免疫組化及特殊染色

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù) Immunohistochemistry Immunohistochemistry techniques techniques 第一節(jié)第一節(jié) 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué) 技術(shù)概述技術(shù)概述（一）發(fā)展簡(jiǎn)史（一）發(fā)展簡(jiǎn)史 n19411941年年CoonsCoons首先用熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)首先用熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功。肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功。 n6060年代年代NakaneNakane建立酶標(biāo)抗體技術(shù)運(yùn)用鐵建立酶標(biāo)抗體技術(shù)運(yùn)用鐵蛋白標(biāo)記蛋白標(biāo)記AbAb技術(shù)技術(shù)n70 70 、80年代多位科學(xué)家改良上述技術(shù)，年代多位科學(xué)家改良上述技術(shù)，建立辣

2、根過(guò)氧化物酶建立辣根過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶（PAPPAP）技術(shù)技術(shù), ,抗生物素抗生物素生物素（生物素（ABC）法法使免疫組織化學(xué)進(jìn)入了應(yīng)用階段。使免疫組織化學(xué)進(jìn)入了應(yīng)用階段。 n20002000年以后各種免疫組化技術(shù)更加成熟年以后各種免疫組化技術(shù)更加成熟, ,使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。態(tài)、功能代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科，是目前其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一。一。定義定義: :是應(yīng)用是應(yīng)用免疫學(xué)免疫學(xué)基

3、本原理基本原理抗原抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的顯色劑的顯色劑(熒光熒光素、酶、金屬離子、同位素素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和肽和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫免疫組織化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或或免疫細(xì)胞化學(xué)技免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)術(shù)(immunocytochemistry)。 將將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，試劑抗原或

4、試劑抗體用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測(cè)定抗原抗體在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測(cè)定抗原抗體復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過(guò)標(biāo)記物的放大作復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過(guò)標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。（二（二）免）免疫組織化學(xué)的原理疫組織化學(xué)的原理n抗原抗原是指能夠刺激是指能夠刺激機(jī)體機(jī)體產(chǎn)生（特異性）產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生免疫免疫效應(yīng)效應(yīng)（特異性反應(yīng)）

5、的物質(zhì)?？乖幕ㄌ禺愋苑磻?yīng)）的物質(zhì)?？乖幕咎匦杂袃煞N，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性 n病原微生物病原微生物 在醫(yī)療中將病原微生物制成疫苗進(jìn)行在醫(yī)療中將病原微生物制成疫苗進(jìn)行預(yù)防預(yù)防接種接種，可以提高人的，可以提高人的免疫力免疫力。 n嗜異性抗原嗜異性抗原 一類與種屬特異性無(wú)關(guān)的、存在于人一類與種屬特異性無(wú)關(guān)的、存在于人以及某些以及某些動(dòng)物動(dòng)物、植物植物、微生物的性質(zhì)相同的抗原。、微生物的性質(zhì)相同的抗原。 n腫瘤抗原腫瘤抗原 由物理的、化學(xué)的

6、因素或某些病毒誘發(fā)由物理的、化學(xué)的因素或某些病毒誘發(fā)的的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤，其細(xì)胞中或細(xì)胞表面均出現(xiàn)特異性腫瘤，其細(xì)胞中或細(xì)胞表面均出現(xiàn)特異性抗原，稱為抗原，稱為腫瘤特異性抗原腫瘤特異性抗原。已證實(shí)在某些人類腫瘤。已證實(shí)在某些人類腫瘤中心存在著與病毒密切相關(guān)的抗原。中心存在著與病毒密切相關(guān)的抗原。 n同種異體抗原同種異體抗原n動(dòng)物免疫血清動(dòng)物免疫血清與人類有關(guān)的抗原與人類有關(guān)的抗原 n抗體抗體（antibody）指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在）指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原抗原刺激下，由刺激下，由B淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞記憶細(xì)胞增增殖分化成的殖分化成的漿細(xì)胞漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)

7、生抗原發(fā)生特異性特異性結(jié)合的免疫球蛋白。結(jié)合的免疫球蛋白。 世界著名抗體公司世界著名抗體公司 nSanta公司、公司、Abcam公司、公司、nAbgent公司、公司、Proteintech Group、Cell Signaling Technology（CST）、）、n羅氏公司（羅氏公司（Roche） 它它借助于借助于熒光素、酶熒光素、酶等標(biāo)記抗體等標(biāo)記抗體與組織切片或細(xì)胞涂片中相關(guān)與組織切片或細(xì)胞涂片中相關(guān)抗原抗原相相結(jié)合，由于熒光素所發(fā)熒光可用熒光結(jié)合，由于熒光素所發(fā)熒光可用熒光顯微鏡檢出，而酶可經(jīng)一定的顯色處顯微鏡檢出，而酶可經(jīng)一定的顯色處理，呈現(xiàn)醒目的陽(yáng)性色彩，從而可準(zhǔn)理，呈現(xiàn)醒目的陽(yáng)

