酶法合成阿莫西林原理

1、酶法合成阿莫西林介紹-內(nèi)酰胺抗生素經(jīng)過多年的發(fā)展，己成為抗生素中的最主要類型之一。由于具有良好的抗菌效力，較低的毒副作用，在臨床上廣泛應(yīng)用，其發(fā)展非常迅速。現(xiàn)全世界耗用量已過萬噸，預(yù)計今后還會增長。其中，青霉素和頭孢菌素為最重要的兩大類-內(nèi)酰胺抗生素。酶法合成技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末70年代初，經(jīng)過 30多年的發(fā)展，現(xiàn)在酶縮合反應(yīng)技術(shù)、產(chǎn)品分離以及固定化酶技術(shù)等方面取得很大的發(fā)展，配套技術(shù)日益完善，具備了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件。 全球著名的-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)廠家如荷蘭DSM公司已有酶法合成的商品頭孢氨芐、阿莫西林等產(chǎn)品面世。由于酶法應(yīng)用于-內(nèi)酰胺抗生素合成，不僅可減少反應(yīng)步驟，而且還可減少廢

2、棄物的產(chǎn)生，有利于保護環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)異，所含雜質(zhì)極少。因此，21世紀(jì)-內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成將是發(fā)展的必然趨勢。 我國酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，與國外先進廠家差距較大。隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展，人們對自身居住環(huán)境的要求，政府對環(huán)保的重視，政府和越來越多的企業(yè)加大“綠色化學(xué)制藥”的研究開發(fā)，特別是加快工業(yè)化生產(chǎn)的推進進程。酶法產(chǎn)品主要有三大特點：一是產(chǎn)品含量穩(wěn)定、變化小，可降低制劑在有效期內(nèi)的檢測風(fēng)險，并且雜質(zhì)低，降解速度慢，對制劑的安全性，尤其是特殊制劑的穩(wěn)定性尤為重要。二是酶法產(chǎn)品生產(chǎn)批量能夠達到化學(xué)法產(chǎn)品的23倍，這既能夠大幅度節(jié)省制劑生產(chǎn)商的檢驗

3、成本，粗略估算原料檢測成本能夠節(jié)約人民幣9元/kg；同時，也便于物流、倉儲和生產(chǎn)管理。三是酶法產(chǎn)品是通過生物酶一步到位生產(chǎn)而得，以純凈水為介質(zhì)，不使用傳統(tǒng)化學(xué)工藝中的特殊化工原料，有機溶劑的使用量大幅度減少90%，廢水排放減少80%，品質(zhì)更純凈。1 青霉素酰化酶的發(fā)展青霉素?；甘菑奈⑸锘蚱浯x產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素?；傅奈⑸飶V泛分布于細菌、放線菌、真菌和酵母中,如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌( Kluyvera) 等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌、柑橘黃單胞菌和大腸桿菌,尤

4、以大腸桿菌最為常用。為了獲得廉價高效的青霉素?；?人們對大腸桿菌等進行了選育和基因改造,用獲得的大腸桿菌天然或工程菌株進行工業(yè)化生產(chǎn)而得到所需要的酶。從大腸桿菌或其他微生物獲得的酶可以以游離的形式使用,也可以被固定在載體上制成固定化酶( Immobilized Enzyme) 使用。與液體酶(酶溶液) 相比,固定化酶的主要優(yōu)點是: 酶和反應(yīng)液易于分離,酶可重復(fù)使用。 穩(wěn)定性高于天然酶。 有利于反應(yīng)過程的連續(xù)化和自動化控制。反應(yīng)液中殘留雜質(zhì)少,有利于產(chǎn)品質(zhì)量控制。產(chǎn)品的生產(chǎn)成本低廉。從微生物發(fā)酵提純的酶溶液制備固定化酶的方法大致可分為吸附法、包埋法和共價結(jié)合法三大類。共價結(jié)合法具有酶與載體結(jié)合

5、牢固、不易脫離等優(yōu)點,因此應(yīng)用較多。其工藝過程為:濃縮酶溶液在緩沖溶液中與交聯(lián)劑(如戊二醛) 和高分子載體進行振蕩偶合,然后過濾洗滌得到固定化酶,所得固定化酶因其載體形態(tài)不同大致分為纖維狀和顆粒狀2 種。近年來使用顆粒狀固定化酶比較普遍。用做固定化酶載體的高分子材料有:聚丙烯纖維、醋酸纖維、聚氨酯泡沫樹脂、環(huán)氧樹脂、丫內(nèi)酯樹脂等。2 青霉素催化內(nèi)酰胺抗生素合成研究酶法合成 一內(nèi)酰胺類抗生素可以通過動力學(xué)或熱力學(xué)控制完成。動力學(xué)控制的合成反應(yīng)的產(chǎn)量取決于酶催化的3種不同反應(yīng)的速率：(1) 一內(nèi)酰胺類化合物的合成反應(yīng)；(2)活化的?；w的水解反應(yīng)；(3)合成的抗生素的水解反應(yīng)。反應(yīng)過程中青霉素酰

