重組豬 - 干擾素的純化及生化性質(zhì)鑒定 - 圖文-

1、重組豬-干擾素的純化及生化性質(zhì)鑒定邵菁1,2,于瑞嵩2,3,董世娟2,3,朱于敏2,3,沈世緣2,3,曹祥榮1,李震2,3(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210046(2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106(3.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201106摘要對(duì)巴斯德畢赤酵母高效分泌表達(dá)的豬2干擾素(Po I F N 2純化工藝和純化后重組蛋白的部分生化特性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:豬2干擾素(Po I F N 2發(fā)酵液經(jīng)離心、透析、過濾處理之后,依次利用親和層析和離子交換層析使目的蛋白得到了純化.經(jīng)N 端氨基酸測(cè)序,W estern 2bl ot,對(duì)酸、熱、巰基乙醇的穩(wěn)定

2、性和糖基化程度等檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),所表達(dá)的豬2干擾素N 端氨基酸序列(前5個(gè)正確,對(duì)酸和熱基本穩(wěn)定,二硫鍵對(duì)目的蛋白的活性至關(guān)重要,沒有發(fā)現(xiàn)目的蛋白的糖基化.關(guān)鍵詞重組豬2干擾素(Po I F N 2,親和層析,離子交換層析,糖基化,生化性質(zhì)中圖分類號(hào)S852.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)100124616(2008022*Pur i f i ca ti on of Recom b i n an t Porc i n e 2I n terferon and the Iden ti f i ca ti on of its B i ochem i ca l Character isti csShao J i

3、ng 1,2,Yu Ruis ong 2,3,Dong Shijuan2,3,Zhu Yum in2,3,Shen Shiyuan2,3,Cao Xiangr ong 1,L i Zhen2,3(1.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210046,China (2.Ani m al Husbandry and Veterinary Research I nstitute,Shanghai Acade my of Agricultural Sciences,Shanghai 201106,China (3.Sha

4、nghaiMunici pal Key Laborat ory of Agri 2Genetics and B reeding,Shanghai 201106,China Abstract:I n this study,we devel oped the technique f or purifying recombinant porcine 2interfer on (Po I F N 2that was efficiently exp ressed by Pichia Past oris and studied the bi oche m ical characteristics of P

5、o I F N 2.Recombinant porcine I F N 2was purified t o homogeneity by affinity chr omat ography and i on 2exchange chr omat ography stepwisely after centrifu 2gati on 、dialysis and filtrati on .The results of its bi oche m ical characteristics showed that the first five a m ino acids of N -ter m inal

6、 of the purified p r otein was correct .The p r otein was heat and acid 2stable and the dithi olate 2bond was crucial t o the p r otein activity .No glycosylati on were f ound on the target p r otein .Key words:recombinant porcine 2interfer on (Po I F N 2,affinity chr omat ography,i on 2exchange chr

7、 omat ography,glyco 2sylati on,bi oche m ical characteristics收稿日期:2007207202.干擾素(I nterfer on,I F N 是一類重要的細(xì)胞因子,具有種屬特異性,在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、抗細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性.根據(jù)干擾素的來源和性質(zhì)可分為型干擾素和型干擾素1,2.豬干擾素(Po I F N 也可分為I 型和型,I 型包括、和4種,型僅有1種.I 型豬干擾素基因無(wú)內(nèi)含子,基因組中一般含有多個(gè)I 型豬干擾素基因3.豬I F N 2(Po I F N 2基因家族分為二類同源的、但明顯不同的基因類型:Po I

8、 F N 21和Po I F N 22.目前,Po I F N 21基因已經(jīng)在真核和原核細(xì)胞中得到表達(dá),但相關(guān)的分離純化報(bào)道很少.通過研究表明,Po I F N 2可被用作動(dòng)物疫苗的免疫增強(qiáng)劑和豬病毒病的治療劑4,5,因此,在獲得較高水平表達(dá)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上,探索重組Po I F N 2的分離純化工藝,具有重要的理論意79第31卷第2期2008年6月南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science Editi on Vol .31No .2Jun,2008義和實(shí)踐價(jià)值.1材料和方法111材料111.1

9、試劑磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris 、甲醇、氯化鈉、三氟甲基磺酸、苯酚、脫氧膽酸鈉和三氯乙酸購(gòu)自上海國(guó)藥生物公司,辣根過氧化物酶、P VDF 膜和咪唑購(gòu)自上海西唐生物公司,BCA 試劑盒購(gòu)自Pierce 公司.11112設(shè)備及儀器高速離心機(jī)(Sig ma ,凝膠電泳儀(B i o 2rad ,凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海Tanon ,pH 計(jì)(M illi pore ,M il 2li pore 012m 濾器(Pall ,截留相對(duì)分子質(zhì)量3500的透析袋(上海華美,FP LC 分離純化系統(tǒng)和H isTrap HP Kit 親和預(yù)裝柱(安瑪西亞,H isTrap DE AE FF 離子交換預(yù)裝柱(