8、性色彩，從而可準(zhǔn)確定位欲測(cè)定的抗原物質(zhì)。確定位欲測(cè)定的抗原物質(zhì)。 標(biāo)記物標(biāo)記物熒光素、酶熒光素、酶標(biāo)記標(biāo)記抗抗 體體抗抗 原原熒光熒光陽(yáng)性色彩陽(yáng)性色彩顯微鏡觀察顯微鏡觀察組織抗原組織抗原抗體抗體 酶酶熒光素?zé)晒馑?三大系統(tǒng)三大系統(tǒng) 本技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)原理本技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)原理來(lái)識(shí)別待測(cè)抗原，再通過(guò)酶和底物來(lái)識(shí)別待測(cè)抗原，再通過(guò)酶和底物的作用外加顯色劑，將上述反應(yīng)顯的作用外加顯色劑，將上述反應(yīng)顯示出來(lái)。示出來(lái)。 免疫組免疫組織化學(xué)織化學(xué)識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別系統(tǒng)聯(lián)結(jié)系統(tǒng)聯(lián)結(jié)系統(tǒng)顯示系統(tǒng)顯示系統(tǒng)n識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別系統(tǒng)是指特異性抗體識(shí)別組織是指特異性抗體識(shí)別組織或細(xì)胞中的靶抗原?？乖贵w的特或細(xì)胞中的靶抗原?？乖?/p>

9、抗體的特異性結(jié)合是本技術(shù)的基本依異性結(jié)合是本技術(shù)的基本依據(jù)。據(jù)。n聯(lián)結(jié)系統(tǒng)聯(lián)結(jié)系統(tǒng)由聯(lián)結(jié)抗體構(gòu)成。它的作由聯(lián)結(jié)抗體構(gòu)成。它的作用是聯(lián)接識(shí)別系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)。用是聯(lián)接識(shí)別系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)。 n顯示系統(tǒng)顯示系統(tǒng)的目的是使抗原抗體間的的目的是使抗原抗體間的特異性結(jié)合變?yōu)槿庋劭梢?jiàn)。因此顯特異性結(jié)合變?yōu)槿庋劭梢?jiàn)。因此顯示系統(tǒng)由示系統(tǒng)由標(biāo)記酶，底物和顯色劑組標(biāo)記酶，底物和顯色劑組成成，以在靶抗原存在位點(diǎn)上形成有，以在靶抗原存在位點(diǎn)上形成有色沉淀。色沉淀。特點(diǎn)特點(diǎn)： 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高靈敏度高定位準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)定位準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)又能夠?qū)⑿螒B(tài)、功能及代謝的研又能夠?qū)⑿螒B(tài)、功能及代謝的研究有機(jī)結(jié)合

10、起來(lái)。究有機(jī)結(jié)合起來(lái)。IHC方法方法1 1 過(guò)過(guò)去用過(guò)的方法去用過(guò)的方法ABCABC法，法，SPSP法法。三步三步法，使用生物素法，使用生物素2 2 目目前最常用的方法前最常用的方法二步法：二步法： EnliVisionEnliVision顯色系統(tǒng)顯色系統(tǒng)（即用型非生物素免疫組化（即用型非生物素免疫組化EnliVisionTM plusEnliVisionTM plus檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒 ）n將多個(gè)抗鼠和抗兔的將多個(gè)抗鼠和抗兔的IgGIgG分子二抗與辣根過(guò)氧分子二抗與辣根過(guò)氧化物酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)大化物酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)大分子多聚體（分子多聚體（polymer

11、polymer），直接放大信號(hào)），直接放大信號(hào)40-5040-50倍。倍。n敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。物素干擾）。3 3 最新一代的免疫組化最新一代的免疫組化 NovolinkNovolink Polymer Polymer法：法：使用小分子聚合物（減少細(xì)胞薄膜硬脂的阻使用小分子聚合物（減少細(xì)胞薄膜硬脂的阻礙，比傳統(tǒng)中的大分子聚合物染色更顯著），礙，比傳統(tǒng)中的大分子聚合物染色更顯著），信號(hào)放大更強(qiáng)，還可以檢測(cè)到組織中低濃度信號(hào)放大更強(qiáng)，還可以檢測(cè)到組織中低濃度的抗原。的抗原。 IHC方法方法 EnliVisionEnliVisi

12、on法的工作程法的工作程序序： 切切片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，APESAPES）nH H2 2O O2 2處處理（理（阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶），蒸餾水漂洗阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶），蒸餾水漂洗n組織切片的預(yù)處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復(fù)，酶組織切片的預(yù)處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復(fù)，酶消化消化暴露出暴露出抗原決定簇），抗原決定簇），TBSTBS漂洗漂洗n內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的阻斷n一抗孵育，一抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗n二抗孵育，二抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗nDABDAB顯色，蒸餾水中止反應(yīng)顯色，蒸餾

