CCK-8操作說明與檢測步驟

1、DOJINDC操作說明細胞活性檢測1. 在96孔板中接種細胞懸液 100 ml /孔。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 在37 C, 5% CO2 的條件下 。2. 向每孔參加 10 ml 的 CCK- 8溶液 注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 值的讀 數 。3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育 1-4 小時。4. 用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。5. 如果暫時不測定值，打算以后測定的話，可以向每孔中參加10 ml 0.1 M HCI溶液或者1% w/vSDS 溶液， 并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。 在 24小時內吸光度不會發(fā)生變 化。細胞增殖 -毒性檢測1. 在96孔板中配制100 ml的細

2、胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 24小時在37C , 5% CO2 的條件下 。2. 向培養(yǎng)板參加10 ml不同濃度的待測物質。3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當的時間例如: 6,12, 24 或48小時 。4. 向每孔參加10 ml CCK-8溶液注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數。5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育 1-4 小時。6. 用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。7. 如果暫時不測定 O.D值，打算以后測定的話， 可以向每孔中參加 10 ml 0.1 M HCI溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發(fā)生變化。注意：如

3、果待測物質有氧化性或復原性的話，可在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物 的影響。 當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基， 直接扣除培養(yǎng)基中參加藥物后的空 白吸收即可。制作標準曲線1. 先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。2. 按比例 例如： 1/2 比例 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度， 一般要做 3-5個細 胞濃度梯度，每組 3-6 個復孔。3. 接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定 O.D值，制作出 一條以細胞數量為橫坐標 X軸，O.D值為縱坐標Y軸的標準曲線。根據此標準曲線可以 測定出未知樣品的細胞數量 使

4、用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及參加 CCK-8后的培養(yǎng)時間。DOJINDO檢測步驟CCK-8檢測步驟1. 向各孔中參加100卩l(xiāng)細胞懸液。a2. 在37C下預孵育培養(yǎng)板。b3. 向各孔中參加各濃度的待測溶液 c10卩I4. 37C下孵育。5. 向各孔中參加10卩I的CCK-8溶液d。6. 37C下孵育1-4小時。e7. 測定450 nm處的OD值。a使用適當的培養(yǎng)基制備50,000-100,000個/ml的細胞懸液。b建議使用CO2培養(yǎng)箱過夜預培養(yǎng)。c使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液。d如果待測溶液有復原性，測定不含細胞，但含有 CCK-8的待測溶液在450

5、nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，那么可以直接參加CCK-8，如果吸光度相對較大，那么需要除去培養(yǎng)基， 并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后參加新的100卩I 培養(yǎng)基和10卩I CCK-8進行檢測。e白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間?；盍τ嬎慵毎盍? A加藥：=A加藥-A空白/A0加藥-A空白X 100 具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度A0加藥：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力問答:1一個孔中應接種多少個細胞?當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000個/孔1

6、00卩I培養(yǎng)基。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔100使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%參加CCK-8溶液。2能否用384孔板進行試驗？可以。向各孔中參加培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果參加的 CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后參加培養(yǎng)基體積20%的量。3能否用24孔板進行試驗?4. 酚紅會影響檢測嗎？不會。 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時， 通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去， 因此 不會對檢測造成影響。5. CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性？有。然而，請注意由于 CCK-

7、8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結果可能不同。6. CCK-8能否檢測細菌細胞？可以檢測E.coli,但不能檢測酵母細胞。 向100卩I E.co培養(yǎng)液中參加10卩I CGK溶液，并培 養(yǎng) 1-4 個小時或過夜。7. CCK-8穩(wěn)定嗎？CCK-8在 0-5C下能夠保存至少 6個月，在-20C下避光可以保存1年。如果需要長期保存， 我們推薦-20 C的儲藏條件。8. 如果沒有 450 nm 的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用 450 nm 到 490 nm 之間的濾光片。9如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后

8、加樣。10. CCK-8是什么顏色？應該是粉紅色。假設顏色不一樣，有可能會影響測定。11. CCK8能否對活細胞進行染色？不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽WST8,并通過電子載體 1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲Q也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。12. CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？CCK8溶液自身因為高濃度的 1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。 但是，加到培養(yǎng)基中的 CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數天是可以的。同一個細胞培養(yǎng)液在 CCK8檢測后還可以用

9、于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中 性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于 CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行 長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細胞在參加CCK8培養(yǎng)后的活力。13. 在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？有時會有影響。如果藥物具有復原性，會和CCK8發(fā)生顯色反響，增加吸光度。解決方法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中參加 CCK8測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基加CCK8的吸光度高，那么證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14. 每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？可能會有以下幾個原因：

10、 1. 當在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易枯燥揮發(fā)， 由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下， 最外一圈的孔只加培養(yǎng)基， 不作為測定孔用。 2.有可能會因為 CCK8沾在壁上而產生誤差，建議在參加CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在 1,000100,000 個/孔范圍內摸索條件。15. 如何設定空白對照？在不含細胞的培養(yǎng)基中參加CCK8培養(yǎng)一定的時間，測定 450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗 細胞毒性實驗 時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，參加藥物的培養(yǎng)基 中參加CCK8培養(yǎng)一定的時間，測定 450 nm的吸光度作為空白對

11、照。16. 哪些物質會影響CCK8的測定？當有復原性物質存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定 。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影 響測定，扣除空白吸收即可。17. 在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？可以縮短參加 CCK8后的培養(yǎng)時間。例如：可以把參加CCK8試劑后的培養(yǎng)時間由 2小時縮短為 1 小時。18. 設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣 品混濁所帶來的吸收。19. 說明書上僅寫了 96 孔板的測定方法，

12、如果使用 24 孔板貨 12孔板，應該加多少量 CCK-8 試劑？一般情況下建議參加 CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的 1/10。20. 在CCK-8顯色過程中，如何終止反響?有一下幾種方法96孔板：1、在顯色反響后，將培養(yǎng)板放置4C冰箱內。2、每孔加10卩I 0.1 M HCL溶液。3、每孔加10卩I 1%w/v丨的SDS十二烷基硫酸鈉溶液。注意：反 應停止后，應在 24 小時之內測定。21. 必須預培養(yǎng)細胞嗎?不一定。如果要向保持細胞的最好狀態(tài)， 建議預培養(yǎng)細胞。如果不做細胞預培養(yǎng)， 細胞內的 脫氫酶可能會不穩(wěn)定。 也有人不做細胞預培養(yǎng)， 但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。22. 如

13、果參加的藥物中含有金屬，是否會有影響?金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、 90%的顯色反響，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm 的話，將會 100%抑制。23. CCK-8試劑的保存條件？在避光條件下CCK-8試劑在4 C可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20C下保 存。但是CCK-8假設反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，假設經常使用可將試劑存放在 4 C冰箱內保存。24. 預培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細胞計數嗎？一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞， 用血球計數盤計數， 制備成一定濃度的細胞 懸液即可。如

14、果想要精密計數細胞的話，可以預培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計數盤進行計數。25. CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般參加CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經很高，但對于懸浮細胞那么可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的參加時間或增加細胞數量來解決。26. 懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區(qū)別？懸浮細胞由于染色比較困那， 一般需要增加細胞數量和延長培養(yǎng)時間。 貼壁細胞染色比較容 易，假設細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。27. 應該每次做標準曲線嗎？建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建 議每次做標準曲線。 如果試劑的批號不一樣， 靈敏度可能會有輕微的差異， 對于不同的批號 建議分別做標準曲線。28. 有時在藥物作用情況下， 細胞已經死亡， 但是脫氫酶的活性還在， 是