10、GE Healthcare ,真空干燥器(Sa 2vant .112方法11211純化發(fā)酵液于412000r/m in 離心15m in,收集上清液;上清液用pH810、P O -3420mmol/L 、NaCl 500mmol/L 透析24h 后,于410000r/m in 離心15m in,再次收集上清液;上清液經(jīng)過012m 微孔濾器過濾后上樣金屬N i 2+親和預(yù)裝柱(1mL ,通過不同濃度的咪唑進(jìn)行階段洗脫,收集流出峰并測(cè)其活性;活性峰用pH 716、Tris 20mmol/L 透析24h 后,上樣DEAE FF 離子交換預(yù)裝柱(1mL ,通過不同濃度的NaCl 階段洗脫,收集流出峰并

11、測(cè)其活性.11212活性檢測(cè)豬2干擾素的活性檢測(cè)采用W I SH 細(xì)胞(人羊膜傳代細(xì)胞株-VS V (濾泡性口炎病毒抗病毒系統(tǒng)6.I F N 抗病毒活性單位的定義是指能抑制50%細(xì)胞病變或50%病毒空斑形成效應(yīng)的I F N 最高稀釋度的倒數(shù).11213純度檢測(cè)S DS -P AGE 銀染電泳鑒定純度7.11214蛋白濃度測(cè)定蛋白濃度用BCA 試劑盒,具體步驟見盒中說明書.11215蛋白質(zhì)免疫印跡樣品先進(jìn)行S DS -P AGE 電泳,結(jié)束后切下含有目的蛋白的膠;將NC 膜和3mm 濾紙按海綿墊濾紙(3張凝膠NC 膜濾紙(3張海綿墊的結(jié)構(gòu)放入轉(zhuǎn)印電泳槽,冰浴下200mA 恒流轉(zhuǎn)印3h .結(jié)束后將

12、NC 膜依次置于:封閉液中振搖1h,用封閉液稀釋為16000的鼠抗Po I F N一抗中振搖1h;P BST 中洗3次,每次10m in;用封閉液稀釋為15000的HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠I g G 的二抗中振搖1h;P BST 洗3次,每次10m in .最后將膜浸入底物溶液中直至適中的顏色出現(xiàn),用去離子水沖洗終止反應(yīng).11216蛋白質(zhì)N 端氨基酸序列、等電點(diǎn)(p I 的測(cè)定委托上海中科院生化與細(xì)胞所測(cè)試中心檢測(cè).11217對(duì)酸、熱、巰基乙醇穩(wěn)定性的檢測(cè)豬2干擾素對(duì)酸的穩(wěn)定性:將1mL 純化的蛋白樣液在4下置于pH 210、20mmol 的磷酸二氫鈉溶液中透析24h .豬2干擾素對(duì)熱的穩(wěn)定性:

13、將1mL 純化的蛋白樣液放入Eppendorf 離心管中,置于56水浴鍋內(nèi)1h .豬2干擾素對(duì)巰基乙醇的穩(wěn)定性:將200mmol -巰基乙醇加入純化的蛋白樣液中,在4下置于pH 714的磷酸二氫鈉溶液中透析24h .通過抗病毒系統(tǒng)檢測(cè)豬2干擾素的活性8.11218糖基化修飾的初步鑒定(1辣根過氧化物酶(HRP 的糖鏈切割:取一定量HRP 于Eppendorf 離心管中,依次加入100L 三氟89南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版第31卷第2期(2008年甲基磺酸和50L 苯酚,于01000r/m in 旋轉(zhuǎn)1h,加100L 20mmol/L Tris 終止反應(yīng),并于4pH 714、20mmol 磷酸緩沖

14、液內(nèi)透析24h;用三氯乙酸沉淀法沉淀,加入適量的樣品緩沖液后進(jìn)行S DS -P AGE 電泳9,10.(2豬2干擾素的糖鏈切割:先通過三氯乙酸沉淀法將目的蛋白沉淀,冷凍抽干后,按方法(1對(duì)目的蛋白進(jìn)行糖鏈切割.2結(jié)果與分析211純化圖1顯示親和層析后(泳道4的雜蛋白量已經(jīng)大幅減少,再經(jīng)離子交換層析分離純化后(泳道6,可以獲得較為單一的目的蛋白.表1顯示了這一純化路線的純化效果,最終的蛋白比活為115×104I U /mg,蛋白回收率為1133%,純化倍數(shù)為0127.表1豬2干擾素的分離純化的效果Table 1Par i f i ca ti on eff i c i ency of P