6、化酶同樣具有水解活性，通過固定生物催化劑，選擇適宜的溶劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，提供高濃度的活化側(cè)鏈供體及 一內(nèi)酰胺核等一系列條件可以減少水解反應(yīng)。合成過程涉及適宜的親核試劑(如6一氨基青霉烷酸、7一氨基頭孢霉烷酸、7一氨基脫乙酰氧頭孢霉烯酸)，在低pH值條件下的直接?；饔谩５蚿H值條件下，大多數(shù)底物以非解離狀態(tài)存在，有利于合成，因此采用水有機溶劑混合溶劑減少了離子化形式的底物，從而有助于 一內(nèi)酰胺抗生素的合成。Fernandez等在含50(體積分數(shù))的有機溶劑的非常規(guī)介質(zhì)中，利用來自于Ecoli及Kluyvera citrophila的固定化青霉素G?；赋晒Φ睾铣闪丝股亍Ｈ欢?，有機溶劑對酶有一

7、定的抑制作用，從而使酶的活性降低。目前的解決方法主要是利用固定化技術(shù)增強酶在不利介質(zhì)中的穩(wěn)定性，如將酶共價結(jié)合到載體上，使其穩(wěn)定性大大提高。當(dāng)存在高濃度的有機助溶劑時，在固定化酶分子周圍人工建立一個微環(huán)境可以增強酶的穩(wěn)定性，并使酶活性損失最小。酶法縮合過程是一個非常復(fù)雜的動力學(xué)過程,它既可以發(fā)生底物間的縮合反應(yīng),同時又使產(chǎn)物發(fā)生酶解反應(yīng),此種可逆反應(yīng)過程又由同一種酶來催化完成。除了酶本身的因素外,反應(yīng)體系中的其他條件都會對反應(yīng)程度有不同的影響,如:反應(yīng)體系溫度、pH 值,反應(yīng)底物的純度及濃度,反應(yīng)原料帶入的雜質(zhì)和反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物及反應(yīng)體系電解質(zhì)濃度,反應(yīng)產(chǎn)物的濃度等等。3 阿莫西林研究現(xiàn)

8、狀自20世紀(jì)90年代以來,阿莫西林己進入快速發(fā)展的黃金時期,從原料到制劑,該品種每年均以超過20%的幅度增長,已成為抗生素品種中最引人注目、發(fā)展最快的品種之一。工業(yè)上通常使用化學(xué)方法合成阿莫西林,這個過程步驟繁多,條件苛刻,而且需要大量有毒、難于降解的有機試劑,成本很高,污染嚴重。酶促合成可以簡化合成工藝,降低所需成本。而且目前的阿莫西林酶法合成工藝是一種懸濁液懸濁液體系(SuspensionSuspension System)，這一體系指的是反應(yīng)前的混合物主要由懸浮在過飽和液相中的固體反應(yīng)物所組成，反應(yīng)后的混合物則主要由固體產(chǎn)物所組成，也稱為固固體系(SolidSolid System)。在

9、這種體系中，底物和產(chǎn)物主要以不溶的微粒存在，而酶促反應(yīng)則在液相中發(fā)生。與一般的酶促反應(yīng)相比，其單位體積溶劑的產(chǎn)率獲得了很大提高。在熱力學(xué)控制合成的懸濁液懸濁液體系中，如果達到平衡時的理論產(chǎn)物濃度比溶解度高，產(chǎn)物會在平衡之前達到過飽和狀態(tài)并從反應(yīng)混合物中沉淀出來。這個過程一直持續(xù)到一種反應(yīng)物濃度降到溶解度以下，新的平衡建立為止。這樣，起始混合物中的固體反應(yīng)物幾乎都轉(zhuǎn)化成了固體產(chǎn)物，產(chǎn)率得到很大提高。由于反應(yīng)平衡是由產(chǎn)物沉淀推動的，這種懸濁液一懸濁液體系又被稱為沉淀推動法(PrecipitationDriven Synthesis)。動力學(xué)控制合成的懸濁液懸濁液體系則要復(fù)雜的多，包括多個子過程，比

10、如底物和產(chǎn)物的溶解和結(jié)晶，產(chǎn)物的酶促合成，底物和產(chǎn)物的酶促水解等。而且，由于反應(yīng)物和產(chǎn)物都是弱電解質(zhì)，動力學(xué)懸濁液懸濁液體系的各個子過程受pH值的影響特別大，同時也反過來影響pH值。酶法阿莫西林國內(nèi)外生產(chǎn)概況：阿莫西林自問世以來，因療效確切、抗菌譜廣、治療方便的優(yōu)勢，在臨床應(yīng)用上迅速取代青霉素成為用量第一的內(nèi)酰胺抗生素。從國際市場總需求量(可實現(xiàn)銷售產(chǎn)量)來看，阿莫西林近年來依然平穩(wěn)增長，表明該品種仍處產(chǎn)品生命周期的穩(wěn)定期，全球市場年銷量超過3萬噸。阿莫西林的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝為化學(xué)合成。在生產(chǎn)過程中，需要使用大量的有毒有害有機溶劑，以及為實現(xiàn)反應(yīng)順利而必須加入的保護基團。反應(yīng)條件在低溫下運行，一方

