神經(jīng)干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究

1、神經(jīng)干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究                   作者：張立峰，茅祖斌，蔣贊利     【摘要】  目的：探索利用MR技術(shù)活體追蹤干細胞的可行性及神經(jīng)干細胞(NSCs)移植對大鼠脊髓損傷(SCI)后功能恢復的影響。方法：66只SD大鼠隨機分為假損傷組（A組）、SCI對照組（B組）和細胞移植治療組（C組）3組，應用已包被多聚左旋賴氨酸(P

2、LL)的SPIO標記NSCs,對標記細胞進行普魯士藍染色，分別在細胞移植后第1、2、3、4、5周對各組動物進行BBB評分，細胞移植后1、3、5周行MRI檢查。結(jié)果：(1)普魯士藍染色證實該方法標記NSCs的有效率為100%。（2）細胞移植后15周,B、C組動物運動功能均有不同程度恢復，但B組恢復較慢，BBB評分差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。（3）1.5 T MRI 檢查 見移植處在T2WI序列呈低信號改變,第3周時低信號向損傷區(qū)擴大，第5周時可在損傷區(qū)見到低信號改變。結(jié)論：MR技術(shù)可以活體追蹤干細胞，NSCs移植治療SCI有利于大鼠后肢功能的恢復。 【關鍵詞】  脊髓損傷； 神經(jīng)干

3、細胞移植； 磁共振成像； 大鼠    脊髓損傷(spinal cord injury,SCI) 后自身的修復能力非常有限,死亡的神經(jīng)元不能由自身產(chǎn)生的神經(jīng)元或鄰近的神經(jīng)元來代替。近年來神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)的研究改變了這一觀點。NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有增殖和分化能力的一類細胞,是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期特定的細胞群體,它具備干細胞共有的特點，即能長久地保持增殖和分化能力1。隨著分子影像學的發(fā)展,干細胞移植后的體內(nèi)活體追蹤是近期研究的一個突破點2。本研究利用超順磁性氧化鐵(super paramagnetic iron oxide,S

4、PIO) 標記NSCs,對SCI大鼠進行細胞移植后的活體追蹤,探索利用MR技術(shù)活體追蹤干細胞的可行性以及NSCs移植對SCI大鼠后肢功能恢復的影響。    1  材料與方法    1.1  胎鼠來源NSCs的制備、培養(yǎng)與鑒定3    取胚齡14 d SD大鼠胚胎的大腦腦室下區(qū)組織并吹打成單個細胞,以1×105ml1種瓶,用DMEM/F12(11)無血清培養(yǎng)基內(nèi)含bFGF 20 ng·ml1、EGF 20 ng·ml1、B27 20 ng·ml1培

5、養(yǎng)。每67 d換液、傳代1次。    對第2代細胞作免疫組化鑒定：取無血清培養(yǎng)基貼壁分化培養(yǎng)24 h的蓋玻片1張,4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min,然后用5%脫脂奶粉封閉特異性抗原,室溫孵育30 min,吸干殘液滴加1500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗),4 孵育過夜。第2天滴加FITC標記的羊抗小鼠IgG1二抗,室溫孵育1 h,然后50%緩沖甘油封氣,熒光顯微鏡下觀察并攝像。    1.2  NSCs的標記和染色    細胞傳至第3代,

6、取適量已包被多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培養(yǎng)基中,37 振蕩60 min,使SPIO終濃度為25 g·ml1,將消化的細胞沉淀加入含SPIO的培養(yǎng)基中孵育12 h完成標記。    NSCs標記后普魯士藍染色:標記后的NSCs換成含10血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置6孔板中培養(yǎng)7 d，去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌3遍,含2亞鐵氰化鉀的6鹽酸溶液常溫孵育30 min,顯微鏡下觀察。    1.3  實驗動物分組與

7、SCI模型的制作    66只成年雄性SD大鼠,體重250300 g,隨機分為假損傷組(A組，6只)、SCI對照組(B組，30只)及細胞移植治療組(C組，30只)3組。B、C兩組參照改良的Allen重物打擊法4制作大鼠脊髓背側(cè)損傷模型：實驗前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥鈉(30 g·L1)按40 mg·kg1腹腔注射麻醉,背部脫毛后俯臥位固定于動物手術(shù)臺上,常規(guī)消毒,腰背部正中切口,逐層分開顯露T8T10椎板,行T9全椎板切除,顯露硬脊膜,鉗夾固定T8及T10棘突,用10.0    g的不銹鋼棒(直徑為2.5 mm)

8、沿帶有刻度的玻璃導管從25 mm高處垂直下落,打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上,后者將打擊力傳遞給脊髓,造成大鼠脊髓不完全損傷,致傷后迅速移開打擊物,逐層縫合。模型成功的判斷標準:打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動,麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。A組僅行T9全椎板切除術(shù)作對照。術(shù)后即刻腹腔注射5%葡萄糖鹽水2 ml,以補充血容量。予青霉素鈉鹽5萬U背外側(cè)肌群肌肉注射預防感染,每天1次,持續(xù)3 d。注意保溫,分籠飼養(yǎng),自由取食,每天8：00及20：00行膀胱按摩協(xié)助排尿,直至建立反射性排尿。    1.4&#

9、160; 細胞移植    將第3代懸浮培養(yǎng)的NSCs懸液用臺式離心機離心5 min(1 000 r·min1),將細胞團以少量培養(yǎng)液吹勻,細胞計數(shù)為105l1。C組動物SCI后9 d于損傷節(jié)段下0.5 cm處用5 l微量注射器以與脊髓水平面呈30°角刺入脊髓組織中,注入2 l NSCs懸液,逐層縫合切口。    1.5  運動功能評分    BBB評分5為總分21分的運動功能評分,考察大鼠后肢的運動、軀干的位置和穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置,表示SCI后

10、大鼠后肢運動功能恢復的過程。BBB評分簡單直觀,易于掌握,與脊髓功能恢復有極好的一致性。分別在動物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周進行盲法BBB評分,由兩名熟悉BBB評分標準的非實驗人員觀察。將動物置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動5 min,記錄動物后肢運動情況。    1.6  MR檢查    于術(shù)后第1、3、5周分別行MR檢查，掃描序列為T2WI。麻醉方法同前。    1.7  統(tǒng)計學處理    所有數(shù)據(jù)以x-±s表示,采用SPS

11、S 12.0統(tǒng)計軟件處理,組間比較采用t 檢驗,P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。    2  結(jié)    果    2.1  NSCs的培養(yǎng)和鑒定情況    圖1  培養(yǎng)7d時NSCs于無血清培養(yǎng)基中    形成的神經(jīng)球  ×200    2.2  普魯士藍染色結(jié)果    顯示100的NSCs胞質(zhì)內(nèi)有細小的藍色氧化鐵顆粒（圖3，見封二）。    2.3  運動功能評分