13、水中止反應(yīng)n蘇木素復(fù)染及封片蘇木素復(fù)染及封片 IHCIHC技術(shù)的基本操作流程技術(shù)的基本操作流程切片切片烤片烤片脫蠟水化脫蠟水化H H2 2O O2 2處理處理熱修復(fù)熱修復(fù)一抗一抗二抗二抗EnlivisionEnlivision試劑試劑DABDAB顯色顯色蘇木素復(fù)染蘇木素復(fù)染IHCIHC染色結(jié)果的判讀原則染色結(jié)果的判讀原則玻片干燥造成的玻片干燥造成的“邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)”假假陽(yáng)陽(yáng)性性未阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶未阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后I. I. 注意影響注意影響IHCIHC結(jié)果判讀的因素結(jié)果判讀的因素酒精固定酒精固定福爾馬林固定福爾馬林固定胰腺，胰腺，insul

14、in平滑肌肉瘤，平滑肌肉瘤，SMA氣泡影響抗體抗體反應(yīng)氣泡影響抗體抗體反應(yīng)冰凍切片冰凍切片石蠟切片石蠟切片結(jié)腸，結(jié)腸，CEA假陰性：注意內(nèi)對(duì)照假陰性：注意內(nèi)對(duì)照假假陰陰性性蛋白酶處理后蛋白酶處理后蛋白酶未處理蛋白酶未處理皮膚，皮膚，IV膠原膠原甲狀旁腺，甲狀旁腺，PTH微波未處理微波未處理微波處理后微波處理后II. II. 染色的特異性判定染色的特異性判定MitochondoriaMitochondoriaApicalApicalmembranemembraneBasolateralBasolateral membranemembranePlasma Plasma MembraneMembra

15、ne+ +PERPER GolgiGolgiPlasma Plasma membranemembranePER + PER + GolgiGolgiGolgiGolgiapparatusapparatusEndocrineEndocrinegranulegranuleEndocrine granuleEndocrine granuleLysosomeLysosomeCytosolCytosolNucleusNucleusCytoskeletoCytoskeleton nl amylaseamylasel lysozomelysozomel PAcPPAcPl S-100 S-100 l NSE

16、 NSEl prefixationprefixation diffusion diffusion artifact artifactl CEACEAl EMA EMAl ALP ALPlCD10CD10l cytochromecytochrome P-450 P-450l immunogloblinimmunogloblinl AFP AFPl HCG HCGl factor -RA factor -RAl prolactinprolactin in in activated activated pituicytepituicytel SCSCl EGFR EGFRlE-cadE-cadl L

17、euLeu 4 4l HLA-DR HLA-DRl CEA, EMA, CEA, EMA, SC, CA19-9 SC, CA19-9 in cancer cell in cancer celll LeuLeu 1 1l LCA LCAl PALP in PALP in seminomaseminoma cell celllCerb-B2Cerb-B2l SC, AFPSC, AFP EMA, EMA, immunoglobulin immunoglobulin in special in special conditions conditionsl chromograninchromogra

18、nin A Al serotonin serotoninl Peptide Peptide hormonehormonel DNA polymerase DNA polymerase l S-100 (occasional) S-100 (occasional)l estrogen receptor estrogen receptorl keratin inkeratin in carcinoidcarcinoid, , mesotheliomamesotheliomal vimentinvimentinl keratin inkeratin in adenocarcinomaadenocar

19、cinoma hepatocytehepatocytel actinactinl keratinkeratinl vimentinvimentinl GFAP GFAPl tubulintubulin細(xì)胞膜陽(yáng)性細(xì)胞膜陽(yáng)性n細(xì)胞粘附分子：細(xì)胞粘附分子： E- E-cadherincadherin、CD31CD31、CD56CD56等等n交聯(lián)膜蛋白分子：交聯(lián)膜蛋白分子：catenincatenin、dystrophindystrophin 等等n細(xì)胞表面受體：細(xì)胞表面受體：EGFREGFR、c-erbB2c-erbB2、c-kitc-kit/CD117/CD117（酪氨酸激酶受體）等酪氨酸激酶受體

20、）等n絕大多數(shù)白細(xì)胞抗原絕大多數(shù)白細(xì)胞抗原: : LCALCA、CD20CD20、CD2CD2、CD5CD5等等n表面或跨膜蛋白：表面或跨膜蛋白：VillinVillin、BerEP4BerEP4、EMAEMA、 CEA CEA、CA125CA125、EBV-LMP1EBV-LMP1等等細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞核陽(yáng)性n細(xì)胞周期素蛋白細(xì)胞周期素蛋白：cyclinscyclins、cyclincyclin 依賴激依賴激酶酶( (cdkcdk) )、cdkcdk 抑制劑抑制劑 ( (如如 p16)p16)等等n細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白：Ki67Ki67、PCNAPCNAn轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子：MyoD1M