11、面增加了動力消耗，另一方面需要使用鹵烴制冷劑。這些，均不符合現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展、綠色工藝的理念。為此，自上世紀(jì)80年代起，業(yè)內(nèi)一直探求阿莫西林綠色生產(chǎn)工藝。2002年8月，DSM率先將酶法阿莫西林生產(chǎn)工業(yè)化。Almeria工廠產(chǎn)能估計為3000噸/年；印度Toansa工廠生產(chǎn)，產(chǎn)能估計為3000噸/年。國內(nèi)酶法阿莫西林研究雖然起步較晚，但進展較快。目前，聯(lián)邦、石藥、華藥、威奇達、魯抗企業(yè)都已建成不同規(guī)模的酶法阿莫西林西林生產(chǎn)線且完成注冊工藝變更實現(xiàn)產(chǎn)品上市銷售。 隨著酶法阿莫西林的大規(guī)模上市，因其在產(chǎn)品質(zhì)量、生產(chǎn)成本、環(huán)保方面的明顯優(yōu)勢，已經(jīng)正在快速取代目前的化學(xué)阿莫西林市場。酶法阿莫西林反應(yīng)機理：

12、1、反應(yīng)路線：阿莫西林動力學(xué)控制的合成是同一酶催化下的三個反應(yīng)過程。即1.阿莫西林的合成，2.對羥基苯甘氨酸甲酯水解，3.阿莫西林水解，酶法合成阿莫西林的過程中產(chǎn)物與底物均被水解形成副產(chǎn)物對羥基苯甘氨酸4，反應(yīng)方程式見圖1.1 圖1.1酶法合成阿莫西林反應(yīng)路線圖2、反應(yīng)機理據(jù)文獻報道，大腸桿菌青霉素G?；复呋铣砂⒛髁值臋C理如下，首先具有活性的SerO羥基親核進攻對羥基苯甲酸酯上的羰基碳原子，形成一種四面體結(jié)構(gòu)的反應(yīng)中間體，由于兩個氨基酸的氫鍵作用使得氧負離子空穴穩(wěn)定。當(dāng)釋放甲醇，羰基復(fù)原后形成共價的酰基-酶復(fù)合體中間體。在接下來的步驟中，?；c6-APA中的氨基結(jié)合生成酰胺鍵，合成阿莫西

13、林，酶復(fù)原，當(dāng)然若?；c水中的羥基結(jié)合，則生成羧基，即發(fā)生對羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)生成對羥苯甘氨酸9。從反應(yīng)的歷程可以推測，在進行阿莫西林的合成過程中，對羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)是不可避免的，只能是通過改變其它條件盡可能降低水解反應(yīng)的速率，進而降低側(cè)鏈酯的消耗，當(dāng)然最根本的還是通過酶特性的改進，改善S/H值。具體反應(yīng)歷程見圖1.28/8圖1.2酶法合成阿莫西林反應(yīng)機理參考文獻 1Influence of 6-aminopenicillanic acid on amoxicillin synthesis and p-hydroxyphenylglycine methyl ester hydro

14、lysis Biocatalysis and Biotransformation 2005,23(2) 2A Kinetic Study of Synthesis of Amoxicillin Using Penicillin G Acylase Immobilized on Agarose3Mathematical modeling of batch and semibatch reactors for the enzymic synthesis of amoxicillin4Use of neural networks in the mathematical modelling of th

15、e enzymic synthesis of amoxicillin catalysed by penicillin G acylase immobilized in chitosan ,World Jourrnal of Microbiology &Biotechnology,24(9),1761-1767;20085Process for preparation of -lactams at constantly high concentration of reactants US60487086 酶法阿莫西林質(zhì)量研究，河北化工，2008，31（4）生物酶反應(yīng)常溫結(jié)晶分離干燥水6-

16、APA側(cè)鏈阿莫西林水溶液阿莫西林工藝路線簡述：將水、側(cè)鏈活性酯（或酯的鹽酸鹽）和6-APA加入反應(yīng)罐，在固定化酶的作用下，反應(yīng)生成阿莫西林。反應(yīng)過程中，以氨水/鹽酸控制pH。反應(yīng)完畢，將分離出的固體阿莫西林及反應(yīng)液混勻、加鹽酸溶解過濾，加氨水進行等電點結(jié)晶。將濕晶進行分離、洗滌、干燥、混粉、磨粉、檢驗、包裝（出口產(chǎn)品可干壓加工成重粉）得成品。1.3酶的實驗技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展歷程青霉素?；甘菑奈⑸锘蚱浯x產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素?；傅奈⑸飶V泛分布于細菌、放線菌、真菌和酵母中,如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌( Kluyvera) 等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌、柑橘黃