15、o I FN 2樣品蛋白濃度/(mg/mL 蛋白活力/(×104I U /mL 蛋白比活/(×104I U /mg 蛋白收率/%純化因子上樣前發(fā)酵液01040106115011330127212W estern bl ot 、蛋白質(zhì)N 端氨基酸序列和等電點(diǎn)(p I 的測(cè)定檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量16100和210002條蛋白的N 端前5個(gè)氨基酸序列均是E -A -E -A -X,對(duì)照豬2干擾素N 端前 5個(gè)氨基酸序列(C -D -L -P -Q 和載體信號(hào)肽最后5個(gè)氨基酸序列(R -E -A -E -A 發(fā)現(xiàn),所測(cè)的前4個(gè)氨基酸序列是載體信號(hào)肽末端未切除的部分;X 在一般情況下

16、是C,正好是目的蛋白的第一個(gè)氨基酸,這樣連同W estern bl ot 分析結(jié)果(圖2均證明,在16100和21000出現(xiàn)的2條蛋白N 端保持完好,且均是豬2干擾素.另外,相對(duì)分子質(zhì)量16100的目的蛋白等電點(diǎn)為415418,而用軟件分析豬2干擾素裸蛋白的等電點(diǎn)為614.表2豬2干擾素對(duì)酸、熱、巰基乙醇的穩(wěn)定性Table 2The st ab ility of Po I FN 2i n face of ac i d 、hea t and m ercaptoethanol條件活性未經(jīng)處理酸(pH210熱(56,1h 巰基乙醇(200mmol 干擾素滴度/(I U /mL 628503312邵菁

17、,等:重組豬-干擾素的純化及生化性質(zhì)鑒定213對(duì)酸、熱、巰基乙醇穩(wěn)定性的檢測(cè)表2說明在酸、熱和巰基乙醇存在的條件下:豬2干擾素在pH210時(shí)基本穩(wěn)定,在561h內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性,而它對(duì)巰基乙醇則十分敏感,表明二硫鍵對(duì)維持其活性有著非常重要的作用.214糖基化修飾的初步鑒定圖3顯示HRP經(jīng)TF MS切割后相對(duì)分子質(zhì)量由40000左右移至30000附近,說明TF MS法確實(shí)能夠切除糖蛋白的糖鏈.圖4顯示16100和21000這2條帶經(jīng)TF MS法切割后,并沒有出現(xiàn)位置上的明顯變化,所以初步認(rèn)為表達(dá)的豬2干擾素沒有發(fā)生糖基化. 3討論在金屬螯合親和層析純化過程中,本文選用咪唑?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性物質(zhì),通過改變

18、咪唑濃度來洗脫目的蛋白.實(shí)驗(yàn)中目的蛋白洗脫下的咪唑濃度較低,顯示目的蛋白結(jié)合不很牢固,可能與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有關(guān),也可能與目的蛋白C末端H is的降解有關(guān);在離子交換層析純化過程中,緩沖液的pH值是影響分離效果的關(guān)鍵因素之一,實(shí)驗(yàn)中選用的pH716緩沖液可以較好地達(dá)到分離純化重組豬2干擾素的目的.從整個(gè)純化效果來看,蛋白回收率、比活和純化因子都不理想,可能的原因是:在純化過程中,一些含有目的蛋白組分較高、但純度不是很高的樣品不得不被放棄;有相當(dāng)一些目的蛋白可能因?yàn)橥饨鐥l件的變化而改變了其空間構(gòu)象,造成目的蛋白的失活.本實(shí)驗(yàn)中的目的蛋白C端理論上帶有15個(gè)氨基酸殘基的抗原表位和6個(gè)組氨酸殘基,如

19、果表達(dá)完整,相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)該在21000左右.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量在16100和21000的2條蛋白均是目的蛋白,造成兩者相對(duì)分子質(zhì)量差異的原因可能是:大部分目的蛋白C末端的6個(gè)H is,甚至15個(gè)抗原表位氨基酸殘基已經(jīng)降解.另外,目的蛋白理論等電點(diǎn)應(yīng)在614左右,這與所測(cè)的415418也有明顯差異,可能的原因是:目的蛋白C端的15個(gè)抗原表位氨基酸序列(E-Q-K-L-I-S-E-E-D-L-N-S-A-V-D中有5個(gè)是酸性氨基酸,只有1個(gè)是堿性氨基酸,這也說明目的蛋白C末端6個(gè)H is可能已經(jīng)部分或全部降解,從而導(dǎo)致整個(gè)蛋白的電負(fù)性增加.三氟甲基磺酸法(TF MS可以切除與肽鏈直接相連的

20、單糖以外的所有糖基,而肽鍵則在同樣的條件下保持穩(wěn)定,最后通過電泳比較糖鏈切割前后蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的變化來判斷某一蛋白是否糖基化.該法反應(yīng)溫和,速度很快,對(duì)糖基化類型沒有選擇性,可以作用于所有類型的糖鏈.經(jīng)過TF MS法切割后的目的蛋白(圖3、圖4相對(duì)分子質(zhì)量未發(fā)生明顯變化,故初步判斷目的蛋白沒有糖基化.(下轉(zhuǎn)第104頁(yè)9Nadl ong L.Sepueira L.I ncrease in per oxidase activities are not directly involved in induced resistance in t obaccoJ.Physi2ol Plant Patho

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