21、yoD1、myogeninmyogenin、TTF-1TTF-1、CDX2CDX2、PAX5PAX5n腫瘤抑制基因腫瘤抑制基因：如：如 p53p53、p63p63、RbRb、WT1WT1n基因錯(cuò)配產(chǎn)物基因錯(cuò)配產(chǎn)物：如：如 MLH1MLH1、MSH2MSH2n細(xì)胞核酶細(xì)胞核酶：如 TdTn類固醇激素受體類固醇激素受體：如 ER、PR、ARn細(xì)胞核鈣結(jié)合蛋白細(xì)胞核鈣結(jié)合蛋白：如 S100蛋白、calretininn定位細(xì)胞核的病毒定位細(xì)胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周）nNeuN：neuronal nuclei，表達(dá)于成熟的神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)顆粒狀陽(yáng)性細(xì)胞漿內(nèi)顆粒狀陽(yáng)性-定位于細(xì)胞器定位于

22、細(xì)胞器n溶酶體顆粒溶酶體顆粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidasen黑色素小體和前黑色素小體黑色素小體和前黑色素小體：如 HMB45、Melan-An細(xì)胞毒顆粒細(xì)胞毒顆粒：如TIA-1、granzyme Bn線粒體線粒體: 如抗線粒體抗體, HEP-PAR1n神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒：各種激素（如PTH、 ACTH、insulin）、CgA、SynnW-P W-P 小體小體: F-VIII相關(guān)抗原n分泌顆粒分泌顆粒：如BRST-2、surfactant、PSAn細(xì)胞內(nèi)微生物細(xì)胞內(nèi)微生物：如弓形蟲(chóng)細(xì)胞漿纖維狀陽(yáng)性細(xì)胞漿纖維狀陽(yáng)性-中間絲或微絲中間絲或微絲中間絲中間絲

23、;CK;CK; ;VimentinVimentin; ;DesminDesminGFAPGFAP（glialglial fibrillaryfibrillary acidic protein acidic protein，膠質(zhì)纖維酸性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白 ）NFNF（NeurofilamentNeurofilament，神經(jīng)元胞漿，神經(jīng)元胞漿節(jié)細(xì)胞節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤，副節(jié)瘤神經(jīng)瘤，副節(jié)瘤/ /嗜鉻細(xì)胞瘤嗜鉻細(xì)胞瘤，神經(jīng)母細(xì)胞，神經(jīng)母細(xì)胞瘤）瘤）NestinNestin：巢蛋白，神經(jīng)前體細(xì)胞巢蛋白，神經(jīng)前體細(xì)胞彌漫或片狀的細(xì)胞漿陽(yáng)性彌漫或片狀的細(xì)胞漿陽(yáng)性n蛋白分布在細(xì)胞內(nèi)液、大量的微囊及內(nèi)質(zhì)蛋白分布在

24、細(xì)胞內(nèi)液、大量的微囊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中網(wǎng)中n如如: :myoglobinmyoglobin、hemoglobinhemoglobin、albuminalbumin、AFPAFP、 NSENSE、cytoplasmic Igcytoplasmic Ig、CD3CD3n病毒顆粒病毒顆粒/ /蛋白蛋白n如如: :HBsAgHBsAg（常在核旁著色）（常在核旁著色）n從細(xì)胞間液吸收的蛋白從細(xì)胞間液吸收的蛋白n如如: : IgIg、 albuminalbumin 分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷；分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷； 證實(shí)內(nèi)分泌腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；證實(shí)內(nèi)分泌腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤； 應(yīng)用腫瘤胚胎性抗原

25、診斷某些腫瘤，如癌應(yīng)用腫瘤胚胎性抗原診斷某些腫瘤，如癌胚抗原（胚抗原（CEACEA）對(duì)胃腸道癌、甲胎蛋白（）對(duì)胃腸道癌、甲胎蛋白（AFPAFP）對(duì)肝癌和卵巢內(nèi)胚竇癌診斷有幫助；對(duì)肝癌和卵巢內(nèi)胚竇癌診斷有幫助； （三）免疫組化的應(yīng)用（三）免疫組化的應(yīng)用 有時(shí)可幫助確定腫瘤的良惡性，如應(yīng)用免有時(shí)可幫助確定腫瘤的良惡性，如應(yīng)用免疫球蛋白輕鏈疫球蛋白輕鏈和和來(lái)鑒別濾泡性惡性淋來(lái)鑒別濾泡性惡性淋巴瘤和濾泡性反應(yīng)性增生；巴瘤和濾泡性反應(yīng)性增生； 研究某些癌癥與病毒的關(guān)系，如肝癌與乙研究某些癌癥與病毒的關(guān)系，如肝癌與乙型肝炎病毒、鼻咽癌與型肝炎病毒、鼻咽癌與EBEB病毒、宮頸癌與病毒、宮頸癌與乳頭狀瘤病毒等

