋅量不得過1.0%。4，熾灼殘?jiān)?：取本品約0.2g，依法檢查，遺留殘?jiān)坏眠^2.0%。（二）效價(jià)測(cè)定：按照高效液相色譜法測(cè)定取本品適量，精密稱定，用0.01mol/L鹽酸溶液定量稀釋至每1ml中約含10單位的溶液（臨用新配）。精密量取20ml注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取重組人胰島素對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以人胰島素峰面積（包括

23、A21脫酰胺峰面積）計(jì)算，即得。（三）胰島素生物測(cè)定法本法系比較胰島素標(biāo)準(zhǔn)品（S）與供試品（T）引起小鼠血糖下降的作用，以測(cè)定供試品的效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取胰島素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價(jià)，加入每100ml中含有苯酚0.2g并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5的0.9%氯化鈉溶液，使溶解成每1ml中含20單位的容易忘，48貯存，以不超過5天為宜。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備 試驗(yàn)當(dāng)日，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按高低劑量組(ds2 , ds1)加0. 9氯化鈉溶液(pH2. 5)制成兩種濃度的稀釋液，高低劑量的比值(r)不得大于1:0. 5。高濃度稀釋液一般可制成每1 ml中含0. 06'0. 12單

24、位，調(diào)節(jié)劑量使低劑量能引起血糖明顯下降，高劑量不致差別。 供試品溶液與稀釋液的制備 按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)(AT)，照標(biāo)準(zhǔn)品溶液與其稀釋液的制備法制成高、低兩種濃度的稀釋液，其比值(r)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品高低劑量所致的反應(yīng)平均值應(yīng)相近。 測(cè)定法取健康合格、同一來源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠，體重相差不得超過3g，按體重隨機(jī)等分成4組，每組不少于10只，逐只編號(hào)，各組小鼠分別自皮下注人一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液，每鼠0. 2 0. 3ml，但各鼠的注射體積(ml)應(yīng)相等。注射后40分鐘，按給藥順序分別自眼靜脈叢采血，用適宜的方法，如葡萄糖氧化酶一過氧化酶法測(cè)定血糖值。

25、第一次給藥后間隔至少3小時(shí)，按雙交叉設(shè)計(jì)，對(duì)每組的各鼠進(jìn)行第二次給藥，并測(cè)定給藥后40分鐘的血糖值。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(附錄XlV)中量反應(yīng)平行線測(cè)定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。 本法的可信限率(FL%)不得大于25 %（四）注射液檢測(cè)1，滲透壓摩爾濃度： 除另有規(guī)定外，靜脈輸液及椎管注射用注射液按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，照滲透壓摩爾濃度測(cè)定法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 2，可見異物: 除另有規(guī)定外，照可見異物檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 3，不溶性微粒 ：除另有規(guī)定外，溶液型靜脈用注射液、注射用無菌粉末及注射用濃溶液照不溶性微粒檢查法檢查，均應(yīng)符合規(guī)定。 3，無菌: 按照無菌檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 4，細(xì)

26、菌內(nèi)毒素或熱原： 除另有規(guī)定外，靜脈用注射劑按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法或熱原檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。熱原（pyrogen） 1.熱原的定義 : 注射后能引起人體特殊致熱反應(yīng)的物質(zhì)。 2.熱原的組成 : 熱原是微生物的代謝產(chǎn)物，是微生物的一種內(nèi)毒素，大多數(shù)細(xì)菌都能產(chǎn)生熱原，革蘭氏陰性桿菌致熱力最強(qiáng)。熱原由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，其中脂多糖是致熱活性中心。脂多糖組成因菌種的不同而異，熱原的分子量106左右。 3.熱原的危害 : 含熱原的注射劑輸入人體后，約半小時(shí)人體就發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、全身痛、出汗、惡心嘔吐等，嚴(yán)重時(shí)高燒40度、昏迷、虛脫、甚至死亡。八、成品檢定重組人胰

27、島素成品檢測(cè)（即檢測(cè)重組人胰島素注射液樣品）：本品為重組人胰島素的無菌水溶液。其效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的90.0110.。本品可加入適量的苯酚或間甲酚作抑菌劑。【鑒別】（1） 取本品，按照重組人胰島素項(xiàng)下的鑒別項(xiàng)試驗(yàn)，顯相同的結(jié)果。（2）在苯酚或間甲酚檢查項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液中苯酚峰或間甲酚峰的保留時(shí)間應(yīng)與苯酚或間甲酚對(duì)照品的保留時(shí)間一致?！緳z查】1，有關(guān)物質(zhì) 取本品，每1ml中加9.6molL鹽酸溶液3µl酸化，混勻后作為供試品溶液；取供試品溶液適量（約相當(dāng)于人胰島素2單位），按照重組人胰島素項(xiàng)下的方法檢查，扣除苯酚峰和間甲酚峰，按面積歸一化法計(jì)算，A21脫酰胺人胰島素不得過2.0%，其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過6.0%。2，高分子蛋白質(zhì) 取本品，每1ml加9.6molL鹽酸溶液3µL酸化，混勻后作為供試品溶液；取供試品溶液100µL，按照重