26、的關(guān)系；乳頭狀瘤病毒等的關(guān)系； 為腫瘤治療的選擇提供依據(jù)，如乳腺為腫瘤治療的選擇提供依據(jù)，如乳腺癌檢測(cè)雌、孕激素受體（癌檢測(cè)雌、孕激素受體（ERER、PRPR）呈陽(yáng)）呈陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)用他莫昔芬（三苯氧胺）治療性時(shí)，應(yīng)用他莫昔芬（三苯氧胺）治療可預(yù)期獲得較好的療效；可預(yù)期獲得較好的療效； 檢測(cè)癌基因和抑癌基因蛋白產(chǎn)物（如檢測(cè)癌基因和抑癌基因蛋白產(chǎn)物（如c-erbB2c-erbB2，p53p53）、增生活性抗原（如）、增生活性抗原（如Ki-67Ki-67，PCNAPCNA）用來(lái)估計(jì)腫瘤的預(yù)后。）用來(lái)估計(jì)腫瘤的預(yù)后。 免疫組化在臨床診斷中免疫組化在臨床診斷中 應(yīng)用病例示范（應(yīng)用病例示范（Case 1Ca

27、se 1）n臨床病史資料：臨床病史資料：4848歲，男性，胃活檢標(biāo)歲，男性，胃活檢標(biāo)本取自胃大彎部位。本取自胃大彎部位。H&EH&E染色切片描述腫染色切片描述腫瘤細(xì)胞顯示在間質(zhì)中呈癌巢樣，鄰近的瘤細(xì)胞顯示在間質(zhì)中呈癌巢樣，鄰近的腺體腸上皮化生，間質(zhì)中的不規(guī)則的巢腺體腸上皮化生，間質(zhì)中的不規(guī)則的巢狀結(jié)構(gòu)待診斷狀結(jié)構(gòu)待診斷. .nH&E染色 n 首先選擇首先選擇Cytokeratin單克隆廣譜角蛋白抗體在單克隆廣譜角蛋白抗體在細(xì)胞巢中呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，證明是上皮來(lái)源性的細(xì)胞巢中呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，證明是上皮來(lái)源性的腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺上皮陽(yáng)性，腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺

28、上皮陽(yáng)性，腫瘤性的腺體在底部。腫瘤性的腺體在底部。n 腫瘤細(xì)胞再進(jìn)一步進(jìn)行腫瘤細(xì)胞再進(jìn)一步進(jìn)行cytokeratin 7 /cytokeratin 20染色，染色證實(shí)在腫瘤染色，染色證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中同時(shí)缺少細(xì)胞中同時(shí)缺少cytokeratin 7 /cytokeratin 20的表達(dá)。在這張圖片中腸上皮的表達(dá)。在這張圖片中腸上皮細(xì)胞細(xì)胞cytokeratin 20陽(yáng)性與鄰近的腫瘤細(xì)胞陰性形成明顯的對(duì)照。陽(yáng)性與鄰近的腫瘤細(xì)胞陰性形成明顯的對(duì)照。cytokeratin 7 and 20在臨床中使用中，如果同時(shí)都不表達(dá)，特異性地表示在臨床中使用中，如果同時(shí)都不表達(dá)，特異性地表示腫瘤細(xì)胞為來(lái)源于一些上

29、皮的腫瘤（腫瘤細(xì)胞為來(lái)源于一些上皮的腫瘤（subset of epithelial tumors），包括腎），包括腎細(xì)胞癌，前列腺癌、肝細(xì)胞癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等。細(xì)胞癌，前列腺癌、肝細(xì)胞癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等。 SynaptophysiSynaptophysin n 測(cè)定測(cè)定SynaptophysiSynaptophysin n所有腫瘤細(xì)所有腫瘤細(xì)胞中都顯示出胞中都顯示出較強(qiáng)的陽(yáng)性表較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)，而在腫瘤達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中包繞的細(xì)胞中包繞的腸腺體呈陰性腸腺體呈陰性診斷診斷: :神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌癌分泌癌 Ki-67 Ki-67 測(cè)定測(cè)定: :Ki-67 Ki-67 在腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)非常低的表達(dá)，在

30、腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)非常低的表達(dá)，Ki-67 Ki-67 染色同樣證實(shí)為腫染色同樣證實(shí)為腫瘤細(xì)胞增殖率低，腸腺上皮中瘤細(xì)胞增殖率低，腸腺上皮中Ki-67 Ki-67 高表達(dá)，可能是胃小凹腺體，與高細(xì)胞增殖高表達(dá)，可能是胃小凹腺體，與高細(xì)胞增殖率的腺上皮相比率的腺上皮相比Ki-67Ki-67在腫瘤細(xì)胞中缺少胞核表達(dá)。這些在腫瘤細(xì)胞中缺少胞核表達(dá)。這些Ki-67 Ki-67 標(biāo)記陰性的腫瘤標(biāo)記陰性的腫瘤細(xì)胞是低分級(jí)的神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞，細(xì)胞是低分級(jí)的神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞，第二節(jié)第二節(jié) 免疫組織化學(xué)染色前免疫組織化學(xué)染色前的基本技術(shù)的基本技術(shù)( (一一) ) 樣樣品的取材品的取材 組織標(biāo)本組織標(biāo)本包括石蠟切片（病

31、理切片和包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。組織芯片）和冰凍切片。細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞標(biāo)本后者包括組織印片和細(xì)胞涂片。后者包括組織印片和細(xì)胞涂片。n 其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究究. . 樣品制備的第一步就是取材，取材的好樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所以必須做好準(zhǔn)備工壞關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所以必須做好準(zhǔn)備工作。作。 現(xiàn)將現(xiàn)將組織取材的

32、原則和具體要求組織取材的原則和具體要求分述如下：分述如下： 1 1 刀刀剪銳利、潔凈。剪銳利、潔凈。 2 2 快快速、準(zhǔn)確、盡量保持生活狀態(tài)，速、準(zhǔn)確、盡量保持生活狀態(tài)， 力爭(zhēng)力爭(zhēng)1 1分鐘之內(nèi)放入固定液，最遲不能超分鐘之內(nèi)放入固定液，最遲不能超 過(guò)過(guò)3 3分鐘。分鐘。 3 3 一一刀切取，切取應(yīng)在蠟版或?yàn)V紙上進(jìn)刀切取，切取應(yīng)在蠟版或?yàn)V紙上進(jìn) 行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動(dòng)作。行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動(dòng)作。4 4 低低溫操作，防止自溶現(xiàn)象，通常以溫操作，防止自溶現(xiàn)象，通常以 0-40-4的低溫條件下操作為佳。的低溫條件下操作為佳。5 5、樣品大小適當(dāng)，光鏡樣品一般在、樣品大小適當(dāng)，光鏡樣品一般

33、在1.0cm1.0cm以內(nèi)，以內(nèi)，免疫組織化學(xué)樣品大約在：免疫組織化學(xué)樣品大約在：2cm2cm1.5cm1.5cm0.3cm0.3cm 厚度控制在厚度控制在0.3cm0.3cm 。電鏡樣品規(guī)格要求切成。電鏡樣品規(guī)格要求切成0.5-1.0cm0.5-1.0cm共共3 3小塊。小塊。 對(duì)對(duì)病理組織病理組織取材還應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：取材還應(yīng)做到以下幾點(diǎn)： 取材部位必須是主要病變區(qū)；取材部位必須是主要病變區(qū)； 必須取病灶與正常組織的交界區(qū)；必須取病灶與正常組織的交界區(qū)； 必要時(shí)取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對(duì)照。必要時(shí)取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對(duì)照。 細(xì)胞標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本的取材印片法印片法: :常用于活檢標(biāo)本常用于

34、活檢標(biāo)本沉淀法沉淀法: :主要用于胸水、腹水、尿液等主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴結(jié)、軟組織、穿刺抽吸法：常用于淋巴結(jié)、軟組織、 腎、肝、肺等組織。腎、肝、肺等組織。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：細(xì)胞經(jīng)離心后細(xì)胞粘附性較差，標(biāo)記過(guò)細(xì)胞經(jīng)離心后細(xì)胞粘附性較差，標(biāo)記過(guò)程中容易脫片，載玻片應(yīng)涂粘附劑程中容易脫片，載玻片應(yīng)涂粘附劑細(xì)胞總數(shù)應(yīng)以細(xì)胞總數(shù)應(yīng)以10105 5個(gè)為宜，并集中在直個(gè)為宜，并集中在直徑徑0.6-1.0cm0.6-1.0cm的圓圈內(nèi)。的圓圈內(nèi)。富于粘液的標(biāo)本，未經(jīng)處理不宜作免疫富于粘液的標(biāo)本，未經(jīng)處理不宜作免疫組化標(biāo)記。組化標(biāo)記。（二）、組織固定（二）、組織固定 2 2、免疫

35、組化標(biāo)本固定時(shí)，好的固定劑應(yīng)、免疫組化標(biāo)本固定時(shí)，好的固定劑應(yīng) 滿足哪些要求？滿足哪些要求？ 1 1、目的、目的: :固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)、抗原完整性固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)、抗原完整性能快速固定抗原；能快速固定抗原；防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散；防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散；固定后的抗原能被抗體識(shí)別，固定后的抗原能被抗體識(shí)別， 不影響抗原抗體反應(yīng)。不影響抗原抗體反應(yīng)。甲醛固定液：分類較多，最常用的甲醛固定液：分類較多，最常用的4%4%多多聚甲醛固定液，對(duì)于冰凍切片，甲醛固聚甲醛固定液，對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；定有時(shí)比冰凍丙酮好；n主要特點(diǎn)：主要特點(diǎn)：組織穿透性好，收縮性小組織穿透性好，收縮性小n但對(duì)于不同的組織和抗

36、原，可選用不同但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比的固定液。有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購(gòu)置前注較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書(shū)。意說(shuō)明書(shū)。3 3、各種固定液：、各種固定液： BouinBouin, ,S S固定液：飽和苦味酸固定液：飽和苦味酸750ml750ml，甲醛甲醛250ml250ml，冰醋酸，冰醋酸50ml50ml，其對(duì)組織的，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的

37、長(zhǎng)期保存。保存。 PLPPLP液：即高碘酸鈉液：即高碘酸鈉- -賴氨酸賴氨酸- -多聚多聚甲醛，適于固定石蠟切片。甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好?？乖员４孑^好。（三）、組織脫水浸蠟及包埋（三）、組織脫水浸蠟及包埋脫水透明等過(guò)程需在脫水透明等過(guò)程需在4 4或室溫或室溫下進(jìn)行，避免下進(jìn)行，避免組織抗原的損失；組織抗原的損失；為使組織充分脫水、透明和浸蠟，組織塊的厚為使組織充分脫水、透明和浸蠟，組織塊的厚度以度以1.0-1.5mm1.0-1.5mm為宜為宜; ;浸蠟及包埋過(guò)程中浸蠟及包埋過(guò)程中, ,石蠟溫度應(yīng)保

38、持在石蠟溫度應(yīng)保持在6060或或6060以下以下, ,用熔點(diǎn)低的石蠟包埋用熔點(diǎn)低的石蠟包埋; ;制備蠟塊在較低的溫度進(jìn)行制備蠟塊在較低的溫度進(jìn)行, ,故試劑處理時(shí)應(yīng)故試劑處理時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)適當(dāng)延長(zhǎng), ,否則會(huì)給切片帶來(lái)困難否則會(huì)給切片帶來(lái)困難常用的包埋法常用的包埋法石蠟包埋石蠟包埋冰凍干燥包埋冰凍干燥包埋塑料包埋塑料包埋（四）組織切片中載玻片的處理（四）組織切片中載玻片的處理n 抗原修復(fù)過(guò)程中，由于高溫、高壓、輻射抗原修復(fù)過(guò)程中，由于高溫、高壓、輻射n等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證n試驗(yàn)的正常進(jìn)行，可選用試驗(yàn)的正常進(jìn)行，可選用Poly-L-Lysin

39、e Poly-L-Lysine 、nZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTMZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或或nZLI-9005 ZLI-9005 等幾種試劑，對(duì)已常規(guī)清洗的載等幾種試劑，對(duì)已常規(guī)清洗的載n玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：玻片進(jìn)行處理。具體方法如下： Poly-L-LysinePoly-L-Lysine：將洗凈、干燥的：將洗凈、干燥的載玻片放入以載玻片放入以1:101:10比例去離子水稀比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5 5分分鐘，鐘，6060o oC C烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過(guò)烤箱烘烤一

40、小時(shí)或室溫過(guò)夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。器具均為非玻璃制品。 （五）抗原修復(fù)（五）抗原修復(fù)n 抗原修復(fù)是指石蠟、冰凍、火抗原修復(fù)是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)（棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)（IHCIHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過(guò)露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過(guò)程。程。 石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有那些方法石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有那些方法

41、？ 石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇定簇, ,同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽隱蔽. .所以要求在進(jìn)行所以要求在進(jìn)行IHCIHC染色時(shí)染色時(shí), ,需要先進(jìn)行需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露抗原修復(fù)或暴露, ,即將固定時(shí)分子之間所形成即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。 常用的抗原修復(fù)方法有常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱高壓加熱法，酶消

42、化法，水煮加熱法法等，常用的修復(fù)液是等，常用的修復(fù)液是pH6.0pH6.0的的0.01mol/L0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。的檸檬酸鹽緩沖液?？乖迯?fù)方法抗原修復(fù)方法一、熱修復(fù)一、熱修復(fù) n1 1、微波爐加熱法、微波爐加熱法 將玻片分別插入抗原修復(fù)盒中，以保證各將玻片分別插入抗原修復(fù)盒中，以保證各部位的玻片受熱均勻。部位的玻片受熱均勻。 n在抗原修復(fù)盒中加入抗原修復(fù)液，蓋上帶有在抗原修復(fù)盒中加入抗原修復(fù)液，蓋上帶有小孔的蓋子。小孔的蓋子。 n將塑料盒置于微波爐中央，加熱將塑料盒置于微波爐中央，加熱 2x5min 2x5min 。兩次加熱之間，加入兩次加熱之間，加入 50ml 50ml

43、蒸餾水。蒸餾水。 加熱加熱過(guò)程中，組織標(biāo)本不可干燥。過(guò)程中，組織標(biāo)本不可干燥。 第二次處理后，將微波爐中的修復(fù)盒移至第二次處理后，將微波爐中的修復(fù)盒移至室溫冷卻室溫冷卻 15-20 15-20 分鐘。分鐘。 不要打開(kāi)蓋子！不要打開(kāi)蓋子！ 蒸餾水沖洗。蒸餾水沖洗。 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶并置于蒸餾水中。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶并置于蒸餾水中。 用用 TBS TBS 或或 PBS PBS 液沖洗。液沖洗。 進(jìn)行免疫組化染色。進(jìn)行免疫組化染色。 在壓力鍋中放入在壓力鍋中放入 1500-3000ml 1500-3000ml 抗原修抗原修復(fù)緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入復(fù)緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入

44、切片架并放入沸騰的修復(fù)緩沖液中。后加切片架并放入沸騰的修復(fù)緩沖液中。后加閥，使之加壓閥，使之加壓2 2分鐘。后將壓力鍋置于流分鐘。后將壓力鍋置于流水槽或繼續(xù)冷卻水槽或繼續(xù)冷卻 20 20 分鐘（減壓）。取出分鐘（減壓）。取出切片，蒸餾水沖洗，移至切片，蒸餾水沖洗，移至 TBS TBS 或或 PBS PBS 液液中，以避免組織干燥。中，以避免組織干燥。 以下同微波爐修復(fù)法以下同微波爐修復(fù)法 。 2、壓力鍋法、壓力鍋法n 抗原修復(fù)的方法選擇，關(guān)系到組織抗原修復(fù)的方法選擇，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對(duì)免疫組化染色抗原能否暴露充分，這對(duì)免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的效果有很大影響。

45、因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對(duì)某抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如些細(xì)胞內(nèi)抗原（如FasFas、BaxBax、FF等）和等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如細(xì)胞間質(zhì)抗原（如LamininLaminin、CoIVCoIV等）則等）則需要用酶消化法處理切片。需要用酶消化法處理切片。 二、酶消化方法二、酶消化方法n1 1、胰蛋白酶處理：、胰蛋白酶處理： nA A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。 nB B 室溫室溫 37 37 孵育孵育 20-40 20-40 分鐘，孵育時(shí)間分鐘，孵育時(shí)間的長(zhǎng)短依福爾馬林固定時(shí)間及所測(cè)抗原情況的長(zhǎng)短依福爾馬林固定

46、時(shí)間及所測(cè)抗原情況而定。而定。 nC C 蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。 nD D 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。 nE E 免疫組化染色。免疫組化染色。 n2 2、胃蛋白酶處理、胃蛋白酶處理 nA A 滴加胃蛋白酶工作液于組織上。滴加胃蛋白酶工作液于組織上。 nB B 最佳消化時(shí)間取決于福爾馬林的固定最佳消化時(shí)間取決于福爾馬林的固定時(shí)間，時(shí)間， 37 37 預(yù)熱。一般消化預(yù)熱。一般消化 10 10 分鐘，分鐘，長(zhǎng)至長(zhǎng)至 30 30 分鐘。分鐘。 nC C 以下同胰蛋白酶處理方法以下同胰蛋白酶處理方法 3 ,4,5 3 ,4,5 。 n注：過(guò)度消化將導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的丟

47、失，注：過(guò)度消化將導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的丟失，并引起組織脫片并引起組織脫片三、綜合方法三、綜合方法 n微波爐加胰酶修復(fù)法：微波爐加胰酶修復(fù)法： n將組織切片置于盛有將組織切片置于盛有 50ml 50ml 修復(fù)液的塑料盒中，封修復(fù)液的塑料盒中，封口膜封口后加熱口膜封口后加熱 5 5 分鐘。分鐘。 n冷卻后打開(kāi)，將切片置于冷卻后打開(kāi)，將切片置于 37 37 預(yù)熱的蒸餾水中，預(yù)熱的蒸餾水中，胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化。 n室溫胰蛋白酶處理室溫胰蛋白酶處理 30 30 秒鐘。秒鐘。 n蒸餾水沖洗。蒸餾水沖洗。 n阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，置蒸餾水中。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，置蒸餾水中。 n免疫組化染色。免疫組化染色

48、。操作中還應(yīng)注意如下問(wèn)題：操作中還應(yīng)注意如下問(wèn)題：n1 1、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。2 2、熱處理時(shí)要防止切片干燥。、熱處理時(shí)要防止切片干燥。3 3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法。復(fù)方法。4 4、一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間一定保、一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間一定保持一致。持一致。n5 5、注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變、注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變( (一般經(jīng)高溫修復(fù)后一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會(huì)無(wú)明顯的破壞，而對(duì)細(xì)胞核的影響較大，胞漿會(huì)無(wú)明顯的破壞，而對(duì)細(xì)胞核的影響較大，會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象，而經(jīng)酶水會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象，而經(jīng)酶水解的切片，其細(xì)胞漿破壞視消化時(shí)間而異，但解的切片，其細(xì)胞漿破壞視消化時(shí)間而異，但核破壞較輕核破壞較輕) )。6 6、如果在常用的緩沖液中無(wú)法實(shí)現(xiàn)